Способ селективного выделения аутохтонных дрожжевых культур рода Pichia из биологических жидкостей человека и животных, секретируемых молочными железами Российский патент 2024 года по МПК C12N1/02 C12N1/16 A61K35/66 C12R1/84 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, клинической микробиологии, и может быть использовано с целью выделения аутохтонных дрожжевых культур рода Pichia и оптимизации питательных сред для селективного культивирования вышеуказанных микроорганизмов.

Уровень техники

Обеднение микробиологического профиля индигенной микробиоты кишечника, наличие дисбиотических симптомов у населения и животных, вызванных изменением качественного и количественного состава микробиоты, и, как следствие, снижение колонизационной резистентности в настоящее время признано серьезной задачей биомедицины. Видовой состав микробиоты кишечника по результатам научных исследований [1-4] уникален для каждого индивида на 2/3 и содержит бифидобактерии, лактобактерии, дрожжи, энтерококки, бактероиды, стафиллококки. Эти микроорганизмы, в том числе и относящиеся к условно-патогенным, образуют симбиотические системы с общим метаболизмом, позволяющие ассимилировать имеющиеся питательные субстраты с образованием полезных для макроорганизма веществ. При этом доминирующей флорой является бактериальная, однако с увеличением возраста фиксируется изменение микробиоты, особенно интересно повышенное содержание числа дрожжевых культур у Абхазских долгожителей и детей в возрасте до 12 лет, описанных в исследованиях Е.И. Квасникова и соавторов [5, 6]. В данных исследованиях дрожжи разных таксономических групп, включая мелкие дрожжевые грибки, выделенные из организма долгожителей Абхазии, были изучены на предмет их антагонистической активности по отношению к условно-патогенным и патогенным бактериям и на наличие киллерного фактора. Наличие киллерного фактора обнаружено у представителей пяти видов дрожжей.

Нарушение состава микробиоты в результате различных факторов ведет к возможному её переходу от нормального физиологического профиля к патологическому. С целью недопущения и коррекции подобных состояний широко используются функциональные препараты и продукты с пре, про- и синбиотическим действием. Основными источниками выделения пробиотических микроорганизмов - представителей индигенной микрофлоры - являются клинические материалы, чаще всего фекалии, реже более очищенное вагинальное содержимое.

Из уровня техники хорошо известен способ получения аутопробиотиков, содержащих живые бифидобактерии и лактобациллы - представители индигенной микрофлоры кишечника хозяина, предназначенный для восстановления нарушенной микроэкологии его кишечника (RU 213 90 70). Бифидобактерии и лактобациллы выделяют одновременно в виде естественных комплексов кишечника человека и/или животных путем деконтаминации содержимого кишечника от посторонней микрофлоры. Проводят многократные разведения исследуемого образца жидкой селективной питательной средой, пригодной для выделения и культивирования бифидобактерий и лактобацилл. Удаляют аллохтонную микрофлору путем добавления в разведенный до 10^-6 биоматериал сыворотки крови или образцов слюны того же индивидуума, у которого было взято кишечное содержимое. Культивируют в течение 48 ч при 38°С с последующим пересевом на те же питательные среды, но без добавления селективных агентов. Полученная биомасса содержит бифидобактерии и лактобациллы, являющиеся истинными представителями индигенной микрофлоры хозяина. Способ позволяет использовать в качестве аутопробиотика полученную биомассу для восстановления микрофлоры кишечника человека и ценных экземпляров животных и птиц.

