Способ прогнозирования развития воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 G01N33/68 C12N5/786 

Изобретение относится к медицине, а именно к гериатрии и к клинической лабораторной диагностике, может быть использовано в качестве метода прогнозирования воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями.

С помощью предлагаемого изобретения можно осуществить ранний прогноз развития воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями.

В последние годы растет ожидаемая продолжительность жизни. Возрастная структура населения претерпевает существенные изменения: сокращается доля населения молодого трудоспособного возраста, растет число людей, нуждающихся в медицинской помощи в связи с ростом возраст-ассоциированных заболеваний. Известно, что старение затрагивает все физиологические системы организма, в том числе иммунную систему.

Одним из проявлений иммуностарения является развитие хронического стерильного слабовыраженного воспаления, так называемого воспалительного старения, которое характеризуется увеличением уровней провоспалительных медиаторов (цитокинов, лейкотриенов, простагландинов) [Fulop Т, Larbi A, Pawelec G, Khalil A, Cohen АА, Hirokawa К, Witkowski JM, Franceschi С.Immunology of Aging: the Birth of Inflammaging. Clin Rev Allergy Immunol. 2023].

Однако, степень проявления такого воспаления различна: у одних людей оно сопровождает физиологическое старение, которое характеризуется благоприятным течением и формируется естественным путем по мере уменьшения эффективности функционирования органов. У других людей воспалительное старение протекает агрессивно и связано с развитием возраст-ассоциированных патологий, ведет к ранней инвалидизации и снижению качества жизни [Иммунологические аспекты старения и возраст-ассоциированная патология. Ганковская Л.В., Артемьева О.В., Намазова-Баранова Л.С., Семенков В.Ф., Свитич O.A., Греченко В.В.; Рос. нац. исслед. мед. ун-т им. Н.И. Пирогова М-ва здравоохранения Российской Федерации, Науч. - исслед. ин-т педиатрии и охраны здоровья детей Центр. Клинич. больницы Рос.акад. наук М-ва науки и высш. образования Российской Федерации. - Москва: ПедиатрЪ, 2021. - 156 с]. В связи с этим определение выраженности воспалительного старения представляет важную задачу современной медицины.

Одним из механизмов формирования воспалительного старения считается дисбаланс между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами. Интерлейкин-6 (ИЛ-6) представляет собой один из основных провоспалительных цитокинов, связанных со старением и хроническими заболеваниями. Среди противовоспалительных цитокинов важная роль в процессах старения отводится интерлейкину-10 (ИЛ-10).

Известен способ оценки прогноза развития сердечно-сосудистых и иных возраст-ассоциированных заболеваний по уровню про- и противовоспалительных цитокинов в плазме крови лиц старческого возраста [Adriaensen W, Mathei С, Vaes В, van Pottelbergh G, Wallemacq P, Degryse JM. Interleukin-6 as a first-rated serum inflammatory marker to predict mortality and hospitalization in the oldest old: A regression and CART approach in the BELFRAIL study. Exp Gerontol. 2015]. В указанной работе использован широкий ряд маркеров: ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИФН-γ, ФНО-α, VEGF, EGF, МСР-1, С-реактивный белок, преальбумин. Среди этих маркеров для прогностической оценки выбраны ИЛ-6, С-реактивный белок, ФНО-α и ИЛ-1β. Данный способ выбран нами в качестве прототипа.

Основным недостатком данного способа являются низкие концентрации цитокинов, определяемые в плазме крови, что приводит к необходимости принимать диагностическое решение по значениям, находящимся на нижних пределах детекции современных тест-систем и как следствие - низкая чувствительность метода.

Кроме того, указанный прототип предполагает оценку большого количества маркеров (ИЛ-6, С-реактивный белок, ФНО-α и ИЛ-1β, что с клинической точки зрения является избыточным и приводит к значительному повышению стоимости способа.

Нами была поставлена задача - разработать информативный, доступный способ прогноза развития воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении предлагаемого изобретения, является повышение точности прогноза развития воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями, за счет выбора оригинального сочетания маркеров и определении их концентрации в культуре мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить точность прогноза течения воспалительного старения на основании определения только двух маркеров ИЛ-6 и ИЛ-10 при одновременном уменьшении его стоимости.

