Синбиотическое средство на основе жизнеспособной биомассы штамма дрожжей Meyerozyma (Pichia) guilliermondii ВКПМ Y-4316 Российский патент 2023 года по МПК A61K35/66 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, области питания и здоровья человека и/или животного. Может быть использовано в производстве синбиотических препаратов на основе дрожжей Meyerozyma (Pichia) guilliermondii ВКПМ Y-4316 и имеет широкую сферу применения в пищевой, комбикормовой промышленности, фармацевтике и ветеринарии.

Уровень техники

Обеднение микробиологического профиля индигенной микробиоты кишечника, наличие дисбиотических симптомов у населения, вызванных изменением качественного и количественного состава микробиоты, и, как следствие, снижение колонизационной резистентности в настоящее время признано серьезной задачей биомедицины. Видовой состав микробиоты кишечника по результатам научных исследований [1-4] уникален для каждого индивида на 2/3 и содержит бифидобактерии, лактобактерии, дрожжи, энтерококки, бактероиды, стафиллококки. Эти микроорганизмы, в том числе и относящиеся к условно-патогенным, образуют симбиотические системы с общим метаболизмом, позволяющие ассимилировать имеющиеся питательные субстраты с образованием полезных для макроорганизма веществ. Нарушение состава микробиоты в результате различных факторов ведет к возможному её переходу от нормального физиологического профиля к патологическому. С целью недопущения и коррекции подобных состояний широко используются функциональные препараты и продукты с пре, про- и синбиотическим действием.

Пробиотики - это живые микроорганизмы, которые приносят пользу здоровью организма хозяина при введении в адекватных количествах. К основным функциям пробиотиков относятся: поддержка колонизационной резистентности, метаболизм пищевых субстратов и утилизация конечных метаболитов, продукция субстратов, необходимых для макроорганизма, а также регуляция местного и адаптивного иммунного ответа [5]. В случае добавления в целевой биопрепарат пребиотических составляющих, таких как фруктоолигосахариды и галактоолигосахариды [6, 11, 15], пищевая клетчатка, которые приводят к специфическим изменениям в составе и/или активности желудочно-кишечной микробиоты, принося таким образом пользу здоровью организма хозяина, можно говорить о синбиотическом действии препаратов [7].

В литературе описано множество микроорганизмов для полезного применения у человека в пищеварительном тракте и в целях питания. Известны промышленные штаммы лакто- и бифидобактерий, обладающие способностью влиять на физиологические и иммунобиологические процессы в организме, которые используются для приготовления лекарственных препаратов и продуктов питания (препараты, «Линекс», «Бифиформ», «Бифидумбактерин», «Наринэ», «Ацидофилин», патент Евросоюза EP2990045B1; патент США US10716817B2, патент США US20160129055A1, патент РФ 2176668 от 01.04.2001 г.; патент РФ 2524117 от 07.08.2013 г. и так далее).

Известны композиции для обеспечения колонизационной резистентности микробиоценоза кишечника человека и способы их получения [9, 10]. Композиции состоят из комбинации метаболитов пробиотического штамма Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 или дополнительно включают стерилизованные высушенные культуральные жидкости, содержащие метаболиты Enterococcus faecium L-3, Lactobacillus delbrueckii TS1-06 и Lactobacillus fermentum TS3-06. В качестве пребиотической составляющей используют овсяные хлопья или комплекс полисахаридов (β-глюкан и маннан). Также в состав входят цеолит, стеарат кальция или аэросил. Их использование позволяет нормализовать микробиоценоз кишечника за счет селективного стимулирования роста и размножения лактобацилл и бифидобактерий индигенной составляющей нормофлоры биотопа и обеспечения специфической антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Недостатками заявленных композиций являются ограниченная биологическая активность, выражающаяся в недостаточных уровнях специфической антагонистической активности в отношении ряда патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, что связано с использованием в его составе только инактивированных микроорганизмов, то есть отсутствием пробиотического действия, невозможность получения быстрого лечебного эффекта, поскольку при стимулировании индигенной микрофлоры ее нарастание происходит не сразу и требует длительного времени приёма композиций, отсутствие детоксикационной активности. Также следует отметить необходимость сложной технологической линий для получения композиций и трудоемкость процесса производства ввиду большого количества составляющих.

Также было замечено, что достаточно многие микроорганизмы, в частности молочнокслые бактерии, обладают провоспалительным действием. Такой провоспалительный эффект может оказаться особенно вредным и нежелательным, например, в случае аутоиммунных заболеваний или иммуннодефицита.