Также известен способ получения аутопробиотика на основе анаэробного консорциума индигенных бактерий, который предусматривает приготовление экстракта фекалий путем их ресуспендирования в фосфатном буфере (RU 2 734 896). Отделяют надосадочную жидкость центрифугированием с последующим смешиванием надосадочной жидкости с физиологическим раствором и фильтрацией. Вносят полученный фильтрат в питательную среду, содержащую дрожжевой экстракт, натрия хлорид, глюкозы моногидрат, тиогликолевую кислоту, панкреатический гидролизат казеина, L-цистеин, агар гранулированный, желатин и дистиллированную воду в заданных количествах, в которую затем вносят суспензию фекалий в физиологическом растворе, содержащем витамин К и глюкозу, с последующим культивированием в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 3-6 суток, центрифугируют, ресуспендируют осадок в стабилизирующем растворе, содержащем 10% сахарозы и 1% желатина, с получением целевого продукта. Изобретение позволяет расширить ассортимент аутопробиотиков.

В ряде патентных документов (RU 2 178 171, RU 2 154 822, RU 2 675 315, RU 2546253, RU 2608871) отражены способы выделения бактерий рода Lactobacillus и Bifidobacterium (RU 2 373275, RU 2301828, RU 2375443, RU 2 491333) и их консорциумов (RU 2491336, RU 2 491333) из клинического материала (фекалий, вагинального содержимого) с проведением последующих операций по очистке индигенных микроорганизмов, идентификации, культивированию и получению пробиотических композиций.

Однако есть недостатки - данные способы подразумевают выделение только бактериальной составляющей индигенной микрофлоры хозяина и могут быть использованы в медицине и ветеринарии для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушениями состава и функций нормальной микрофлоры человека и животных, но не предназначены для производства функциональных пищевых продуктов или инновационных биопрепаратов для человека или животных в массовом масштабе. Кроме того, необходимо отметить сложность технологической линий для получения аутопробиотиков и трудоемкость процесса производства ввиду большого количества составляющих и длительных, трудозатратных операций по очистке индигенных микроорганизмов, также совершенно не учтены возможности использования дрожжей и дрожжеподобных грибов в качестве пре- или пробиотиков. При этом из всех известных микроорганизмов, используемых в биотехнологии, дрожжи могут быть отнесены к наиболее ценным в практическом отношении: их легче всего выращивать в условиях производства, они обладают высокой устойчивостью к посторонней микрофлоре, способны усваивать практически любые источники питания, обладают высокой скоростью роста, легко осаждаются, а использование дрожжевого белка позволяет не только экономить животные белки, но и повышать биологическую ценность готового продукта [15, 16, 17].

Таким образом одним из ключевых моментов при разработке инновационных пробиотических препаратов является целенаправленный скрининг новых дрожжевых культур, обладающих сродством к индигенной микрофлоре человека и животных из натуральных источников. При этом штаммы не должны быть генетически модифицированы и относится к микроорганизмам, патогенным для человека согласно классификации, приведенных в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08.

Одновременно в научно-исследовательской и патентной литературе достаточное количество сведений о микрофлоре грудного и коровьего молока, состоящей в большей степени из различных представителей микроорганизмов, в том числе МКБ и бифидобактерий [7, 8, 9, 12], есть сведения о наличии в микробиоме грудного и коровьего молока дрожжевых культур [10, 11, 8], и их роли в формировании аутохтонной микрофлоры и иммунной защиты ребенка или животного, потребляющего это молоко. Влияние грудного вскармливания на состав нормальной микрофлоры кишечника ребенка общеизвестно. Наиболее глубоко изучено стимулирующее действие женского молока на рост и размножение бифидобактерий, составляющих основу анаэробной микрофлоры кишечника у детей первых месяцев жизни. Также в работе [13] представитель вида Lactobacillusfermentum охарактеризован как высокоценный пробиотический штамм, выделенный из женского грудного молока, и используется в настоящее время в коммерческих целях для приготовления молочных смесей для детей. В работах [10, 11] отмечено увеличение у детей соотношения между бактериальной и дрожжевой флорой в сторону нарастания последней, чем у взрослых представителей Абхазии, что может говорить о влиянии дрожжевой флоры молока на формирования микробиома детей. Необходимо отметить, что по сравнению с клиническими образцами фецес и вагинального содержимого, выделение пробиотических микроорганизмов из биологического материала, секретируемого молочными железами, намного проще, поскольку в молоке и молозиве отсутствует превалирующее количество условно-патогенной и патогенной микрофлоры. Таким образом биологические жидкости, секретируемые молочными железами, могут рассматриваться как перспективный источник пробиотических микроорганизмов.

