СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА LACTOBACILLUS ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА Российский патент 2002 года по МПК G01N33/48 C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для селективного выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого).

Бактерии рода Lactobacillus широко распространены в природе. Они являются типичными представителями нормальной микрофлоры организма человека и животных, содержатся во многих пищевых продуктах (молочных, мясных, растительных).

Известно, что бактерии рода Lactobacillus являются доминирующей флорой влагалища человека. Существует тесная взаимосвязь между состоянием микрофлоры родовых путей беременных и формированием эубиотической микрофлоры кишечника ребенка в неонатальном периоде. При возникновении ряда акушерско-гинекологических заболеваний как инфекционной, так и не инфекционной природы, формируются выраженные нарушения резидентной вагинальной микрофлоры. Бактериальный вагиноз, сопровождающийся резкими изменениями лактофлоры, в настоящее время рассматривается как дисбактериоз влагалища. В диагностике дисбактериоза кишечника и влагалища одним из критериев дисбактериоза служит содержание бактерий рода Lactobacillus. При проведении бактериотерапии дисбактериозов содержание бактерий рода Lactobacillus служит показателем нормализации микрофлоры.

В связи с тем, что перед проведением антибиотикотерапии лечащий врач должен знать, влияет ли выбранный для лечения препарат на состояние индигенной лактофлоры пациента, необходимо определение чувствительности к антибиотикам индигенных бактерий рода Lactobacillus, а для этого нужен способ выделения их из клинического материала.

Кроме того, в тех случаях, когда содержание индигенных бактерий рода Lactobacillus у пациента ниже нормы (Дисбактериоз кишечника и методы его лабораторной диагностики. - Метод. рекомендации. - Хабаровск. - 1987), ему проводят заместительную бактериотерапию эубиотическими штаммами бактерий рода Lactobacillus. Однако применение эубиотических штаммов не всегда бывает эффективным. Известно, что экзогенные бактерии рода Lactobacillus не всегда приживаются в организме хозяина. Это связано с тем, что среди бактерий рода Lactobacillus широко распространен межвидовой и даже внутривидовой антагонизм, они могут оказывать повреждающее действие на индигенную микрофлору, или наоборот, аутофлора может подавлять развитие эубиотика, что снижает его лечебный эффект (Коршунов В. М. , Смеянов В. В. , Ефимов Б. А. Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника //Вести. Рос. АМН, - 1996. - 2. - С. 60-65). В связи с этим, необходимо каждому пациенту до начала бактериотерапии определять биосовместимость эубиотических бактерий рода Lactobacillus с аутолактофлорой, а для этого необходим простой и доступный для осуществления в бактериологических лабораториях способ выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала.

Выделение чистой культуры бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого) необходимо и для получения аутоштамма, на основе которого затем изготавливают бактерийный препарат для восстановления индигенной лактофлоры конкретного пациента. Считают, что применение аутоштаммов является наиболее оптимальным способом восстановления индигенной микрофлоры после антибиотикотерапии.

В настоящее время известно множество питательных сред, применяемых для культивирования лактобацилл, однако не все они пригодны для выделения лактобацилл из клинического материала, содержащего сопутствующую бактериальную флору. Главным образом, известные питательные среды предназначены для накопления биомассы лактобацилл и бифидобактерий.

Так, питательная среда для культивирования бифидобактерий и лактобацилл "Эпидермат" имеет следующее соотношение компонентов, г/л: 20,0-25,0 ферментативного гидролизата строжки шкур ластоногих или шкур плодов крупного рогатого скота с конечной концентрацией аминного азота 100-140 мг%; 9,5-10,0 лактозы; 4,5-5,5 натрия хлористого; 0,0025-0,0030 триптофана, 0,65-0,70 агара; воды до 1 литра (Ермишина И. Г. , Власова Т. Ф. RU 2039814; Б. И. 20, 20.07.95).

Недостатком данной среды является то, что она не обладает ингибирующими свойствами по отношению к микроорганизмам, присутствующем в клиническом материале (энтеробактериям, стафилококкам) и может использоваться только для накопления чистой культуры лактобацилл и бифидобактерий в пищевой промышленности и производстве препаратов-эубиотиков.