Большой потенциал при создании подобных функциональных продуктов может быть реализован при использовании дрожжей. Клеточные стенки дрожжей содержат маннаноолигосахариды (МОС) - пребиотические вещества, неперевариваемые в верхних отделах кишечника и ферментируемые индигенной микрофлорой в толстой кишке с образованием короткоцепочечных жирных кислот, что способствует пролиферации и дифференцировке эпителиальных клеток кишечника. Проведенная в Китае серия биомедицинских исследований [8] механизмов, лежащих в основе положительного влияния МОС на моделирование здоровья кишечника на поросятах, показала, что введение МОС в рацион снижает количественное содержание протеобактерий в кишечнике, способствует росту полезных микроорганизмов, таких как виды Bifidobacterium и Lactobacillus, адсорбирует и выводит из организма животных микотоксины. Указанные модельные животные имеют большое сходство с людьми в анатомии (моногастричные животные), генетике, физиологии и используются для предварительной оценки действия биопрепаратов на человека. При этом целесообразно использовать всю биомассу дрожжей, без стадии отделения клеточных стенок, содержащих МОС, ввиду содержания в ней высокоценного белка и витаминов.

В качестве широко распространенного пробиотика на основе дрожжей известен препарат «Энтерол», доказавший свою эффективность, иммуномодулирующее действие и включенный в рекомендации международных врачебных ассоциаций, используется штамм Saccharomyces cerevisiae var.boulardii. Клинические исследования [12] показали, что препарат позволяет вывести возбудителей диареи из организма, способствует восстановлению пищеварительной функции кишечника, помогает обезвредить токсины, повреждающие кишечник.

Также известно средство, получаемое по патенту РФ 2 490 324 от 20.08. 2013 г. [16], которое относится к штаммам дрожжей Saccharomyces cerevisiae CNCM I-3856 и Saccharomyces cerevisiae var. boulardii CNCM I-3799, используемых в качестве пробиотика, пригодного при производстве пищевых или фармацевтических композиций. Предложена также композиция, содержащая штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae CNCM I-3856 и/или Saccharomyces cerevisiae var. boulardii CNCM 1-3799 и/или по меньшей мере один из париентальных маннопротеинов (МОС) EL 05 и EL 06 штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae CNCM I-3856. Изобретение способствует уменьшению боли в кишечнике, индуцированию противовоспалительного действия при отсутствии провоспалительного действия, затруднению и уменьшению адгезии и заселения желудочно-кишечного тракта бактериями, являющимися патогенными и/или имеющими инвазивный характер.

Основным недостатком этих препаратов и композиций является то, что действующий штамм не является эубиотиком, проходит через пищеварительный тракт без колонизации и полностью выводится через 5 дней после приема. Кроме того, препараты не содержат пребиотической составляющей, что снижает эффективность воздействия на аутофлору конкретного индивида.

В жизнеспособном состоянии дрожжи также входят в состав разнообразных продуктов, в том числе молочнокислых: тан, айран, кумыс, квас, кефир. Однако в подобных продуктах количество колониеобразующих единиц дрожжей находится на низком уровне 10⁴-10⁵ КОЕ в см³, что не позволяет демонстрировать лечебно-профилактические свойства биопрепаратов и продуктов.

Кроме того, в условиях быстро меняющейся эпидемиологической обстановки остро стоит вопрос и о детоксикации организма, поддержке, стимуляции иммунитета.

Известны препараты [13,14], обладающие иммуномодулирующей, энтеросорбционной, антитоксической и противовоспалительной активностью, содержащий стерильные отруби и выращенные на них микробные клетки штамма дрожжей Saccharamyces cerevisae (vini) ВКМП Y-511 в количестве 10⁹÷10¹⁰ микробных тел на 1 г отрубей, в последствие инактивированные, и способ его получения. Способ отличается тем, что при ферментации твердофазный субстрат увлажняют водой без привкуса и запаха, с мутностью менее 0,1, рН 8,7, не содержащей хлора, и окисляемостью перманганата не более 1,6 мг/дм³, жесткостью 1,5 мг/дм³, общей минерализацией не более 384 мг/дм³, а тепловую обработку при культивировании ведут путем равномерного прогрева среды.

Недостатками данных препаратов является их ограниченная биологическая активность, поскольку они не содержат живых пробиотических микроорганизмов, способных колонизировать микрофлору кишечника при дисбиозах, отсутствие доказательств лактогенного, бифидогенного эффекта и детоксикационного эффекта на широко распространенные стафилоккоковые энтеротоксины. Также очевидна высокая энергозатратность операций по подготовке увлажняющего компонента.

Наиболее близкими прототипом к предлагаемому нами синбиотическому средству по технической сущности и достигаемому результату является патент РФ 2 771 136 от 26.04.2022 г. (пункт 5 формулы), в котором получено средство (базовая субстанция «Миникор») с содержанием убитых дрожжевых культур не менее 10⁹÷10¹⁰ микробных тел на единицу субстрата, обладающее лактогенным и бифидогенным эффектом, детоксикационным действием в отношении стафилококковых энтеротоксинов, пребиотическим действием и высокой биологической ценностью.

Недостатком указанного изобретения является ограниченная биологическая активность, поскольку биопрепарат не содержит живых пробиотических микроорганизмов, способных колонизировать микрофлору кишечника при дисбиозах и имеющих антагонистическое действие на условно-патогенные бактерии, то есть обладает только пребиотическим действием и оказывает нутритивную поддержку организму.