Своевременное прогнозирование развития воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями, то есть «патологического старения», позволит установить контингент пациентов, требующих специальных профилактических мер для предупреждения и замедления возникновения возраст-ассоциированных заболеваний.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для прогнозирования развития воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями, из периферической крови выделяют мононуклеарные клетки (МНК), культивируют 1×10⁶ полученных клеток в 1 мл питательной среды в течение 24 часов; после чего в супернатанте культуры МНК определяют концентрацию интерлейкина-6 и интерлейкина-10. Развитие воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями, прогнозируют при концентрации интерлейкина-6 выше 300 пг/мл и интерлейкина-10 выше 10 пг/мл.

Способ осуществляют следующим образом.

Для оценки продукции ИЛ-6 и ИЛ-10 применяют методику, включающую несколько этапов: забор венозной крови путем пункции локтевой вены, выделение МНК из полученной периферической крови, культивирование клеток в течение 24 часов в СО₂-инкубаторе с последующим сбором супернатанта культуральной среды и дальнейшую постановку иммуноферментного анализа для определения концентрации ИЛ-6 и ИЛ-10, выработанных МНК исследуемого пациента.

Взятие венозной крови проводят общепринятым способом, кровь собирают и транспортируют в гепаринизированной пробирке для предотвращения свертывания. Для осуществления способа требуется не менее 2 мл крови. Все дальнейшие работы с кровью и полученными из нее клетками проводят в стерильных условиях, для обеспечения таких условий требуется оборудованное чистое помещение, включающее ламинарный шкаф не менее II класса защиты.

Для получения МНК применяется методика выделения на градиенте плотности фиколл-урографина. Методика осуществляется следующим образом: полученные 2 мл крови разводят в соотношении 1:2 питательной средой, пригодной для культивирования лимфоидных клеток, например, среда 199, RPMI-1640. Затем разведенную кровь наслаивают на буферный раствор с плотностью 1,077 г/см³ (градиент плотности) таким образом, чтобы слои буфера и крови не смешивались и имели четкую границу раздела сред. Полученную пробирку центрифугируют 20 минут при ускорении 400g. В результате наиболее плотные клетки (эритроциты и гранулоциты) оседают на дно пробирки, а фракция МНК остается на поверхности градиента плотности выше слоя буферного раствора в виде интерфазного кольца.

Интерфазное кольцо, содержащее МНК, собирают пипеткой в отдельную пробирку, а затем отмывают от буфера, образующего градиент плотности. Для этого доводят объем суспензии клеток до 5 мл питательной средой и ресуспендируют, а затем центрифугируют 10 минут при 200g. Далее сливают над осадочную жидкость, к клеточному осадку добавляют 2 мл свежей питательной среды, ресуспендируют и снова центрифугируют 10 минут при 200g. Процедуру отмывки повторяют 2 раза. После последней отмывки к клеткам добавляют 1 мл питательной среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС).

Осуществляют подсчет количества полученных МНК в 1 мл среды. Для этого подсчитывают количество ядросодержащих клеток в камере Горяева по стандартной методике, либо используют автоматические счетчики клеток.

Для осуществления описываемого способа используется 1 млн клеток. Учитывая посчитанное количество клеток на 1 мл клеточной суспензии, рассчитывают объем суспензии, содержащий 1×10⁶ клеток. Объем, содержащий 1×10⁶ клеток, отбирают и доводят до 1 мл питательной средой, содержащей 20% ЭТС. Количество культивируемых клеток должно составлять 1×10⁶ клеток на 1 мл культуральной среды. Клетки помещают в СО₂-инкубатор и культивируют 24 часа при 37°С и 3% содержании СО₂.

Через 24 часа культуру клеток центрифугируют 10 минут при 200g. После чего собирают супернатант в отдельные пробирки и хранят при -70°С, либо сразу проводят определение концентрации ИЛ-6 и ИЛ-10 методом ИФА.

Определение концентрации ИЛ-6 и ИЛ-10 осуществляют с помощью коммерческих наборов для иммуноферментного анализа (ООО «Вектор-Бест Европа», РФ) в соответствии с протоколом производителя. Для определения концентрации ИЛ-6 клеточный супернатант разводят предварительно в 5 раз для избежания превышения диапазона концентрации, допускаемого используемым набором. Определение концентрации ИЛ-10 допустимо проводить в неразведенном супернатанте.

Результат иммуноферментного анализа учитывают, определяя интенсивность сформировавшейся окраски в соответствующих лунках планшета для иммуноферментного анализа. Интенсивность окраски определяется на микропланшетном спектрофотометре (Biochrom, Anthos 2020, GB) как оптическая плотность при длине волны 450 нм и длине волны сравнения 620 нм. С учетом калибровочных образцов, входящих в комплект наборов для ИФА, по величине оптической плотности исследуемых образцов рассчитывают концентрации ИЛ-6 и ИЛ-10, измеряемую в пг/мл.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Проведено исследование цитокинов у людей старческого возраста. В таблице 1 представлены концентрации цитокинов исследуемых групп.Нами выявлено изменение концентрации цитокинов в супернатантах культур МНК.