Известна питательная среда для выращивания микроорганизмов, состоящая из следующих компонентов, г/л: 0,14-0,16 панкреатического гидролизата казеина; 4,5-5,5 экстракта пекарских дрожжей; 19-21 лактозы; 0,15-0,25 цистина; 0,15-0,25 MgSO₄•7Н₂О; 0,04-0,06 MnSO₄•4H₂O; 0,4-0,6 аскорбиновой кислоты; водопроводной воды до 1 литра (Вашурин О. А. , Якшина Т. В. , Краснова С. П. и др. RU 2027754; Б. И. 3, 27.01.95).

Недостатком данной питательной среды является многокомпонентность состава, трудоемкость приготовления панкреатического гидролизата казеина, который необходимо подвергать ультрафильтрации на мембране, что требует сложного аппаратурного оформления. Применяемая концентрация панкреатического гидролизата казеина (0,14-0,16 г/л) в качестве источника питательных веществ недостаточна для культивирования лактобацилл, что компенсируется большим расходом лактозы (19-21 г/л) и добавками - витаминными (экстрактом пекарских дрожжей, цистином, аскорбиновой кислотой) и минеральными (MgSO₄•7Н₂О; MnSO₄•4Н₂О).

Наиболее близким к заявляемому является способ выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала путем приготовления 10-ти кратных разведений в жидкой селективной питательной среде обогащения для лактобацилл при следующем соотношении компонентов: гидролизата обезжиренного молока жидкого 20±5%; аутолизата дрожжей концентрированного 10±2%; агара технического 0,08%; воды дистиллированной до 100%; рН среды 5,4±0,1. Культивирование посевов осуществляют при 39^oС в течение 24-48 часов при повышенном содержании углекислого газа (5%) и пониженной концентрации кислорода (16%), а затем выделяют лактобациллы из жидкой селективной питательной среды обогащения высевом на плотную селективную питательную среду при следующем соотношении компонентов, г/л: 150-250 гидролизата обезжиренного молока жидкого; 80-120 аутолизата дрожжей концентрированного; 20 агара; воды дистиллированной до 1 литра; рН среды 5,3-5,5; культивирование посевов проводят при 39^oС в течение 24-48 часов при повышенном содержании углекислого газа (5%) и пониженной концентрации кислорода (16%) (Глушанова Н. А. Лактобациллы в исследовании и коррекции резидентной микрофлоры человека: Автореф. . . дис. канд. мед. наук. - Челябинск, 1999. - С. 7). Недостатком данного способа является длительность и трудоемкость приготовления панкреатического гидролизата обезжиренного молока (Инструкция по приготовлению кисломолочного бифилакта на молочных кухнях 11-14/6-33. - Утв. 27.03.87. МЗ СССР. - М, 1987. - С. 11).

Задача изобретения - создание более простой по технологии приготовления селективной питательной среды для выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого).

Поставленная задача достигается тем, что осуществляют накопление бактерий рода Lactobacillus из клинического материала при 39^oС на жидкой селективной питательной среде обогащения следующего состава, г/л:
Гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный - 30,0±3,0
Кислота уксусная ледяная - 3,4±0,1
Аутолизат дрожжей концентрированный - 110,0±10,0
Агар - 0,8
Вода дистиллированная - До 1 литра
Раствор едкого натра 20% до рН среды - 5,4±0,1,
а затем проводят выделение лактобацилл на плотной селективной питательной среде при следующем соотношении компонентов среды, г/л:
Гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный - 30,0±3,0
Кислота уксусная ледяная - 3,4±0,1
Аутолизат дрожжей концентрированный - 110,0±10,0
Агар - 22,5±2,5
Вода дистиллированная - До 1 литра
Раствор едкого натра 20% до рН среды - 5,4±0,1,
а культивирование посевов осуществляют при температуре 39^oС.

Новизна заявляемого способа состоит в том, что выделение бактерий рода Lactobacillus производят в два этапа при сочетании нескольких факторов: низкого значения рН среды (5,3-5,5), оптимального соотношения компонентов питательной среды, повышенной температуре инкубации (39^oС), культивировании посевов в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, 16% кислорода, обеспечивающих ускоренный рост бактерий рода Lactobacillus, обитающих в организме человека, и одновременно ингибирующих развитие сопутствующей микрофлоры, адаптированной к нейтральному значению рН (7,0), температуре 37^oС и аэробным условиям. Развитие сопутствующей облигатной анаэробной микрофлоры в таких условиях невозможно.