При конструировании и назначении средств коррекции микрофлоры необходимо учитывать биоразнообразие видового состава индигенной микрофлоры. И если представители родов Lactobacillus и Bifidobacterium, описанные выше, широко представлены на рынке пробиотиков: известны промышленные штаммы лакто- и бифидобактерий, обладающие способностью влиять на физиологические и иммунобиологические процессы в организме, которые используются для приготовления лекарственных препаратов и продуктов питания (препараты, «Линекс», «Бифиформ», «Бифидумбактерин», «Наринэ», «Ацидофилин», патент Евросоюза EP2990045B1; патент США US 10716817 B2, патент США US 20160129055 A1, патент РФ 2176668 от 01.04.2001 г.; патент РФ 2524117 от 07.08.2013 г. и так далее), - то дрожжевые пробиотические культуры, выделенные из нормальной микрофлоры организма-хозяина, в уровне техники представлены только в патенте RU 2771136. При этом способ селективного выделения аутохтонных дрожжевых культур в уровне технике не описан. Также необходимо отметить, что использование биологического и биосинтетического потенциала лишь одного штамма дрожжей, всегда несет в себе элемент опасности сбоя производства из-за случайной утраты, вырождения этого штамма. Хорошей гарантией от такой случайности является разработка методики пополнения коллекции дрожжевых культур с заданными свойствами.

Известны способы производства белковых препаратов на основе нетрадиционного сырья и дрожжей для животных, предусматривающий как этап изобретения выделение дрожжей и дрожжеподобных грибов - продуцентов из животноводческих стоков (патент RU 2100435) и из комплексных микробных заквасок, используемых в традиционных для ряда стран процессах протеинизации растительного сырья [14]. Серьезными недостатками этих способов является то, что авторами не предусмотрено использование дрожжей, выделенных непосредственно из микробиоценозов желудочно-кишечного тракта человека и животных, то есть действующие штаммы не являются эубиотиками, проходят через пищеварительный тракт без колонизации и полностью выводятся через несколько дней после приема. Кроме того, источником выделения дрожжевых культур служат животноводческие стоки и комплексные микробные закваски, то есть процесс выделения моноштамма предполагает трудоемкий, дорогой процесс ввиду большого количества составляющих и длительных, трудозатратныхопераций по очистке дрожжевых микроорганизмов и последующей целенаправленной селекции определенного вида микроорганизма с соответствующими функциональными свойствами.

Таким образом ни данный способ, ни приведенные ранее аналоги, несмотря на некую схожесть ряда существенных признаков, не реализуют подобное назначение и не могут быть выбраны в качестве ближайшего аналога.

Известные из уровня техники способы выделения индигенных культур в превалирующем большинстве случаев либо не подразумевают выделение дрожжевых культур, либо адаптированы для них, но источником выделения не является нормальная микрофлора организма-хозяина, что делает невозможным селекцию по такому способу эубиотического штамма для последующего использования при изготовлении про-, син- и аутопробиотических препаратов для человека и животных. Данные о наличии селективных способов выделения аутохтонных дрожжевых культур в уровне технике не найдены. В связи с этим является актуальной разработка соответствующего способа.

Сущность изобретения

Цель изобретения - разработка способа селективного выделения аутохтонных дрожжевых культур рода Pichia из биологических жидкостей человека и животных, секретируемых молочными железами, для последующего включения новых штаммов дрожжевых культур, полученных предлагаемым способом, в производство. Это расширит арсенал и повысит эффективность разрабатываемых пробиотических средств коррекции микроэкологических нарушений в различных биотопах и позволит проводить данные мероприятия более рационально.

