Антитела против рецептора стабилин-1 (stabilin-1) человека Российский патент 2024 года по МПК C07K16/00 A61K39/395 

Изобретение относится к области биохимии, в частности к моноклональному антителу, способному специфически связываться с рецептором стабилин-1 человека, а именно мышиным моноклональным антителам против стабилин-1. Изобретение может быть использовано для лечения заболеваний, ассоциированных со стабилин-1 человека.

Моноклональные антитела (МАТ) к стабилин-1 представляют собой перспективный класс биологически активных веществ. Они выступают в качестве эффективных инструментов в лечении различных заболеваний, особенно онкологических, благодаря своей способности регулировать сигнальные пути, вовлеченные в ангиогенез и иммунный ответ.

Стабилин-1 (stabilin-1, также известный как Clever-1 и FEEL-1) представляет собой рецептор, экспрессируемый на лимфатических эндотелиальных клетках, синусоидальных эндотелиальных клетках и иммуносупрессивных моноцитах и макрофагах [Kzhyshkowska J. Gratchev А. Goerdt S. Stabilin-1, a homeostatic scavenger receptor with multiple functions J. Cell. Mol. Med.2006 10 635 649]. Выделяют две субпопуляции макрофагов: воспалительные Ml- макрофаги, отвечающие за уничтожение чужеродных агентов как напрямую, так и за счет привлечения и активации других клеток иммунной системы и М2-макрофаги, выполняющие адаптивную, регенераторную и противовоспалительную функции. Одним из ключевых маркеров М2-макрофагов является мембранный гликопротеин, способный химически связывать модифицированные липопротеиды низкой плотности и модулировать регуляторные свойства макрофагов - стабилин-1.

Макрофаги, помимо различия в выполняемых функциях, обладают свойством пластичности, которое позволяет им изменять свой фенотип и функции в ответ на сигналы микроокружения, в частности опухолевой стромы при злокачественных заболеваниях. Роль опухолевой стромы в патогенезе злокачественных опухолей не подвергается сомнению. Макрофаги - одни из ключевых элементов опухолевой стромы. Макрофаги, ассоциированные с опухолью (МАО), являются макрофагами 2-го типа активации, которые обладают выраженной противовоспалительной активностью и отвечают за подавление воспалительной реакции и восстановления ткани в очаге воспаления. МАО вносят значительный вклад в прогрессию опухолей за счет стимуляции пролиферации клеток, ангиогенеза и подавления противоопухолевого иммунного ответа. К их маркерам относится и стабилин-1. Анализ различных форм рака у человека выявил заметную связь между количеством стабилин-1-положительных макрофагов и исходом заболевания.

Роль стабилин-1 в росте и распространении рака впервые была показана на моделях мышей с нокаутом Stab 1 -/-, у которых развивались первичные опухоли и метастазы меньшего размера. Последующие исследования на мышах и людях показали, что иммунотерапевтическая блокада стабилин-1 может активировать Т-клеточные ответы, и что этот ответ в основном опосредован фенотипическим изменением макрофагов и моноцитов с иммуносупрессивных на провоспалительные [Dunkel, J., Viitala, М., Karikoski, М., Rantakari, P., Virtakoivu, R., Elima, K. et al. Enhanced antibody production in Clever-1/Stabilin-1-deficient mice. Front. Immunol. 9,2257 (2018)].