Сущность способа заключается в следующем:
Выделение бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого), осуществляют в два этапа. Первый этап заключается в приготовлении серии 10-ти кратных разведений исследуемого материала в жидкой селективной питательной среде обогащения для накопления лактобацилл, следующего состава:
Гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный - 30,0±3,0
Кислота уксусная ледяная - 3,4±0,1
Аутолизат дрожжей концентрированный - 110,04±10,0
Агар - 0,8
Вода дистиллированная - До 1 литра
Раствор едкого натра 20% до рН среды - 5,4±0,1
Разведения делают в пробирках, содержащих по 4,5 мл жидкой селективной питательной среды обогащения при помощи автоматического дозатора со съемными наконечниками, путем перенесения из пробирки в пробирку по 0,5 мл. Титрование по 0,5 мл производят до 10^-8-10^-10. После титрования посевы инкубируют в течение 24 часов при повышенном содержании углекислого газа (5%) и пониженной концентрации кислорода (16%) в атмосфере культивирования при температуре 39^oС. Результат учитывают визуально, по наличию общего помутнения среды или росту изолированных колоний. Затем из пробирок с наличием роста готовят мазки, окрашивают по Граму. Отмечают последнее разведение, где был обнаружен рост характерных по морфологии грамположительных палочек. Титр лактобацилл (количество бактерий рода Lactobacillus в 1 г клинического материала) определяют по максимальному разведению, в котором обнаружены типичные грамположительные палочки. Отмечают пробирки с разведениями клинического материала, в которых обнаружен обильный рост бактерий рода Lactobacillus.

Затем проводят второй этап - выделение лактобацилл на плотной селективной питательной среде. Для этого из пробирок с разведениями клинического материала, в которых обнаружен обильный рост бактерий рода Lactobacillus, осуществляют посев бактериологической петлей на поверхность плотной селективной питательной среды для получения изолированных колоний. Плотная селективная питательная среда имеет следующий состав, г/л:
Гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный - 30,0±3,0
Кислота уксусная ледяная - 3,4±0,1
Аутолизат дрожжей концентрированный - 110,0±10,0
Агар - 22,5±2,5
Вода дистиллированная - До 1 литра
Раствор едкого натра 20% до рН среды - 5,4±0,1
Культивирование посевов осуществляют при 39^oС в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, 16% кислорода, в течение 24-48 часов.

В условиях первого этапа культивирования на жидкой селективной среде происходит накопление бактерий рода Lactobacillus за счет их ускоренного роста и ингибирования роста сопутствующей микрофлоры при культивировании в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода в течение 24 часов при температуре 39^oС. Лактобациллы, обитающие в организме человека в составе индигенной микрофлоры, являются термофильными и хорошо растут при 39^oС. Бактерии рода Lactobacillus являются факультативными анаэробами, поэтому растут в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, 16% кислорода. Для получения атмосферы культивирования, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, посевы помещают в герметически закрывающуюся емкость (анаэростат, эксикатор), зажигают свечу и плотно закрывают.

Гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный (Нижегородского государственного предприятия по производству бактерийных препаратов "ИмБио", содержание аминного азота 1485 мг%) в количестве 27,0-33,0 г/л является источником азота. Ледяная уксусная кислота (ГОСТ 61-75) в количестве 3,3-3,5 г/л обеспечивает подавление сопутствующей микрофлоры, не препятствуя размножению лактобацилл. Дрожжевой аутолизат концентрированный (содержание аминного азота 580-600 мг%) в количестве 100,0-120,0 г на 1 литр среды служит стимулятором роста и источником пластических веществ, способствующих регенерации лактобацилл, поврежденных действием селективных факторов (рН 5,4±0,1, уксусная кислота).

Указанные количества гидролизата обезжиренного молока сухого ферментативного и дрожжевого аутолизата позволяют получить концентрацию аминного азота в питательной среде от 100 до 130 мг%, что обеспечивает чувствительность (всхожесть) среды.

Использование в заявляемом способе 0,8 г/л агара повышает вязкость среды, что позволяет получить рост изолированных колоний бактерий рода Lactobacillus в столбике среды, а также уменьшает растворимость кислорода в толще среды. В тоже время, 0,8 г/л агара в питательной среде не затрудняет приготовление разведений.