Цель и технический результат достигается путем разработки способа селективного выделения аутохтонных дрожжевых культур рода Pichia из биологических жидкостей человека и животных, секретируемых молочными железами, включающего в себя 2 стадии:

• выделение дрожжевых культур из женского грудного молока и коровьего молока на разных стадиях его формирования, как в молозиве, так и стационарном молоке, путем высева образца молока в объеме 10% от объема субстрата на стерильные твердофазные накопительные среды различного состава на основе пшеничных или овсяных отрубей с добавлением моркови в количестве 10% и без нее и с добавлением антибиотика группы аминогликозидов широкого спектра действия «Гентамицин» (концентрация 40 мг/мл) в количестве 0,1%, измельченные до размера частиц 5мм, увлажненные до 50% стерильной водой и охлажденные до комнатной температуры, и последующей ферментации при температуре 30°С с доступом воздуха в течение 48 ч;

• рассев из мест видимого роста, характерного по культуральным признакам для дрожжей, на разделительные (селективные) агаризованные среды Сабуро или 2% морковный агар, приготовленный используя гидромодуль 1:2, или 4% сывороточный агар, или 2% отрубевый агар, приготовленный используя гидромодуль 1:10, дополнительно содержащие 0,1% раствора гентамицина (концентрация 40 мг/мл) с целью выделения чистых культур дрожжей, с последующим термостатированием при 30°С в течение 72 ч до появления гладких белых колоний на поверхности среды. Технический результат подтверждается проведенными исследованиями.

Вышеописанным методом из источников коровьего молока и женского грудного молока всего было выделено более 140 штаммов дрожжевых культур рода Pichia.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Осуществление изобретения

Пример 1. Скрининг дрожжевых культур из женского грудного молока и коровьего молока на разных стадиях его формирования - в молозиве и стационарном молоке

Скрининг вели твердофазным методом с использованием богатого субстрата - пшеничных отрубей. Существуют выраженные видовые различия в форме колоний, типе, характере роста дрожжей, использовании соответствующего пути метаболизма при их выращивании на плотной и жидкой питательной среде. Культуральные особенности дрожжей также зависят не только от температуры, рН и состава питательной среды, но и от условий аэрирования - аэробный или анаэробный вариант. Культуральные и морфологические признаки дрожжей рода Pichia позвляют выбрать аэробный вариант культивирования на твердофазных субстратах.

Состав питательной среды: отруби пшеничные, увлажненные стерильной водой до уровня влажности 50%. Субстрат измельчали в бытовой кофемолке Bosch до размера частиц 5 мм, затем переносили в чашки Петри в количестве 5 г на чашку, автоклавировали при избыточном давлении 1,0 атм. в течении 40 мин, охлаждали до комнатной температуры и засевали: образцом натурального молока в объеме 10% от объема субстрата. Засев проводили равномерно по всей площади субстрата, активно перемешивали. Ферментацию проводили в растительной камере при температуре 30°С в чашках Петри твердофазным способом с доступом воздуха в течение 48 ч, влажность - 50%.

Поскольку бактериальная флора обнаруживается в молоке в подавляющем количестве, но условия культивирования неблагоприятны для ее роста и развития (аэробное твердофазное культивирование при температуре 30°С), культивирование вели с добавлением антибиотика группы аминогликозидов широкого спектра действия «Гентамицин» (концентрация 40 мг/мл) в концентрации 0,1% и без него. На фиг. 1 представлены экспериментальные данные по выделению дрожжевых культур из женского грудного и коровьего молока в зависимости от стадии его формирования. Идентификацию дрожжей проводили классическими методами по культуральным, биохимическим и морфологическим признакам.