Известно одно терапевтическое антитело против стабилина-1 (Stabilin-1, Clever-1) человека, которое в настоящее время находится на стадии клинических испытаний (MATINS, NCT03733990). Бексмарилимаб (FP-1305) - гуманизированное моноклональное антитело изотипа IgG4, которое продемонстрировало значимую противоопухолевую активность в доклинических и одном клиническом исследованиях. Исследование FP-1305, NCT03733990) - это первое открытое адаптивное клиническое исследование фазы 1/2 с участием избранных метастатических или неоперабельных солидных опухолей с целью изучения безопасности и эффективности Бексмарилимаба. Выбранные опухоли включают кожную меланому, поджелудочную железу, яичники, эстроген-рецептор-положительные опухоли молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, рак желчного пузыря и холангиокарциному, все из которых, как известно, содержат большое количество стабилин-1-положительных макрофагов. Ранние результаты исследования Бексмарилимаба, в которую вошли 11 пациентов, получавших лечение, показывают многообещающую переносимость, клиническую противоопухолевую активность и мобилизацию естественных клеток-киллеров, В-клеток и Т-клеток после лечения [Bono, P., Hollmen, М., Jaakkola, P., Shetty, S., Thibault, A., de Jonge, М. et al. LBA29 Immune activation with a novel immune switch anti-macrophage antibody (anti-Clever-1 mAb; FP-1305) in phase I/II first-in-human MATINS trial in patients with advanced solid tumours. Ann. Oncol. 30, mdz394-018 (2019)]. Данные тестирования препарата, успешно проходящего клинические испытания, подчеркивают актуальность и востребованность разработки новых молекул в данной области.

Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является расширение спектра моноклональных антител против стабилин-1.

Технический результат - получение нового моноклонального мышиного антитела (МАТ) ТШК 10, которое с высокой аффинностью (K_D=2,23×10¹² М) связывает рекомбинантный белок стабилин-1 человека и нативный стабилин-1 на поверхности макрофагов человека, обеспечивая накапливание антитела в опухолевом узле.

Поставленная задача решается созданием моноклонального антитела мыши способного специфически связываться с рецептором стабилин-1 человека, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 1, вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 2 и гипервариабельные участки тяжелой и легкой цепей с последовательностями SEQ ID NO: 3-8.

В настоящем изобретении технический результат достигнут получением нового моноклонального мышиного антитела (МАТ) ТШК 10, изотипа IgG2a, специфически связывающего рекомбинантный белок стабилин-1 человека с высокой аффинностью (K_D=2.23×10^-12 М), а также связывающего нативный стабилин-1 на поверхности макрофагов человека. При этом, МАТ ТШК 10 накапливалось в области опухолевого узла перевитых клеток рака кишечника мыши в экспериментах in vivo. Полученное МАТ ТШК 10 может быть использовано для получения химерных и гуманизированных антител и адресной доставки с их помощью тераностического радиофармацевтического препарата или цитотоксических веществ к опухоли.

Способ получения антител

Технология получения мышиных антител включала в себя иммунизацию мышей антигеном рекомбинантного белка стабилин-1 человека, получение и отбор позитивных гибридомных клонов - продуцентов моноклональных антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), наработку антител в асцитах мышей, выделение и очистку антител на белок А-сефарозе и разноплановые исследования полученных антител. Нуклеотидные последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей полученного мышиного моноклонального антитела были изучены с помощью генетического секвенирования.

Заявленное изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:

На Фиг. 1 показаны результаты электрофореза моноклонального антитела ТШК10. А - не восстанавливающие условия, Б - восстанавливающие условия. 1 - белковый маркер молекулярного веса, 2 -моноклональное антитело ТШК 10.

На Фиг. 2 показаны результаты иммуноферментного анализа (ИФА) моноклонального антитела ТШК 10 к антигену-мишени стабилин-1 человека (А) и мыши (Б).

На Фиг. 3 показаны данные проточной цитометрии при визуализации нативного стабилин-1 моноклональными антителами ТШК 10 на поверхности макрофагов человека.

На Фиг. 4 показан флуоресцентный прижизненный имиджинг мышей с привитыми опухолями СТ-26 (верхний ряд) и здоровых лабораторных мышей (нижний ряд) через 48 часов после внутривенного введения МАТ ТШК 10 к рецептору стабилин-1, меченных флюорохромом Cyanine7.