Сущность изобретения

Цель изобретения - создание нового синбиотического средства комплексного действия, а также расширение арсенала эффективных препаратов/продуктов для нормализации микрофлоры ЖКТ человека и животных и/или сорбции токсинов.

Цель и технический результат достигается путем получения синбиотического средства на основе жизнеспособной биомассы штамма Meyerozyma (Pichia) guilliermondii ВКПМ Y-4316 следующего состава на 100 г: белок - не менее 18 г, жиры - не менее 0,5 г, углеводы - не менее 55 г, влажность - не более 15%, - отличающееся тем, что содержит не менее 10⁹ КОЕ вышеуказанных дрожжей на г субстрата, пребиотическую составляющую: растворимые и нерастворимые пищевые волокна - не менее 60% по массовой доле, витамин В1 (тиамин) - 0,1 мг /100г, витамин В2 (рибофлавин) - 0,8 мг/100 г, и обладающего адсорбционной активностью не менее 65 мг/г. Технический результат подтверждается проведенными исследованиями.

Синбиотическое средство способно стимулировать рост индигенных микроорганизмов родов Bifidobacterium и Lactobacillus, а также обладает детоксикационными, антагонистическими свойствами на представителей родов Escherichia, Enterobacter, Klebsiella и высокой биологической ценностью.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Осуществление изобретения

Пример 1. Получение синбиотического средства для человека и животных заявленного состава

Синбиотическое средство получают методом твердофазного культивирования штамма Meyerozyma (Pichia) guilliermondii ВКПМ Y-4316 на пшеничных отрубях в тонком слое высотой 1÷3 см при увлажнении субстрата водой до 60% и последующей естественной сушки полученного средства при температуре 35÷40°С.

Для этого пшеничные отруби стерилизовали в автоклаве 30 мин при 120°С, охлаждали до комнатной температуры, увлажняли до 60% жидким посевным материалом (Y-4316) на основе предварительно простерилизованной воды. Посевная доза - 10⁷÷10⁸ КОЕ/г субстрата. Засеянные пшеничные отруби культивировали 48 часов при температуре 30±2°С.

При твердофазной ферментации необходимо учитывать степень дисперсности, пористость, насыпной вес и т.п. При этом показатели эффективности роста и метаболизма микробных культур могут заметно меняться. Для того чтобы показать приемлемый для ферментации параметр высоты слоя, получали биопрепарат с оптимальным по влажности вариантом (60%), и культивировали в диапазоне высоты слоя от 1 см до 6 см в стеклянных кюветах. Далее определяли количество жизнеспособных клеток дрожжей после ферментации методом предельных разведений и в соответствии с ГОСТ 10444.12-88. Результаты исследований представлены на фиг. 1.

Максимум продуктивности приходится на вариант с высотой слоя субстрата 3 см и достигает 4,6×10⁹ КОЕ/г. Однако стоит отметить, что при высоте слоя 1 и 2 см также достигается высокий прирост биомассы. При этом при доступе воздуха в слой культуры с двух сторон можно довести толщину слоя и до 6 см.

Необходимо отметить, что уровень доступа кислорода у аэробных микроорганизмов может существенно влиять на метаболические пути получения ценных продуктов, таких как аминокислоты, витамины группы В, а также на использование жиров и углеводов в составе субстрата. В этой связи получение синбиотического средства преимущественно ведут в тонком слое высотой 3 см, а данные исследований по продуктам метаболизма используемых дрожжей релевантны только для указанной высоты слоя.

При разработке технологии получения потенциальных синбиотиков, важно подобрать такой режим сушки, чтобы наименее травмировать живые клетки микроорганизмов. Исследовали температурный диапазон естественной сушки - от 30°С до 50°С в тонком слое 1÷3 см при постоянном доступе воздуха.

Высушивание проводилось до содержания влаги на уровне не более 15%. Число жизнеспособных клеток дрожжевых культур определяли методом высева на плотные питательные среды (метод Коха). Экспериментальные данные представлены на фиг. 2.

По результатам исследований выбран режим сушки при температуре 35÷40°С при которых действие на жизнеспособные клетки дрожжевых культур не так травматично, погибло всего 15÷25% дрожжевых клеток. Однако, высушивание при температуре 40°С происходило быстрее, соответственно целесообразно применять данный режим сушки. Также необходимо отметить, что высота слоя влияет на сохранность клеток в течение процесса сушки, оптимальным является высота слоя 3 см.

Полученное синбиотическое средство исследовали во ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» на такие показатели, как содержание сухих веществ, белка, углеводов, жиров, золы, витаминов группы В (В2 и В1), измеряли общую калорийность. Данные исследований представлены в фиг. 3.

Представленные на фиг. 1, фиг. 2 и фиг. 3 данные свидетельствуют об активном накоплении новым штаммом дрожжей в процессе ферментации белка полезных метаболитов и использовании жиров: белок - не менее 18 г, жиры - не менее 0,5 г, углеводы - не менее 55 г, витамин В1 (тиамин) - 0,1 мг /100г, витамин В2 (рибофлавин) - 0,8 мг/100 г, - и колониеобразующих единиц на уровне 4,6*10⁹ КОЕ/г, сохранении большего количества КОЕ при сушке до влажности не более 15% - 3,0*10⁹ КОЕ/г, что соответствует заявленному техническому результату.