При исследовании женского молозива дрожжевые культуры выделялись на питательных средах с использованием антибиотика гентамицина в 9,5% проб, на питательной среде без гентамицина - в 4,8% проб. При исследовании коровьего молозива на питательных средах без гентамицина дрожжевые культуры не были выделены, на средах с гентамицином - в 6% проб. Это связано с тем, что молозиво представляет собой сложную биологическую жидкость, более богатую антимикробными пептидами, иммунорегулирующими соединениями и факторами роста, чем последующее зрелое молоко. Основные функции молозива - обеспечение необходимыми питательными компонентами, укрепление естественной защитной системы, модуляция иммунного ответа, баланс кишечной микробиоты и усиление роста и восстановления некоторых тканей. В связи с богатым сложносочиненным составом молозиво является отличной средой для роста и развития представителей МКБ и, скорее всего, рост дрожжей подавляется, так как они просто не способны конкурировать в данном случае за питательные вещества. Тем не менее дрожжевые культуры при добавлении «Гентамицина» выделялись в минимальном количестве проб, что подтверждает заявленный технический результат.

В случае использования в качестве источника выделения дрожжевых культур женского грудного стационарного молока и натурального коровьего молока ситуация имеет иной характер: для женского грудного молока на питательной среде с гентамицином - 75,7% проб, на питательной среде без гентамицина - 33,3% проб, для коровьего молока как на питательной среде с гентамицином, так и без него достигнута почти 100% эффективность, выделение происходило в 96,7% проб и в 90,3% проб соответственно, то есть дрожжевые культуры выделялись почти из каждой пробы молока.

Пример 2. Влияние состава накопительной твердофазной питательной среды на эффективность выделения дрожжевых культур

Дрожжевые культуры рода Pichia, как правило, хорошо растут на различных целлюлозосодержащих субстратах. Однако для увеличения процента выделения возможно использовать накопительные среды различного состава, в том числе с добавлением углеводистых и сахаристых добавок. В качестве перспективного компонента твердофазных накопительных сред может быть рассмотрена морковь ввиду высокого содержания влаги, наличия дополнительных свободных сахаров и относительно дешевой цены и доступности. Для проведения скрининга были отобраны 16 образцов коровьего молока свежего удоя. В качестве сред для накопления дрожжевой биомассы использовали твердофазные среды различного состава на основе пшеничных или овсяных отрубей с добавлением моркови в количестве 10% и без нее. Пшеничные и овсяные отруби были использованы с целью продемонстрировать влияние растворимого и нерастворимого вида клетчатки на рост дрожжевых культур. Также, как описано выше, во все среды добавляли «Гентамицин». Влажность сред поддерживали на уровне 50%. Данные представлены на фиг 2. Результаты видимого роста микроорганизмов с культуральными признаками дрожжей рода Pichia были отмечены при выделении из 7-ми проб молока. Фиксировали рост микроорганизмов с культуральными признаками дрожжей в 14 образцах с питательной средой на основе отрубей и моркови и в 6 образцах только с отрубями. Идентификацию дрожжей проводили классическими методами по культуральным, биохимическим и морфологическим признакам. При этом накопительные питательные среды с добавлением протертой моркови наиболее подходят для выделения дрожжевых культур: эффективность выделения дрожжевых культур в 2,3 раза больше, поскольку имеют в своем составе больше необходимых для биосинтетической активности питательных веществ, чем среды без данного углеводсодержащего субстрата.

Корреляция вида клетчатки (растворимая или нерастворимая) с эффективностью выделения дрожжевых культур не установлена: экспериментальные значения сопоставимы. Таким образом возможно использовать накопительную среду на основе пшеничных или овсяных отрубей с добавлением моркови и без нее.