Сущность и промышленная применимость изобретения поясняются следующими примерами:

Пример 1.1. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела мыши к белку стабилин-1 человека

На первом этапе проведена 1-я иммунизация шести мышей Balb/c препаратом рекомбинантного стабилин-1 человека (Recombinant Stabilin 1 (STAB 1 человека), RPC872Hu01, Cloud-CloneCorp.). Мыши иммунизировались в апоневроз задних конечностей в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ). Для иммунизации раствор препарата смешивали с равным объемом ПАФ (100 мкл/мышь) из расчета 20 мкг антигена на мышь. Через 2 недели после первой иммунизации все мыши были повторно иммунизированы раствором препарата рекомбинантного СТАБИЛИН-1 человека в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (1:1), в объеме 100 мкл/мышь, в апоневроз задних конечностей, из расчета 20 мкг антигена на мышь. На четвертый день после последней иммунизации у наркотизированных и умерщвленных животных забирали лимфоциты паховых и брюшных лимфоузлов для гибридизации с миеломой SP2/0. Полученные лимфоциты смешивали с клетками миеломы в соотношении 1:1. Гибридизацию проводили по методу Мильштейна-Келлера [Kohler G. and Milstein С.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature, 1975, 256 (5517): 495-497] инкубацией клеток в 50% растворе полиэтиленгликоля (ПЭГ) (молекулярная масса 1500 Да) в течение 1,5 мин, после чего к суспензии последовательно с интервалом 1 мин добавляли среду RPMI-1640 объемами, равными первоначальному объему раствора ПЭГ. После гибридизации клетки дважды отмывали культуральной средой и высевали в 96-луночные культуральные планшеты с суточными перитонеальными макрофагами, вносили гибридные клетки в количестве 1,5×10⁵ клеток на лунку. Селекцию гибридов проводили в среде RPMI-1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, содержащей 10^-4 М гипоксантина, 4×10^-7 М аминоптерина и 1,6×10^-5 М тимидина. Итого в гибридизацию пошло 50 млн. лимфоцитов и 50 млн. клеток SP2/0, которые после гибридизации рассеяли на 10 плат. Через 10 дней платы исследовали под микроскопом. В платах с клетками лимфоузлов было от 1 до 4 клонов, поэтому платы скринировали целиком. Скрининг позитивных клонов, секретирующих моноклональные антитела (мАТ) проводили методом непрямого твердофазного ИФА, регистрируя связывание антител с антигеном, иммобилизованным в лунках планшета с высокой сорбционной емкостью. Для иммобилизации антигена в лунки 96-луночного планшета для ИФА вносили антиген стабилин-1 (Recombinant Stabilin 1 (STAB1 человека), RPC872Hu01, Cloud-CloneCorp.) в концентрации 5 мкг/мл, приготовленный на 0,01 М карбонатном буферном растворе, рН 9,6 в объеме 100 мкл (Буфер А) и выдерживали при комнатной температуре в течение 16 ч. Лунки планшета отмывали забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твин-20 (ЗФР-Т) и вносили в них супернатант культуральной жидкости гибридных клеток в объеме 50 мкл и 100 мкл ЗФР-Т. Планшет инкубировали при температуре плюс 37°С в течение 1 ч. После этого лунки планшета трижды отмывали раствором ЗФР-Т и добавляли в лунки антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой хрена, в рабочем разведении. Планшет инкубировали при температуре плюс 37°С в течение 1 ч, затем пятикратно отмывали раствором ЗФР-Т, после чего добавляли хромогенный субстрат тетраметилбензидин (ТМБ). Клоны клеток, продуцирующие моноклональные антитела к препарату рекомбинантного стабилин-1 человека, отбирали на основании положительной иммуноферментной реакции, которая проявлялась в виде окрашивания продукта хромогена - ТМБ. Реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Планшеты сканировали на планшетном ридере, измеряя поглощение при 450 нм. В результате была отобрана гибридома, продуцирующая МАТ к рекомбинантному стабилин-1 человека, которая была обозначена как: ТШК 10.