Установление значения рН среды в пределах 5,3-5,5 в сочетании с заявляемым составом обеспечивает подавление сопутствующей микрофлоры, не угнетая при этом роста засеянных лактобацилл. Культивирование посевов при 39^oС в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, 16% кислорода обеспечивает ускорение роста колоний лактобацилл, одновременно задерживая рост сопутствующей микрофлоры при исследовании клинического материала. Атмосфера такого газового состава может быть получена при помощи анаэростата и свечи. Сопутствующая индигенная анаэробная микрофлора в таких условиях не растет, из представителей аэробной микрофлоры, в указанных условиях возможен рост энтерококков и грибов рода Candida.

Введение в состав среды 20,0-25,0 г агара на 1 литр позволяет получить плотную селективную питательную среду для выделения изолированных колоний лактобацилл, что дает возможность выделения чистой культуры бактерий рода Lactobacillus для дальнейшего изучения.

Пример
Выделение бактерий рода Lactobacillus из фекалий с предварительным накоплением на жидкой селективной питательной среде обогащения.

В колбу вместимостью 1 литр помещают 120,0 г дрожжевого аутолизата концентрированного (содержание аминного азота 583 мг%), 33,0 г гидролизата обезжиренного молока сухого ферментативного (содержание аминного азота 1485 мг%), 0,8 г агара, 3,5 г ледяной уксусной кислоты, воды дистиллированной до 1 литра, 2,5 мл 20%-ного раствора едкого натра до рН 5,5, нагревают до расплавления агара, стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)^oС в течение 15 минут. Среду быстро охлаждают, поместив колбу в водяную баню с температурой 15-20^oС, периодически перемешивают для ускорения охлаждения и равномерного распределения агара в объеме среды. После стерилизации среду можно хранить в холодильнике до 2 месяцев.

Жидкую селективную питательную среду обогащения в асептических условиях разливают в пробирки по 4,5 мл. Пробирки можно хранить в холодильнике до 4 недель, поместив в герметичный пластиковый пакет для предотвращения высыхания. Перед использованием пробирки необходимо подогреть в термостате или на водяной бане до 37-39^oС.

Из основного разведения фекалий 10^-1 (в стерильном физиологическом растворе) при помощи дозатора готовят ряд 10-ти кратных последовательных разведений в 4,5 мл жидкой селективной питательной среды обогащения (титрование по 0,5 мл, до 10^-10). Посевы инкубируют при 39^oС в течение 24 часов в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода. Результат учитывают визуально, по наличию общего помутнения среды или росту изолированных колоний. Затем из пробирок с наличием роста готовят мазки, окрашивают по Граму. Отмечают последнее разведение, где был обнаружен рост характерных по морфологии грамположительных палочек. Титр (количество бактерий рода Lactobacillus в 1 г фекалий) определяют по максимальному разведению, в котором обнаружены типичные грамположительные палочки. В посевах фекалий, кроме лактобацилл, в указанных условиях могут расти энтерококки, которые легко отличимы по морфологии в мазках по Граму. Отмечают пробирки с разведениями фекалий, в которых обнаружен обильный рост бактерий рода Lactobacillus без энтерококков, или с минимальным присутствием энтерококков, а затем из этих пробирок бактериологической петлей делают высев на поверхность плотной селективной питательной среды для получения изолированных колоний.

Плотную селективную питательную среду готовят следующим образом:
в колбу вместимостью 1 литр помещают 100,0 г дрожжевого аутолизата концентрированного (содержание аминного азота 583 мг%), 27,0 г гидролизата обезжиренного молока сухого ферментативного (содержание аминного азота 1485 мг%), 20,0 г агара, 3,3 г ледяной уксусной кислоты, воды дистиллированной до 1 литра, 2,5 мл 20%-ного раствора едкого натра до рН 5,5, нагревают до расплавления агара, стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)^oС в течение 15 минут. Среду охлаждают до температуры 45-50^oС, разливают в асептических условиях по 20 мл в стерильные чашки Петри, перед посевом чашки подсушивают в термостате при 37-39^oС до исчезновения капель конденсата на поверхности среды.

Инкубацию посевов на плотной селективной питательной среде проводят в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, крышкой вниз, при 39^oС в течение 24-48 часов.