Пример 3. Разработка состава селективной среды для целенаправленного выделения дрожжевых культур рода Pichia

Стандартной питательной средой для выращивания дрожжевых культур признана среда Сабуро. Однако стандартизованные среды с определенным химическим составом не обеспечивают рост только дрожжевых культур и не достигают желаемой плотности клеток и достаточно высокой скорости роста. Рассев на разделительные (селективные) среды производился с целью выделения чистых культур дрожжей. В качестве селективных сред использовали:

• среда Сабуро является стандартной и была взята в качестве эталона;

• с целью увеличения экономической эффективности технологического процесса также в качестве селективной среды были рассмотрены 2% морковный агар, приготовленный с использованием гидромодуля 1:2, или 4% сывороточный агар, или 2% отрубевый агар, приготовленный с использованием гидромодуля 1:10;

• указанные выше селективные среды, дополнительно содержали 0,1% раствора «Гентамицина» (концентрация 40 мг/мл), производства ОАО «Дальхимфарм».

Образцы термостатировали при 30°С в течение 3-х суток до появления гладких белых колоний на поверхности среды. Идентификацию дрожжей проводили классическими методами по культуральным, биохимическим и морфологическим признакам. Необходимо отметить, что антибиотик гентамицин высокоактивен в отношении грамположительных и грамотрицательных аэробных бактерий, то есть не действует на представителей облигатной микрофлоры, которые, как правило, используют анаэробный способ получения энергии. Зависимость интенсивности выделения дрожжевых культур из образцов натурального молока, предварительно проферментированного на накопительной среде, от использования антибиотика гентамицина представлена на фиг. 3. Доказано, что нативная бактериальная флора молока подавляется технологическими условиями разработанного способа селективного выделения аутохтонных дрожжевых культур рода Pichia из биологических жидкостей человека и животных, секретируемых молочными железами.

Пример 4. Выделение высокопродуктивных дрожжевых культур рода Pichia из образцов коровьего и женского грудного молока

Культуры дрожжей выделяли из образцов коровьего молока здоровых животных, в том числе фермерского хозяйства КФХ «Свободный труд», экофермы «СытникЪ», фермы «Корневых» и других, и женского стационарного грудного молока. Натуральное молоко хранили при температуре 2-4°С не более 48 ч или согласно срока годности на упаковке. Пробы натурального молока в асептических условиях высевали на накопительную твердофазную среду как описано выше в примере 1, состав: отруби пшеничные с добавлением 10% протертой моркови, темостатировали при температуре 30°С 48 ч, далее из мест видимого роста, характерного по культуральным признакам для дрожжей, проводили отбор пробы петлей и методом истощающего штриха высевали на селективную агаризованную среду с добавлением антибиотика «Гентамицина».

По вышеописанному способу было протестировано 89 проб коровьего молока, 33 пробы женского грудного молока, 42 пробы женского молозива и 16 проб коровьего молозива, выделено более 140 штаммов дрожжевых культур. Из них 33 штамма прошли отбор по показателю интенсивности роста на твердофазных субстратах с целью дальнейшего использования в комбикормовой и пищевой промышленности и получения инновационных пробиотических биопрепаратов (фиг. 4), 7 штаммов показали хорошие результаты от 1,8×10⁹ клеток /г до 5,1×10⁹ клеток/г и помещены в коллекцию ООО «Микробные нутриенты иммунокорректоры». Наиболее высокие результаты показали 5 штаммов дрожжевых культур, выделенных из коровьего молока: 06-2016 - 5,1×10⁹ клеток/г, 0514-2016 - 3,8×10⁹ клеток/г, 094-2020 - 3,7×10⁹ клеток/г, 064-2017 и 065-2017 - 3,6×10⁹ клеток/г, – и 2 штамма дрожжевых культур, выделенных из женского грудного молока: 05-2016 - 4,8×10⁹ клеток/г, 053-2018 - 3,3×10⁹ клеток/г.