Пример 2. Использование полученного средства в качестве синбиотика

Синбиотики включают в себя две составляющие: пребиотическую и пробиотическую.

Преимущества пребиотиков включают улучшение барьерной функции кишечника и иммунитета человека, уменьшение субпопуляций условно-патогенных бактерий (например, клостридий). Полезный физиологический эффект для организма путем избирательного стимулирования благоприятного роста или активности ограниченного числа местных бактерий обеспечивают неперевариваемые вещества. Пищевые волокна - компоненты пищи, не перевариваемые пищевыми ферментами организма человека, но перерабатываемые полезной микрофлорой кишечника.

Полученное синбиотическое средство исследовали в аккредитованной испытательной лаборатории ООО «Лига Серт» на наличие пребиотической составляющей. По результатам исследований содержание растворимых и нерастворимых пищевых волокон в синбиотическом средстве - 73,2±11% по массовой доле, что соответствует заявленному техническому результату.

При этом в Российской Федерации в соответствии с ТР ТС 022/011 «Пищевая продукция в части ее маркировки» рекомендуемый уровень суточного потребления пищевых волокон для взрослого человека составляет 30 г, то есть прием 50 г синбиотического средства в день полностью удовлетворит указанную потребность.

Пробиотические свойства определяются входящими в состав синбиотического средства дрожжами Meyerozyma (Pichia) guilliermondii ВКПМ Y-4316 в количестве не менее 10⁹ КОЕ вышеуказанных дрожжей на г субстрата, с описанным в патенте РФ 2 771 136 (пункт 1 формулы) лактогенным и бифидогенным эффектом, детоксикационным и антагонистическим действием в отношении стафиллококков.

Кроме того, механизм действия пробиотических штаммов основан на поддержании колонизационной резистентности, то есть способности пробиотических штаммов предотвращать колонизацию желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) условно-патогенными и патогенными микроорганизмами за счет угнетения их активности и способности к размножению вследствие конкуренции за питательные вещества.

Помимо детоксикационного и антагонистического действия в отношении стафилококков, описанного в патенте РФ 2 771 136, культура жизнеспособного штамма дрожжей Meyerozyma (Pichia) guilliermondii ВКПМ Y-4316 была протестирована на наличие антагонистической активности по отношению к условно-патогенным культурам микроорганизмов: E.coli, E.cloacae, K.oxytoca, E.aerogenes. Штамм дрожжей образовывал зоны задержки роста при использовании всех использованных условно-патогенных культур (фиг. 4). Однако, наибольшее значение достигалось при действии на E.coli, возможно это объясняется тем, что дрожжи потребляют сахара из питательной среды, тем самым частично подавляя ее рост. Описанные данные подтверждают заявленный технический результат.

Пример 3. Адсорбционная активность синбиотического средства

Маннаны, входящие в структуру клеточных стенок дрожжей рода Pichia блокируют прикрепление патогенов к эпителию ЖКТ, что препятствует развитию инфекций. В желудочно-кишечном тракте они работают «чистильщиками». Для развития большинства заболеваний ЖКТ необходимо, чтобы болезнетворные бактерии закрепились на слизистой оболочке пищеварительного тракта. Их прикрепление происходит путем связывания специфических белков на поверхности бактерий (пектинов) с МОС на поверхности эпителия. Добавление биологически доступных маннанов предположительно препятствует развитию инфекции, поскольку они блокируют бактериальные пектины. Клеточная стенка дрожжей слоистая. С внешней и внутренней сторон она как раз покрыта маннанопротеинами. Патогенные бактерии прикрепляются к поверхности дрожжевых клеток, ошибочно принимая их за клетки кишечного эпителия, и выводятся из организма человека.

Для подтверждения адсорбционной активности были проведены исследования в соответствии с нормативными значениями и по методикам (ГОСТ 4453-74), используемым для определения широко признанного адсорбента с доказанной эффективностью - уголь активированный.

Адсорбционная активность определялась по индикатору метиленовому синему.

Для этого 0,15 г индикатора метиленового синего взвешивают (результат взвешивания в граммах записывают до третьего десятичного знака), помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³ и растворяют в 200 см³ горячей дистиллированной воды, затем раствор охлаждают, доводят дистиллированной водой до метки (получают рабочий раствор массовой концентрации 150 мг/дм³) . Рабочий раствор следует хранить в герметично закрывающейся посуде из темного стекла не более двух недель. Для построения градуировочного графика готовят растворы сравнения. Для этого в 10 мерных колб вместимостью 100 см³ каждая вводят 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 см³ рабочего раствора метиленового синего массовой концентрации 150 мг/дм3, после чего объемы доводят водой температурой (20±2)°С до метки. Полученные растворы содержат в 1 дм³ соответственно 0,75; 1,50; 3,00; 4,50; 6,00; 7,50; 9,00; 10,50; 12,00; 13,50 мг/дм³ метиленового синего. Оптическую плотность приготовленных растворов сравнения измеряют на фотоэлектроколориметре, используя светофильтр с длиной волны (K) от 650 до 670 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. В качестве контрольного раствора применяют дистиллированную воду. По полученным данным строят градуировочный график зависимости оптической плотности от массовой концентрации раствора сравнения (фиг. 5).