Отобранный положительный клон многократно клонировали методом конечных разбавлений с отбором наиболее продуктивных и стабильных клонов. Клетки высевали в ячейки планшетов, содержащие перитонеальные макрофаги нормальных мышей (фидер), в концентрациях приблизительно 2 клетки на ячейку с тем расчетом, чтобы в большинстве ячеек вырос единственный клон. Полученные одиночные клоны скринировали посредством ИФА, алгоритм проведения скрининга был аналогичным алгоритму первичного скринига клонов. Если все клоны каждого типа антител оказывались положительными, то клетки любого положительного клона нарабатывали в культуральных флаконах путем культивирования при температуре плюс 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. В качестве среды для культивирования использовали RPMI-1640, содержащую 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина. Культивирование проводили до получения необходимого количества клеток для введения в мышей (с целью наработки антител в асцитах) и для криоконсервации, из расчета 2 млн на мышьи 5 млн на ампулу. На 10 день после посева на клонирование платы с клетками клонов исследовали под микроскопом и отмечали лунки, в которых присутствовал только один клон. Культуральные жидкости одиночных клонов отбирали для анализа методом ИФА.

Пример 1.2. Изотипирование МАТ ТШК 10

Для клона ТШК 10 было проведено изотипирование, с целью установления класса иммуноглобулинов. Изотипирование проводили методом непрямого твердофазного ИФА с использованием набора реактивов Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents (SigmaAldrich, кат.№IS02-1KT), регистрируя связывание антител с антигеном, иммобилизованным в лунках планшета с высокой сорбционной емкостью. Для иммобилизации антигена в лунки 96-луночного планшета для ИФА вносили антиген стабилин-1 в концентрации 5 мкг/мл, приготовленный на 0,01 М карбонатном буферном растворе, рН 9,6 в объеме 100 мкл (БуферА) и выдерживали при комнатной температуре в течение 16 ч. Лунки планшета отмывали забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твин-20 (ЗФР-Т) и вносили в них супернатант культуральной жидкости гибридных клеток в объеме 50 мкл и 100 мкл (ЗФР-Т). Планшет инкубировали при температуре плюс 37°С в течение 1 ч. После этого лунки планшета вновь трижды отмывали раствором ЗФР-Т и добавляли в лунки антитела против изотипов иммуноглобулинов мыши IgG1, IgG2a IgG2b, IgG3, IgGM, IgGA, меченные пероксидазой хрена, в рабочем разведении. Планшет инкубировали при температуре плюс 37°С в течение 1 ч, затем пятикратно отмывали раствором ЗФР-Т, после чего добавляли хромогенный субстрат тетраметилбензидин (ТМБ). Изотип иммуноглобулинов, продуцируемых клоном, определяли на основании положительной иммуноферментной реакции на антитела к определенному анти-изотипическому антителу, которая проявлялась в виде окрашивания продукта хромогена - ТМБ. Реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Планшеты сканировали на планшетном ридере, измеряя поглощение при 450 нм. В результате изотипирования полученных моноклональных антител было выявлено, что МАТ ТШК 10 представляют собой изотип IgG2a.

Пример 1.3. Наработка моноклональных антител

Наработку моноклональных антител ТШК 10 для изучения их свойств осуществляли в организме инбредных мышей линии BALB/c, которым до введения клеток гибридомы внутрибрюшинно (в/бр) вводили 0,5 мл 14-тетраметиленпентадекана (пристана). Через 14 дней этим животным также в/бр вводили прививочную дозу 2×10⁶ гибридных клеток на мышь. Через 10 дней после этого мышей переводили на питьевую диету физиологическим раствором и в течение последующих 2-8 дней наблюдали за ростом объема брюшной полости с асцитической жидкостью. При достижении брюшной полостью заметного объема асцитическую жидкость (объемом 3-5 мл), содержащую моноклональные антитела, отбирали и определяли в ней титр антител методом ИФА. Продукция МАТ в асцитических жидкостях мышей варьировала от 1 до 2 мг/мл.