Чистая культура отобранных штаммов была перенесена в пробирки на скошенный агар Сабуро для дальнейшего хранения. На фиг. 5 представлены выделенные штаммы дрожжевых культур. Проведена их идентификация по культуральным и морфологическим признакам. Колонии круглые, крупные, непрозрачные, матовые, с ровной поверхностью, кремового цвета, однородные с ровным краем, объемные. Необходимо отметить, что все выделенные штаммы имеют достаточно маленький размер клеток - (1,0÷4,0)×(3,0÷6,0) мкм. На фиг. 6 представлено изображение образца 06-2016 под микроскопом в камере Горяева с 400 кратным увеличением, остальные выделенные дрожжевые культуры выглядят аналогично.

Данные по идентификации выделенных культур позволяют отнести их к роду Pichia spp., предположительно Pichia guilliermondii. Наиболее продуктивные штаммы 06-2016 и 05-2016 идентифицированы методом ПЦР, отнесены к виду Pichia guilliermondii и депонированы в Национальном биоресурсном центре «Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов» НИЦ «Курчатовский Институт» под номерами Y-4316 и Y-4304.

Список источников

1. Богданова Н.М., Булатова Е.М., Васия М.Н. Современный взгляд на микробиоценоз, иммунный ответ и факторы, влияющие на их формирование. Фундаментальные и прикладные аспекты. Вопросы современной педиатрии. 2013. №12 (4). С. 18-25.

2. Zommiti M., Chikindas M.L., Ferchichi M. Probiotics-Live Biotherapeutics: a Story of Success, Limitations, and Future Prospects-Not Only for Humans. Probiotics Antimicrobial Proteins, 2020 Sep, 12(3):1266-1289, doi:10.1007/s12602-019-09570-5.

3. Abraham B. P., Quigley E. M. Probiotics in Inflammatory. Bowel Disease, Gastroenterology clinics of North America, 2017 Dec, 46(4):769-782, doi:10.1016/j.gtc.2017.08.003.

4. Hayes M, Ross RP, Fitzgerald GF, Stanton C. Putting microbes to work: dairy fermentation, cell factories and bioactive peptides. Part I: overview. Biotechnol J. 2007 Apr;2(4):426-34. doi: 10.1002/biot.200600246.

5. Квасников Е.И., Нагорная С.С., Коваленко Н.К., Шишлевская Т.Н. Дрожжевая флора кишечного тракта у долгожителей Абхазии. Микробиологический журнал. 1985.47(4):22-6.

6. Квасников Е.И., Нагорная С.С., Жарова В.П., Калюжная Н.Д. Феномен антагонизма у дрожжей-киллеров Saccharomycescerevisiae, выделенных из кишечника долгожителей Абхазии. Микробиологический журнал. 1985. 47(6):9-11.

7. Schwab C, Voney E, Ramirez Garcia A, Vischer M, Lacroix C. Characterization of the Cultivable Microbiota in Fresh and Stored Mature Human Breast Milk. Front Microbiol. 2019 Nov 20;10:2666. doi: 10.3389/fmicb.2019.02666.

8. Ding M, Qi C, Yang Z, Jiang S, Bi Y, Lai J, Sun J. Geographical location specific composition of cultured microbiota and Lactobacillus occurrence in human breast milk in China. Food Funct. 2019 Feb 20;10(2):554-564. doi: 10.1039/c8fo02182a.

9. Chow BD, Reardon JR, Perry EO, Laforce-Nesbitt SS, Tucker R, Bliss JM.J. Expressed Breast Milk as a Predictor of Neonatal Yeast Colonization in an Intensive Care Setting. Pediatric Infect Dis Soc. 2014 Sep;3(3):213-20. doi: 10.1093/jpids/pit090.

10. Борисенко Е.Г. Разработка комплексной технологии белковых препаратов на основе нетрадиционного сырья и дрожжей: дисс. док. тех. наук. - М., 1990. - 471с.

11. Каночкина М.С. Разработка технологии активных полимикробных посевных материалов для производства дрожже-бактериальных функциональных продуктов. Диссертация на соискание степени к.т.н., 2012, 232 стр.