Для проведения анализа готовят раствор индикатора массовой концентрации 1500 мг/дм3, 1,5 г индикатора помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³ и растворяют в 200 см³ горячей воды (70-80°С). Затем раствор охлаждают, доводят объем раствора до метки, перемешивают. Навеску синбиотического средства массой 0,01 г, предварительно высушенного по ГОСТ 12597-67, помещают в коническую колбу вместимостью 100 см³, прибавляют 25 см³ раствора метилового оранжевого массовой концентрации 1500 мг/дм³, закрывают пробкой и взбалтывают на аппарате для встряхивания жидкости в сосудах в течение 60 мин. После взбалтывания суспензию переносят в пробирки для центрифугирования и центрифугируют в течение 15 мин. Осторожно отбирают пипеткой 1 см³ осветленного раствора и переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³. Раствор в колбе разбавляют дистиллированной водой до метки. Определяют оптическую плотность раствора после разбавления. По полученному значению оптической плотности, пользуясь градуировочным графиком, находят остаточную массовую концентрацию метиленового синего в разбавленном растворе.

Адсорбционную активность синбиотического средства по индикатору (X) в миллиграммах на 1 г продукта вычисляют по формуле:

где C₁ - массовая концентрация исходного раствора индикатора, мг/дм³; С₂ - массовая концентрация раствора после контактирования с активным углем, мг/дм³; K - коэффициент разбавления раствора; 0,025 - объем раствора индикатора, взятого для осветления, дм³; m - масса навески активного угля, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, абсолютное расхождение между которыми не превышает допускаемое расхождение, равное 10 мг на 1 г синбиотического средства.

Результаты, представленные на фиг.6, показывают, что адсорбционная активность синбиотического средства составляет 65,5 мг/г, то есть сорбируется порядка 20% красителя (метиленового синего). Описанные данные подтверждают заявленный технический результат. При учете норм этого показателя для эффективного адсорбента - активированного угля, применяемого в качестве лекарственного средства при различных заболеваниях ЖКТ, - которые составляют 225 мг/г, можно сделать вывод, что синбиотическое средство обладает существенной адсорбционной активностью, сравнимой с порядка 1/3 активности активированного угля.

Пример 4. Доклинические исследования

Безопасность пробиотиков должна соответствовать строгим микробиологическим стандартам, которые определяются Едиными санитарно-эпидемиологическими и гигиеническими требованиями к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору, и контролируются Роспотребнадзором.

Для определения безопасности проводили токсикологические исследования на лабораторных животных in vivo в соответствии с ОФС.1.7.2.0001.15 «Безопасность пробиотиков в тестах in vivo», МУК 4.2.2602-10 «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков»:

• определение вирулентности штамма;

• определение токсигенности штамма;

• определение токсичности штамма;

• определение безвредности штамма;

• определение дермонекротических свойств штамма;

• изучение острой токсичности синбиотического средства, полученного на основе штамма.

Исследование выполнялось в лаборатории доклинических исследований НИИ Фармакологии живых систем ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

При исследовании безвредности штамма дрожжей Meyerozyma (Pichia) guilliermondii ВКПМ Y-4316 тест-дозы испытуемого вещества (10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ КОЕ/мл) содержались в объеме 1,0 мл на животное. Перед каждым введением суспензию приготовленного испытуемого вещества перемешивали 6-8 раз. Суспензию вводили каждой мыши в желудок при помощи специально изготовленного атравматичного зонда со скоростью 0,1 мл/с. Количество мышей в каждой группе - 5 голов. Общее состояние животных не изменялось в течение всего срока наблюдения за ними. Смертности животных не было отмечено. Особенностей поведения у подопытных мышей, отличных от здоровых интактных животных, отмечено не было. Интенсивность и характер двигательной активности не менялись в течение 5 дней наблюдения и не отличались от показателей здоровых интактных животных. Судороги отсутствовали у всех животных, находившихся под наблюдением. Координация движений и тонус скелетных мышц в опытных группах не нарушались в течение 5 дней эксперимента и не отличались от соответствующих показателей здоровых интактных животных. Реакция на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители была адекватной у всех подопытных животных, отличий между подопытными и здоровыми интактными животными не наблюдалось. Частота и глубина дыхательных движений у экспериментальных мышей визуально была неотличимой от здоровых интактных животных. Состояние волосяного и кожного покровов экспериментальных животных не менялось в течение хода эксперимента. В течение 5 дней после введения исследуемых веществ видимые слизистые оболочки оставались бледно-розового цвета, влажность их не изменялась, симптомы бронхита, конъюнктивита и ринита отсутствовали. Частота дефекации и мочеиспускания, консистенция фекальных масс и окраска мочи подопытных животных не изменялись в результате введения изучаемых веществ во всех дозах. Показатели массы тела мышей, наблюдавшиеся после однократного внутрижелудочного введения исследуемых веществ, приведены в фиг. 7.