Пример 1.4. Выделение и очистка моноклональных антител

Полученную асцитическую жидкость осветляли центрифугированием (30 мин, 20000 об/мин), после чего моноклональные антитела выделяли из супернатанта осаждением сульфатом аммония, и затем очищали методами аффинной хроматографии с использованием сорбента с белком А. Осаждение сульфатом аммония проводили добавлением к супернатанту порошка NH₂SO₄ до концентрации 45% от насыщения. Для формирования осадка раствор оставляли в холодильнике (плюс 2-6°С) на ночь. Осадок отделяли центрифугированием (15 мин, 10000 об/мин), растворяли в минимальном растворе 20 мМ Na-фосфатного буферного раствора с 0,15 М NaCl, рН 7,2 (ФСБ) и затем диализовали приблизительно 16 часов при плюс 2-6°С против 1,5 М глицина с 3 М NaCl, рН 8,6. Диализат с помощью насоса наносили со скоростью 1 мл/мин на колонку (10×50 мм), заполненную 5 мл сорбента с белком А и уравновешенную тем же буферным раствором. После сорбции сорбент промывали 50 мл этого же буферного раствора. Элюцию проводили 20 мл 20 мМ натрий-цитратного буферного раствора, рН 4,0 для элюции антител с изотипом IgG2. Элюат, содержащий антитела, собирали в емкость, контролируя процесс выхода белка с колонки с помощью УФ детектора хроматографа. Далее антитела концентрировали осаждением сульфатом аммония. Осаждение сульфатом аммония проводили добавлением к супернатанту порошка NH₂SO₄ до концентрации 45% от насыщения. Для формирования осадка раствор оставляли в холодильнике (плюс 2-6°С) на ночь. Осадок отделяли центрифугированием (15 мин, 10000 об/мин), растворяли в минимальном растворе 20 мМ Na-фосфатного буферного раствора с 0,15 М NaCl, рН 7,2 (ФСБ) и затем диализовали приблизительно 16 часов при плюс 2-6°С против 20 мМ Na-фосфатного буферного раствора с 0,15 М NaCl, рН 7,2. После диализа определяли содержание белка методом спектрофотометрии при длине волны 280 нм, используя молярный коэффициент экстинкции для мышиных IgG.

Пример 1.5. Оценка чистоты полученного препарата мАТ ТШК10

Оценку чистоты и гомогенности полученных препаратов антител проводили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в не восстанавливающих и восстанавливающих условиях. По данным электрофореза в не восстанавливающих условиях препарат МАТ ТШК 10 демонстрирует одну мажорную зону, молекулярного веса более 150 кДа, что соответствует молекулярному весу иммуноглобулинов и свидетельствует о чистоте препарата. Результаты электрофореза в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях свидетельствует о том, что антитело ТШК10 характеризуется типичным для иммуноглобулинов класса G наличием двух цепей - тяжелой и легкой, с молекулярными массами 55 и 25 кДа соответственно (Фиг. 1).

Пример 2. Исследование свойств моноклональных антител ТШК 10. Оценка эффективности связывания моноклонального антитела ТШК 10 с рекомбинантным белком стабилин-1

Для определения связывания моноклональных антител ТШК 10 к антигену-мишени стабилин-1 применяли твердофазный вариант ИФА. В качестве твердой фазы использовали полистироловые 96-ти луночные планшеты Corning (Costar). В качестве антигена для иммобилизации твердой фазы использовали рекомбинантные белки стабилин-1 человека (Recombinant Stabilin 1 (STAB1 человека), RPC872Hu01, Cloud-CloneCorp.) и мыши (Recombinant Stabilin 1 (STAB 1 мыши), RPC872Mu01, Cloud-CloneCorp.) в концентрации 2,5 мкг/мл. Адсорбцию антигена проводили в 20 мМ боратном буфере с рН 8,0, содержащем 0,15 М NaCl, в течение 20 часов во влажной камере при +4°С. Моноклональные антитела ТШК 10 наносили в 100 мкл промывочного буфера (фосфатно-солевой буфер, рН 7,4, 0,05% Tween-20), содержащего 1 мг/мл БСА с последовательным разбавлением антител в 2 раза, начиная со стартовой концентрации 2 мкг/мл. Планшеты инкубировали 1 час при 37°С и перемешивании. По окончании инкубации проводили отмывку не связавшихся с антигеном антител промывочным буфером и вносили в лунки раствор конъюгированных с пероксидазой хрена иммуноглобулинов козы к иммуноглобулинам мыши (Sigma-Aldrich, США) в разведении 1:20.000. Планшеты инкубировали 1 час при 37°С и перемешивании. По окончании инкубации проводили отмывку не связавшихся антител промывочным буфером. Проявление связавшихся вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, проводили с помощью раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ). Реакцию останавливали добавлением 1М серной кислоты при этом ТМБ приобретает желтый цвет с максимальной поглощающей способностью при 450 нм. Количество преобразованного ТМВ детектировали с помощью планшетного ридера EnSpire Multimode Plate Reader (Perkin Elmer, USA) при длине волны 450 нм. Полученные результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 9.4.0., фиттируя зависимость оптической плотности при длине волны 450 нм (OD450) от концентрации МАТ кривой Михаэлиса-Ментена [https://www.graphpad.com/guides/prisrn/latest/curve-fitting/reg_michaelis_menten_enzyme.htm] и определяя константу связывания Km как концентрацию МАТ, необходимую для достижения половины максимальной OD450.