12. Васильева Л.И., Брагина Л.Е. Бактериологическая характеристика грудного молока здоровых женщин в первые 7 суток после родов. Рук. - Деп. В ВИНИТИ, 1989. - 14 с. (№6660-в89).

13. Jiménez E., Langa S., Martín V., Arroyo R., Martín R., Fernández L., Rodríguez J.M. Complete genome sequence of Lactobacillus fermentum. Journal of Bacteriology, September 2010. - Vol. 192. - No. 18. - P. 4800.

14. Борисенко Е.Г. Разработка комплексной технологии белковых препаратов на основе нетрадиционного сырья и дрожжей. Автореф. дис. докт. техн. Наук. - Москва, 1990, 51с.

15. Патент РФ 2102903. Способ производства лечебно-профилактической добавки. Борисенко Е.Г. 27.01.1998.

16. Mazzucco MB, Ganga MA, Sangorrín MP. Production of a novelkillertoxinfrom Saccharomyces eubayanus using agro-industrial waste and its'application against wine spoilage yeasts.Antonie Van Leeuwenhoek. 2019 Jul;112(7):965-973. doi: 10.1007/s10482-019-01231-5.

17. Патент РФ 2502795. Способ получения сухого полимикробного продукта для использования в пищевой промышленности. Борисенко Е.Г., Каночкина М.С. 2012.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен двухстадийный способ селективного выделения аутохтонных дрожжевых культур рода Pichia из биологических жидкостей человека и животных, секретируемых молочными железами, включающий высев 10% от объема субстрата образца женского грудного и коровьего молока на стерильные твердофазные накопительные среды на основе пшеничных или овсяных отрубей, измельченные до 5 мм, увлажненные до 50% стерильной водой и охлажденные до комнатной температуры, с добавлением 10% моркови или без нее с добавлением 0,1% гентамицина в концентрации 40 мг/мл, с последующей ферментацией 48 ч при 30°С с доступом воздуха; рассев из мест видимого роста, характерного по культуральным признакам для дрожжей, на разделительную селективную агаризованную среду: 2% морковный агар с гидромодулем 1:2, или 4% сывороточный агар, или 2% отрубевый агар с гидромодулем 1:10, содержащую 0,1% раствор гентамицина в концентрации 40 мг/мл, с термостатированием 72 ч при 30°С. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов селективного выделения аутохтонных дрожжевых культур рода Pichia из биологических жидкостей человека и животных для включения дрожжевых культур в производство пробиотических средств. 6 ил., 4 пр.

Способ двухстадийного селективного выделения аутохтонных дрожжевых культур рода Pichia из биологических жидкостей человека и животных, секретируемых молочными железами, включающий в себя выделение дрожжевых культур из женского грудного молока и коровьего молока на разных стадиях его формирования, как в молозиве, так и стационарном молоке, путем высева образца молока в объеме 10% от объема субстрата на стерильные твердофазные накопительные среды на основе пшеничных или овсяных отрубей с добавлением моркови в количестве 10% или без нее и с добавлением антибиотика группы аминогликозидов широкого спектра действия гентамицина в концентрации 40 мг/мл в количестве 0,1%, измельченные до размера частиц 5 мм, увлажненные до 50% стерильной водой и охлажденные до комнатной температуры, и последующей ферментации при температуре 30°С с доступом воздуха в течение 48 ч, и рассев из мест видимого роста, характерного по культуральным признакам для дрожжей, на разделительную селективную агаризованную среду: 2% морковный агар, приготовленный с использованием гидромодуля 1:2, или 4% сывороточный агар, или 2% отрубевый агар, приготовленный с использованием гидромодуля 1:10, дополнительно содержащую 0,1% раствор гентамицина в концентрации 40 мг/мл, с последующим термостатированием при 30°С в течение 72 ч.