Как следует из представленных результатов, к пятым суткам эксперимента у подопытных животных наблюдалась положительная динамика массы тела, снижения групповой массы тела животных по сравнению с исходной не наблюдалось, что в совокупности с отсутствием летальности позволяет считать исследуемый штамм выдержавшим испытание в тесте безвредности в соответствии с общей фармакопейной статьей ОФС.1.7.2.0001.15 «Безопасность пробиотиков в тестах in vivo».

Изучение вирулентности осуществляли при однократном внутрибрюшинном введении самцам белых мышей тест-доз испытуемого вещества - 10⁸, 10⁹, 10¹⁰ КОЕ/0,5 мл в объеме 0,5 мл на каждое животное. Испытания проводили на здоровых животных массой 12-14 г, прошедших карантин и ранее не использованных в экспериментах. В опыте на каждую тест-дозу использовали 10 мышей. Испытуемые вещества в указанном объеме вводили каждой мыши внутрибрюшинно со скоростью 0,1 мл/с. В течение последующих пяти суток наблюдения за животными отклонений в общем состоянии не отмечалось. Так, общее состояние животных не изменялось в течение всего срока наблюдения за ними (см. пункт по определению безвредности). Смертности животных не было отмечено. Показатели массы тела мышей, наблюдавшиеся после однократного внутрибрюшинного введения исследуемых веществ, приведены в фиг. 8.

Как следует из представленных результатов, к пятым суткам эксперимента у подопытных животных наблюдалась положительная динамика массы тела, снижения групповой массы тела животных по сравнению с исходной не наблюдалось, что в совокупности с отсутствием признаков интоксикации и летальности позволяет считать исследуемый штамм выдержавшим испытание в тесте вирулентности в соответствии с общей фармакопейной статьей ОФС.1.7.2.0001.15 «Безопасность пробиотиков в тестах in vivo».

Испытание токсичности осуществляли при однократном внутрибрюшинном введении самцам белых мышей тест-доз испытуемого штамма дрожжей, инактивированного нагреванием - 0,5×10⁹, 10⁹, 2×10⁹ КОЕ/0,5 мл в объеме 0,5 мл на каждое животное. Испытания проводили на здоровых белых мышах массой 12-14 г, прошедших карантин и ранее не использованных в экспериментах. Условия содержания и кормления обеспечивали нормальную жизнедеятельность животных. В опыте на одну тест-дозу использовали 10 мышей. Перед испытанием определяли групповую массу всех мышей. Взвешивание проводили непосредственно перед опытом. Тест-дозы готовили путем разбавления исходных веществ 0,9% раствором натрия хлорида таким образом, чтобы требуемые тест-дозы содержались в объеме 0,5 мл. Тест-дозы вводили каждой мыши внутрибрюшинно со скоростью 0,1 мл/с.

В течение последующих пяти суток наблюдения за животными отклонений в общем состоянии не отмечалось. Так, общее состояние животных не изменялось в течение всего срока наблюдения за ними (см. пункт по определению безвредности). Смертности животных не было отмечено. Показатели массы тела мышей, наблюдавшиеся после однократного внутрибрюшинного введения исследуемых веществ, приведены в фиг. 9.

Как следует из представленных результатов, к пятым суткам эксперимента у подопытных животных наблюдалась положительная динамика массы тела, снижения групповой массы тела животных по сравнению с исходной не наблюдалось, что в совокупности с отсутствием признаков интоксикации и летальности позволяет считать исследуемый штамм выдержавшим испытание в тесте токсичности в соответствии с общей фармакопейной статьей ОФС.1.7.2.0001.15 «Безопасность пробиотиков в тестах in vivo».

Определение токсигенности испытуемого штамма дрожжей осуществляли при однократном внутрибрюшинном введении самцам белых мышей тест-доз фильтрата. Испытания проводили на здоровых белых беспородных мышах одного пола массой 12-14 г, прошедших карантин и ранее не использованных в экспериментах. В опыте на одну тест-дозу использовали 10 мышей. Условия содержания и кормления обеспечивали нормальную жизнедеятельность животных. Перед испытанием определяли групповую массу тела мышей. Взвешивание проводили непосредственно перед опытом. Фильтрат вводили мышам внутрибрюшинно в тест-дозах 0,1; 0,5; 1,0 мл. Контролем служила группа мышей, получавших стерильную жидкую среду в максимальном объеме - 1,0 мл.

В течение последующих пяти суток наблюдения за животными отклонений в общем состоянии не отмечалось. Так, общее состояние животных не изменялось в течение всего срока наблюдения за ними (см. пункт по определению безвредности). Смертности животных не было отмечено. Показатели массы тела мышей, наблюдавшиеся после однократного внутрибрюшинного введения исследуемых веществ, приведены в фиг. 10.