Иммуноферментный анализ показал (Фиг. 2), что моноклональное антитело ТШК 10 против человеческого стабилин-1 обладает сильной связывающей активностью с человеческим стабилин-1 (к_m=16 нМ), при этом демонстрировало невысокую связывающую активность с мышиным антигеном стабилин-1 (к_m=33 мкМ). Результаты исследований приведены на Фиг. 2.

Для определения константы связывания Kd моноклонального антитела ТШК 10 проводили измерение параметров взаимодействия полученных МАТ ТШК 10 с человеческим и мышиными антигенами стабилин-1 методом бислойной интерферометрии (ВЫ) на приборе Octet® RED 96 Forte Bio (Sartorius) с использованием сенсоров Octet® Anti-Mouse IgG Fc Capture (АМС) и Anti-Human IgG Fc Capture (АНС) и двух рекомбинантных белков стабилин-1: рекомбинантный стабилин-1 человека (RPC872Hu01, Cloud-CloneCorp.) и рекомбинантный мышиный стабилин-1 (RPC872Mu01, Cloud-CloneCorp.). По результатам измерения кинетических свойств связывания антитела ТШК 10 с человеческим рекомбинантным антигеном стабилин-1 была определена Kd=2.23⋅10^-12 М.

Пример 3. Исследование свойств моноклональных антител ТШК 10. Анализ связывания антител ТШК 10 с нативным антигеном стабилин-1 на поверхности макрофагов человека

Целью этого этапа исследований была проверка связывания нативного антигена на поверхности клеток человека полученными моноклональными антителами ТШК 10. В качестве клеточной модели экспрессии рецептора стабилин-1, согласно имеющейся на литературе, была использована первичная культура макрофагов человека [Julia Kzhyshkowska. Multifunctional Receptor Stabilin-1 in Homeostasis and Disease. Ehe Scientific World JOURNAL (2010) 10, 2039-2053 DOI 10.1100/tsw.2010.189]. Получение макрофагов человека проводили по следующей методике. Для получения моноцитарной фракции использовался метод градиентного центрифугирования (400g, 40 минут), смешанной с PBS, свежесобранной цельной крови здоровых доноров в растворе фиколла плотностью 1.077 (Биолот, Россия). Отобранная средняя лимфоцитарная фракция культивировалась на чашках Петри в приготовленной среде для макрофагов (RPMI-1640 (Биолот, Россия), 10% сыворотка крови человека, 20 мкг/мл Гентамицин (Биолот, Россия)) в течение 2-х часов в инкубаторе при 37°С и 5% СО₂ с последующей сменой среды. Дифференцировка моноцитов в макрофаги осуществлялась в течение четырех суток с ежедневной сменой среды в инкубаторе при 37°С и 5% CO₂. Для дальнейших экспериментов на пятые сутки макрофаги были сняты с подложки чашки Петри при помощи стерильного одноразового шпателя и зафиксированы в 4%-м формальдегиде. Далее макрофаги человека инкубировали с МАТ ТШК 10 в количестве 2 мкг на 10⁶ клеток. Окрашивали вторичными антителами anti-mouse-Alexa488 (17 с01220, Hansa BioMedLife Science, Эстония, 1нг/мл) 1 ч, 4°С и визуализировали на проточном цитометре CytoFlex (Beckman Coulter, США) при лазере 480 нм, накапливая 20000 событий.