Колонии бактерий рода Lactobacillus вырастают разной величины, от точечных (росинки), до 2-3 мм в диаметре, чаще плоские, шероховатые, слегка опалесцирующие, прозрачные, иногда с возвышением в центре и валиком по краю, редко белого цвета. В мазке по Граму - грамположительные мелкие или крупные, без капсулы, неспорообразующие палочки, расположенные отдельно или цепочками. При посеве фекалий, наряду с колониями бактерий рода Lactobacillus, обнаруживают колонии энтерококков. Колонии энтерококков белые, круглые, выпуклые, блестящие, гладкие, редко шероховатые. От бактерий рода Lactobacillus их дифференцируют в мазках по Граму.

Для накопления чистой культуры бактерий рода Lactobacillus, после микроскопии производят посев остатков колонии в 5 мл молочно-дрожжевой жидкой среды накопления. Инкубацию посевов на среде накопления проводят при 39^oС в течение 16-20 часов, проверяют чистоту культуры и используют для дальнейшего изучения (определения биосовместимости с эубиотическими штаммами бактерий рода Lactobacillus, приготовления лактобактерина на основе аутоштамма бактерий рода Lactobacillus, определения чувствительности аутоштамма бактерий рода Lactobacillus к антибиотикам).

Для обоснования принадлежности выделенных бактерий к роду Lactobacillus используют следующие признаки. Сам факт развития культуры на селективной питательной среде в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, позволяет предположить развитие культуры лактобацилл. Дополнительно проводят морфологические исследования: палочковидная форма и положительная окраска по Граму, а также выявление метахроматических включений при окраске метиленовым синим, отсутствие способности к споро - и капсулообразованию. Подтверждением принадлежности культуры к роду лактобацилл служит отсутствие подвижности (особенно из жидкой среды) при фазово-контрастной микроскопии, неспособность к редукции нитратов и метиленовой сини, отрицательная оксидазная и каталазная пробы, отсутствие пигментообразования. На принадлежность культуры к группе анаэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов указывает неспособность к росту на неселективной плотной среде для культивирования лактобацилл при 39^oС в аэробных условиях, отсутствие роста при 39^oС на простом агаре в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода.

Таким образом, полученные результаты доказывают, что заявляемый способ выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала позволяет не только значительно улучшить диагностику желудочно-кишечных заболеваний, но и значительно повысить качество бактериотерапии и антибиотикотерапии.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для селективного выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого). Для этого осуществляют накопление бактерий рода Lactobacillus из клинического материала при 39^oС на жидкой селективной питательной среде обогащения при следующем соотношении компонентов среды, г/л: гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный 30,0±3,0; кислота уксусная ледяная 3,4±0,1; аутолизат дрожжей концентрированный 110,0±10,0; агар 0,8; вода дистиллированная до 1 л; раствор едкого натра 20% до рН среды 5,4±0,1, а затем проводят выделение лактобацилл на плотной селективной питательной среде при следующем соотношении компонентов среды, г/л: гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный 30,0±3,0; кислота уксусная ледяная 3,4±0,1; аутолизат дрожжей концентрированный 110,0±10; агар 22,5±2,5; вода дистиллированная до 1 л; раствор едкого натра 20% до рН среды 5,4±0,1. Способ обладает простотой и эффективностью, позволяет улучшить диагностику желудочно-кишечных заболеваний.

Способ выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого), заключающийся в приготовлении серии 10-кратных разведений исследуемого материала в жидкой селективной питательной среде обогащения, высеве из разведений на поверхность плотной селективной питательной среды, культивировании посевов при 39^oС в течение 24-48 ч при повышенном содержании углекислого газа (5%) и пониженной концентрации кислорода (16%) в атмосфере культивирования, отличающийся тем, что осуществляют накопление бактерий рода Lactobacillus из клинического материала на жидкой селективной питательной среде обогащения при следующем соотношении компонентов среды, г/л:
Гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный - 30,0±3,0
Кислота уксусная ледяная - 3,4±0,1
Аутолизат дрожжей концентрированный - 110,0±10,0
Агар - 0,8
Вода дистиллированная - До 1 л
Раствор едкого натра 20% до рН среды - 5,4±0,1
а затем проводят выделение лактобацилл на плотной селективной питательной среде при следующем соотношении компонентов среды, г/л:
Гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный - 30,0±3,0
Кислота уксусная ледяная - 3,4±0,1
Аутолизат дрожжей концентрированный - 110,0±10,0
Агар - 22,5±2,5
Вода дистиллированная - До 1 л
Раствор едкого натра 20% до рН среды - 5,4±0,1