Как следует из представленных результатов, к пятым суткам эксперимента у подопытных животных наблюдалась положительная динамика массы тела, снижения групповой массы тела животных по сравнению с исходной не наблюдалось, что в совокупности с отсутствием признаков интоксикации и летальности позволяет считать исследуемый штамм выдержавшим испытание в тесте токсигенности в соответствии с общей фармакопейной статьей ОФС.1.7.2.0001.15 «Безопасность пробиотиков в тестах in vivo».

Определение дермонекротических свойств испытуемого штамма проводили на двух белокожих кроликах массой тела 2-2,5 кг. Суспензии исследуемого штамма в концентрациях 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ КОЕ/мл вводили внутрикожно в объеме 0,1 мл в область спины с помощью одноразовых стерильных шприцев с тонкой иглой. Осуществляли ежедневное наблюдение за животными в течение 4 сут. Отмечали появление припухлости, красноты, некроза. В качестве контроля чувствительности использовали 0,9% раствор натрия хлорида.

В течение последующих четырех суток наблюдения за животными отклонений в общем состоянии не отмечалось. В течение первых суток в месте инъекции локальных изменений не наблюдалось. На второй день в месте инъекции отмечалась небольшая припухлость во всех исследуемых концентрациях. На третий день наблюдения отмечалось небольшое покраснение, сохранявшееся также и на четвертые сутки наблюдения. В месте введения исследуемого штамма в концентрации 10¹¹ КОЕ/мл у одного из кроликов наблюдалась подкожная гематома. В то же время некротических изменений не наблюдалось ни в одной из исследуемых концентраций (фиг. 11). Таким образом, по результатам проведенного исследования в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.2602-10, исследуемый штамм не обладает дермонекротической активностью.

При изучении острой токсичности самцам белых лабораторных мышей массой тела 18-22 г внутрижелудочно вводили синбиотическое средство в виде суспензии в 1% крахмальном клейстере в объеме, максимально допустимом для данного вида животных и их массы тела - 1,0 мл, трехкратно с интервалом 6 часов между введениями. Для получения суспензии 0,1 г синбиотического средства растворяли в 2 мл 1% крахмального клейстера. В такой концентрации суспензия сохраняла способность проходить через просвет зонда для внутрижелудочного введения. Таким образом, каждая подопытная мышь получала 3 мл суспензии, содержащей 150 мг исследуемого синбиотического средства, что примерно соответствует дозе 7500 мг/кг. Так как предполагается, что синбиотическое средство не метаболизируется, и его действие не видоспецифично, коэффициенты межвидового пересчета доз не применяются (т.е. более 550 г на взрослого человека). Контрольной группе мышей тем же способом вводили 1% крахмальный клейстер. Наблюдали за животными в течение 7 суток.

В течение последующих семи суток наблюдения за животными отклонений в общем состоянии не отмечалось. Так, общее состояние животных не изменялось в течение всего срока наблюдения за ними (см. пункт по определению безвредности). Смертности животных также не наблюдалось, следовательно, ввиду невозможности введения животным дозы исследуемого синбиотического средства больше чем 7500 мг/кг, определение LD₅₀ и достижение более высоких значений показателя максимально переносимой дозы не представляется возможным. Показатели массы тела мышей, наблюдавшиеся после введения исследуемого биопрепарата, приведены в фиг. 12.

Как следует из представленных результатов, в ходе эксперимента у подопытных животных наблюдалась положительная динамика массы тела, снижения массы тела по сравнению с исходной не наблюдалось. Кроме того, отсутствовали достоверные отличия от животных контрольной группы. То есть применение синбиотического средства в дозе 550 г/сутки на взрослого человека безвредно.

По 5 мышей из каждой группы подвергались эвтаназии через 24 часа и 7 суток после введения исследуемого биопрепарата. Проводили некропсию тел животных. В ходе проведения некропсии визуально различимых изменений не было обнаружено ни у одного экспериментального животного. Результаты макроскопического и микроскопического исследования внутренних органов мышей, получавших исследуемый синбиотическое средство через 24 часа и через 7 суток после введения, показали, что данное средство не вызывало дистрофических, воспалительных, местнораздражающих и иных патологических изменений внутренних органов. Эти данные подтверждают возможность использования полученного средства в качестве безопасного синбиотика.

Список источников

1. Богданова Н.М., Булатова Е.М., Васия М.Н. Современный взгляд на микробиоценоз, иммунный ответ и факторы, влияющие на их формирование. Фундаментальные и прикладные аспекты // Вопросы современной педиатрии. 2013. №12 (4). С. 18-25.

2. Zommiti M., Chikindas M.L., Ferchichi M. Probiotics-Live Biotherapeutics: a Story of Success, Limitations, and Future Prospects-Not Only for Humans // Probiotics Antimicrobial Proteins, 2020 Sep, 12(3):1266-1289, doi:10.1007/s12602-019-09570-5.

3. Abraham B. P., Quigley E. M. Probiotics in Inflammatory // Bowel Disease, Gastroenterology clinics of North America, 2017 Dec, 46(4):769-782, doi:10.1016/j.gtc.2017.08.003.