На Фиг. 3 показаны данные проточной цитометрии при визуализации стабилин-1 МАТ ТШК 10 на поверхности макрофагов человека. Представленные на цитограммах интенсивности флюоресценции макрофагов человека, связавших тестируемые МАТ ТШК 10, более чем в 100 раз превышают интенсивность флюоресценции макрофагов человека, не специфически окрашенных только вторичными антителами (контроль). Таким образом, результаты приведенные на Фиг. 3, свидетельствуют о том, что тестируемые антитела ТШК 10 связываются на поверхности клеток первичной культуры макрофагов человека.

Пример 4. Анализ связывания антител ТШК 10 с антигеном стабилин-1 в клетках опухолевого узла в модели лабораторных животных

Для оценки биораспределения МАТ ТШК 10 к рецептору стабилин-1 в организме здоровых животных и животных с формировавшимся опухолевым узлом использовали самцов линии DBA/BALB. Исследование проводилось в соответствии с правилами проведения манипуляций с лабораторными животными и с соблюдением биоэтики. Соответствующие протоколы экспериментов были одобрены комитетом по биоэтике Отделения молекулярной и радиационной биофизики НИЦ «Курчатовский институт» -ПИЯФ. Мышам подкожно вводили 2×10⁵ клеток рака кишечника мыши СТ-26 на мышь. Через 5 дней после прививки опухоли проводили внутривенное введение МАТ ТШК 10 (80 мкг/мышь). Флуоресцентный прижизненный имиджинг лабораторных мышей линии DBA/BALB через 48 часов после внутривенного введения мАТ ТШК10 к рецептору стабилин-1 (80 мкг/мышь), меченных флюорохромом Cyanine7 (Люмипроб РУС, Россия), проводили на системе доклинической визуализации люминесценции и флуоресценции LumoTrace FLUO (Abisense, Сириус, Россия). Результаты проведенного анализа, представленные на Фиг. 4, показывают, что тестируемые антитела ТШК 10 связываются и накапливаются в клетках опухолевого узла в модели рака кишечника СТ-26 in vivo.

Пример 5. Определение нуклеотидных последовательностей и анализ генов вариабельных областей легкой и тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела ТШК 10

Рибонуклеиновую кислоту (РНК) из клеток клона ТШК 10 выделяли с помощью набора GeneJET RNA Purification kit (Thermo scientific, Lithuania) и затем на матрице данной РНК методом обратной транскрипции получали кДНК с помощью праймера oligo(dT)18 и обратной транскриптазы MMLV (ЗАО «Евроген», Росссия) по инструкции изготовителя. Далее с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПНР) с использованием известных наборов праймеров и высокоточной смеси ДНК- полимераз High Fidelity PCR Enzyme Mix (Thermo scientific, Lithuania) получали фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей антитела. ПЦР-продукты вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов анализировали с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле. Полосы продуктов ожидаемого размера в районе 450 пар оснований вырезали из геля, элюировали с помощью набора реагентов для выделения ДНК из агарозного геля (ЗАО «Евроген», Россия). После этого полученные ПЦР-продукты анализировали секвенированием. Секвенирование проводили на капиллярном секвенаторе АВ3500 (Applied Biosystems, США) с помощью коммерческого набора BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), очистку образцов перед анализом проводили с помощью набора BigDye® XTerminator™ Purification Kit (Applied Biosystems, США).

Найденные последовательности полученных фрагментов ДНК, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела ТШК 10 представлены в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 соответственно.

Функциональный и структурный анализ вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепи исследуемого антитела, проведенный с помощью инструмента IMGT/V-QUEST и базы данных IMGT [www.imgt.org], показал расположение рамочных и образующих комплементарность участков (CDR-участков). Найденные последовательности CDR-участков представлены в SEQ ID NO: 3-5 и SEQ ID NO: 6-8 для тяжелой и легкой цепей соответственно.