На основании полученных данных пациенты могут быть разделены на две группы. У пациентов одной группы концентрация ИЛ-6 выше 300 пг/мл, а ИЛ-10 выше 10 пг/мл. У другой группы пациентов концентрации данных цитокинов были ниже указанных значений.

Данные в таблице представлены в виде медианы (25%-75% квартили). Условные обозначения в таблицах: * - различия между группой воспалительного старения и группой физиологического старения достоверны (* - р<0,05, ** - р<0,01) по критерию Манна-Уитни.

Затем полученные 2 подгруппы пациентов старческого возраста были клинически охарактеризованы при помощи индекса коморбидности Чарльсон, краткой батареи тестов физического функционирования (SPPB) и краткой шкалы оценки психического статуса (MMSE).

В таблице 2 представлена гериатрическая характеристика исследуемых групп, согласно индексов, определяющих уровень соматического, физического и психического состояния пациентов.

При анализе двух групп показано, что у пациентов с высокими значениями ИЛ-6 и ИЛ-10 наблюдалось несколько соматических заболеваний (индекс Чарльсон), низкий индекс физического функционирования (SPPB) и когнитивные дисфункции (индекс MMSE). У лиц старческого возраста с низкими значениями ИЛ- 6 и ИЛ-10 напротив наблюдались единичные возраст-ассоциированных заболевания, высокий индекс физического функционирования и отсутствие когнитивных нарушений.

Индекс коморбидности, представляет собой балльную систему оценки наличия определенных соматических заболеваний и используется для прогноза летальности [Charlson М. Е.,А new method of classifying prognostic comorbidity in longitudinal studies: development and validation]. При его расчете суммируются баллы, соответствующие различным сопутствующим заболеваниям, а также добавляется один балл на каждые 10 лет жизни при превышении пациентом 40-летнего возраста (т.е. 50 лет - 1 балл, 60 лет - 2 балла и т.д.)

Краткий тест физического функционирования (THE SHORT PHYSICAL PERFORMANCE BATTERY, SPPB) это тест, который включал оценку скорости ходьбы, проверку равновесия и тест с подъемом со стула. Выбор данного теста обусловлен тем, что он фокусируется на функции нижних конечностей, поскольку последние, как было показано, коррелируют с мобильностью, инвалидизацией и преждевременной смертностью [Guralnik JM, Simonsick ЕМ, Ferrucci L et al (1994) A short physical performance battery assessing lower extremity function: association with self-reported disability and prediction of mortality and nursing home admission. J Gerontol 49:M85 М94]. Максимальная сумма баллов за данный тест составляет 12 баллов. Результат ≤7 баллов является критерием диагностики синдрома старческой астении.

Краткая шкала оценки психического статуса (англ. Mini-mental State Examination, MMSE) - короткий опросник из 30 пунктов, используемый для выявления (скрининга) возможных когнитивных нарушений, в частности, деменции. Результаты теста могут трактоваться следующим образом: 28-30 баллов - нет нарушений когнитивных функций; 24-27 баллов преддементные когнитивные нарушения; 20-23 балла деменция легкой степени выраженности; 11-19 баллов деменция умеренной степени выраженности; 0 10 баллов тяжелая деменция. [Folstein MF, Folstein SE, McHugh PR. "Mini-mental state". A practical method for grading the cognitive state of patients for the clinician. J Psychiatr Res. 1975 Nov; 12(3): 189-98. doi: 10.1016/0022-3956(75)90026-6. PMID: 1202204].

Воспалительное старение, связанное с наличием возраст-ассоциированных заболеваний, характеризуется также нарушением физического и когнитивного функционирования, что приводит к ухудшению качества жизни пациентов.

Таким образом, предложенный нами способ является пригодным для клинических целей - прогнозирования выраженности воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями.

Пример 1.

Пациенту, И. 74 года было проведено исследование концентрации ИЛ-6 и ИЛ-10 в супернатанте культуры МНК методом ИФА. Были получены следующие результаты: концентрация ИЛ-6 составила 41,3 пг/мл, а ИЛ-10 5,9 пг/мл. У данного пациента на основании предлагаемого способа можно констатировать низкую вероятность развития воспалительного старения связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями.