4. Hayes M, Ross RP, Fitzgerald GF, Stanton C. Putting microbes to work: dairy fermentation, cell factories and bioactive peptides. Part I: overview // Biotechnol J. 2007 Apr;2(4):426-34. doi: 10.1002/biot.200600246.

5. Ивашкин В.Т., Маев И. В., Абдулганиева Д. И., Алексеенко С. А., Ивашкина Н. Ю., Корочанская Н. В., Маммаев С. Н., Полуэктова Е. А., Трухманов А. С., Успенский Ю. П., Цуканов В. В., Шифрин О. С., Зольникова О. Ю., Ивашкин К. В., Лапина Т. Л., Масленников Р. В., Ульянин А. И. Практические рекомендации Научного сообщества по содействию клиническому изучению микробиома человека (НСОИМ) и Российской гастроэнтерологической ассоциации (РГА) по применению пробиотиков для лечения и профилактики заболеваний гастроэнтерологического профиля у взрослых. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2020;30(2):76 89. https://doi.org/10.22416/1382-4376-2020-30-2-76-89

6. Markowiak P., Effects of Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics on Human Health. Nutrients. 2017;9(9):1021. DOI: 10.3390/nu9091021

7. Pandey K.R., Naik S.R., Vakil B.V. Probiotics, prebiotics and synbiotics - a review. J Food Sci Technol. 2015;52(12):7577-87. DOI: 10.1007/s13197-015-1921-1

8. En Yu, Daiwen Chen et al./ / Alteration of Porcine Intestinal Microbiota in Response to Dietary Manno-Oligosaccharide Supplementation // Frontiers in Microbiology. 2022.V 12: 811272.

9. Патент РФ 2 589 818. Метабиотическая композиция для обеспечения колонизационной резистентности микробиоценоза кишечника человека. Синица А.В. 10.04.2015 г.

10. Патент РФ 2 476 205. Композиция с противоинфекционной активностью. Синица А.В. 15.02.2012 г.

11. Патент Евросоюза EP2509450B1. Use of 2-O-glyceryl-α-D-glucopyranoside as prebiotic. 2009-12-11

12. Энтерол [Электронный ресурс]: [офиц. сайт]. Москва, 2014-2022. URL: https://enterol.ru/saccharomyces-boulardii/ (дата обращения: 23.10.2022).

13. Патент РФ 2 206 330. Средство, обладающее иммуномодулирующей, энтеросорбционной, антитоксической и противовоспалительной активностью и способ его получения. Кулемин Л.М., Чичерин И.Ю. 30.05.2002.

14. Патент РФ 2 102 903. Способ производства лечебно-профилактической добавки. Борисенко Е.Г. 27.01.1998.

15. Andoh A., Tsujikawa Т., Fujiyama Y. Role of dietary fiber and short-chain fatty acids in the colon. Curr. Pharm. Des. 2003; 9(4): 347-358.

16. Патент РФ 2 490 324. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, используемые в качестве пробиотика, и композиция на их основе. Лезаффр Э Компани (FR), Юниверсити Д'овернь Клермон 1 (FR), Юниверсити дю друа э де ля Санте Лилль 2 (FR) 20.08. 2013.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено синбиотическое средство на основе жизнеспособной биомассы штамма дрожжей Meyerozyma (Pichia) guilliermondii ВКПМ Y-4316.Синбиотическое средство имеет следующий состав на 100 г: белок – не менее 18 г, жиры – не менее 0,5 г, углеводы – не менее 55 г, влажность – не более 15%, витамин В1 (тиамин) – 0,1 мг, витамин В2 (рибофлавин) – 0,8 мг, энергетическая ценность – не менее 300 ккал. Содержит пробиотический компонент – не менее 109 КОЕ вышеуказанных дрожжей на г субстрата, пребиотическую составляющую: растворимые и нерастворимые пищевые волокна – не менее 60% по массовой доле. Обладает адсорбционной активностью не менее 65 мг/г, что сравнимо с порядка 1/3 активности активированного угля. В этой связи изобретение может быть использовано для производства пищевых, фармацевтических и кормовых композиций, а также в качестве препаратов для человека и животных, обладающих синбиотическим действием, адсорбционной и антагонистической активностью. 12 ил., 4 пр.

Синбиотическое средство на основе жизнеспособной биомассы штамма дрожжей Meyerozyma (Pichia) guilliermondii ВКПМ Y-4316, отличающееся тем, что содержит 109 КОЕ вышеуказанных дрожжей на г субстрата, и имеет следующий состав на 100 г: белок –18,8±0,2 г, жиры – 0,6±0,3 г, углеводы – 65,3±1,1 г, витамин В1 (тиамин) – 0,14±0,04 мг, витамин В2 (рибофлавин) –0,82±0,2 мг, пребиотическая составляющая: растворимые и нерастворимые пищевые волокна – 73,2±11% по массовой доле, и обладает адсорбционной активностью 65,5 мг/г.