Таким образом, заявляемые антитела против рецептора стабилин-1 человека, являются новыми моноклональными мышиными антителами МАТ ТШК 10 с полученной аминокислотной последовательностью, имеющими изотип IgG2a и обладающими при этом специфичностью и высокой аффинностью к стабилин-1 человека (Kd=2.23*10^-12 М), а также связывающего нативный стабилин-1 на поверхности макрофагов человека. Вместе с тем, МАТ ТШК 10 эффективно накапливается в области опухолевого узла перевитых клеток рака кишечника мыши в экспериментах in vivo. Полученное МАТ ТШК 10 может быть использовано для получения химерных и гуманизированных антител и адресной доставки с их помощью тераностического радиофармацевтического препарата или цитотоксических веществ к опухоли.

Финансирование: работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, соглашение №075-15-2021-1360 от 12.10.2021.

Антитела против рецептора стабилин-1 (stabilin-1) человека

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра (НИЦ «Курчатовский институт» - ПИЯФ)

Petersburg Nuclear Physics Institute named by B.P. Konstantinov of National Research Centre «Kurchatov Institute)) (NRC «Kurchatov Institute)) - PNPI)

Перечень последовательностей антитела против рецептора стабилин-1 (stabilin-1) человека

Последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 - ТШК 10

Последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 - ТШК 10

Последовательность аминокислот участка CDR-1 вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 - ТШК 10

Последовательность аминокислот участка CDR-2 вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 -ТШК 10

Последовательность аминокислот участка CDR-3 вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 -ТШК 10

Последовательность аминокислот участка CDR-1 вариабельной области легкой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 - ТШК 10.

Последовательность аминокислот участка CDR-2 вариабельной области легкой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 - ТШК 10

Последовательность аминокислот участка CDR-3 вариабельной области легкой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 - ТШК 10

--->

Перечень последовательностей

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="ТШК10.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-04-19">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023135667/20(077963)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-28</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantNamelanguageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П.

Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский

институт»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Petersburg Nuclear Physics Institute named by

B.P. Konstantinov of National Research Centre &quot;Kurchatov

Institute&quot; (NRC &quot;KurchatovInstitute&quot; -

PNPI)</ApplicantNameLatin>

<InventionTitlelanguageCode="ru">Антителапротиврецептора

cтабилин-1 (stabilin-1) человека</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>

<SequenceDatasequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>360</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..360</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacaga

gcctgtccatcacatgcactgtctcagggttctcattaactagcgatggtgtaagctggtttcgccagcc

tccaggaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtgacgggagcacaaattatcattcagctctc

atatccagactgagcatcagcaaggataactccaagagccaagttttcttaaaactgaacagtctgcaaa

ctgatgacacagccacgtactactgtgccaaaccttattactacggtagtaggtggtacttcgatgtctg

gggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceDatasequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>321</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..321</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggag

acagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagcaattatttaaactggtttcagcagaaacc

agatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccagcaaggttcagt

ggcagtgggtctggaacagattactctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttact

tttgccaacagggtaaaacgcttccgctcacgttcggagctgggaccaagctggggctgaaa</INSDSe

q_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceDatasequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GFSLTSDG</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceDatasequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>7</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..7</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>IWGDGST</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceDatasequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>14</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..14</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>AKPYYYGSRWYFDV</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceDatasequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>6</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..6</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QDISNY</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceDatasequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length/>

<INSDSeq_moltype/>

<INSDSeq_division/>

<INSDSeq_sequence>000</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceDatasequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QQGKTLPLT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к моноклональному антителу, способному специфически связываться с рецептором стабилин-1 человека, а именно мышиным моноклональным антителам против стабилин-1. Антитела против рецептора стабилин-1 человека с высокой аффинностью с K_D=2.23×10^-12 М связывают рекомбинантный белок стабилин-1 человека и нативный стабилин-1 на поверхности макрофагов человека, обеспечивая накапливание антител в опухолевом узле. Изобретение может быть эффективно использовано для лечения заболеваний, ассоциированных со стабилин-1 человека. 4 ил.

Моноклональное антитело, способное специфически связываться со стабилин-1 человека, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 1, вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 2, гипервариабельные участки тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 3-5 и гипервариабельные участки легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 6-8.