Состояние пациента удовлетворительное, нормального телосложения. Опорно-двигательный аппарат без значимых изменений. Дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны сердца приглушены, ритмичные, шумов нет. Отеки отсутствуют. Соматический статус без значимых отклонений. Показатели комплексной гериатрической оценки: краткая батарея тестов физического функционирования (SPPB) 11 баллов, индекс MMSE 29 баллов, индекс Чарльсон 2.

При осмотре через 1 год состояние удовлетворительное, нормального телосложения. Опорно-двигательный аппарат без значимых изменений. Дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны сердца приглушены, ритмичные, шумов нет. Отеки отсутствуют. Соматический статус без значимых отклонений. Показатели комплексной гериатрической оценки: краткая батарея тестов физического функционирования (SPPB) 9 баллов, индекс MMSE 29 баллов, индекс Чарльсон -2.

Таким образом, у данного пациента наблюдается физиологический тип старения, возраст-ассоциированные заболевания на момент обследования не выявлено, сделанный на основе предлагаемого способа прогноз подтвержден.

Пример 2.

Пациент, К. 85 лет.Концентрация ИЛ-6 в супернатанте культуры МНК у данного пациента составила ИЛ-6 - 308,7 пг/мл и ИЛ-10 10,2 пг/мл. Выявлено увеличение концентрации ИЛ-6 и ИЛ-10 выше определенных нами пороговых значений. У данного пациента имеется риск формирования воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями. Рекомендуется наблюдение у врача гериатра.

При осмотре состояние удовлетворительное, нормального телосложения. Нестабильное артериальное давление, принимает гипотензивную терапию, антиагрегантную и гиполипидемическую терапию, антиконвульсанты. Тургор кожи снижен, отеков нет. В легких дыхание везикулярное, хрипов нет. АД 150/75.

Показатели комплексной гериатрической оценки: краткая батарея тестов физического функционирования (SPPB) - 9 баллов; шкала MMSE - 27 баллов; индекс Чарльсон - 2.

При осмотре через 1 год 2 месяца.

Жалобы на нестабильное артериальное давление, снижение памяти, одышку при ходьбе. Принимает гипотензивную терапию, антиагрегантную и гиполипидемическую терапию. Объективно: состояние удовлетворительное, пониженного питания. Тургор кожи снижен, отеков нет. В легких дыхание везикулярное, хрипов нет. АД 150/75. Выявлен повышенный сахар крови 7,3 ммоль/л, после осмотра участковым эндокринологом был поставлен СД 2 типа и назначена диета.

Показатели комплексной гериатрической оценки: краткая батарея тестов физического функционирования (SPPB) - 7 баллов; шкала MMSE - 25 баллов; индекс Чарльсон - 5.

Таким образом, при наблюдении в динамике у данного пациента наблюдается ухудшение физического и когнитивного состояния, имеются возраст-ассоциированные заболевания, прогноз, сделанный на основе предлагаемого способа, подтвержден.

Таким образом, данный способ достаточно информативен. Заявленное изобретение позволит решить важную практическую задачу прогнозирования степени выраженности «патологического» воспалительного старения у пациента и своевременно направить его к врачу гериатру.

Изобретение относится к медицине, а именно к гериатрии и к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования развития воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями. Из периферической крови выделяют мононуклеарные клетки (МНК) и культивируют их из расчета 1 млн МНК на 1 мл питательной среды в течение 24 часов. В супернатанте культивированных МНК методом иммуноферментного анализа определяют концентрацию интерлейкина-6 и интерлейкина-10. При концентрации интерлейкина-6 выше 300 пг/мл и интерлейкина-10 выше 10 пг/мл прогнозируют развитие воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями. Способ обеспечивает повышение точности прогноза развития воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями, за счет определения концентрации интерлейкина-6 и интерлейкина-10 в культуре МНК периферической крови. 2 табл., 2 пр.

Способ прогнозирования развития воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями, отличающийся тем, что из периферической крови выделяют мононуклеарные клетки (МНК), культивируют их из расчета 1 млн МНК на 1 мл питательной среды в течение 24 часов, после чего в супернатанте культивированных МНК методом иммуноферментного анализа определяют концентрацию интерлейкина-6 и интерлейкина-10, а развитие воспалительного старения, связанного с возраст-ассоциированными заболеваниями, прогнозируют при концентрации интерлейкина-6 выше 300 пг/мл и интерлейкина-10 выше 10 пг/мл.