СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОГО РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ IN-SITU (FISH) Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 G01N21/64 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и ветеринарных лабораториях для диагностики репродуктивно респираторного синдрома свиней (РРСС) в гистологических срезах органов-мишений путем выявления генетического материала вируса в инфицированных клетках при помощи метода гибридизации in-situ, основанном на применении меченного флуоресцеином нуклеотидного зонда.

Предложенный способ разработан в рамках темы гранта: Проект N 075-15-2021-948 (вн. №13.2251.21.0017). Тема: Использование передовых технологий скрининга патогенов окружающей среды и свиней для лучшего контроля заболеваний в стадах свиней. Обладает высокой специфичностью и чувствительностью, позволяет с точностью выявлять локализацию вируса, а также проводить дифференциальную диагностику РРСС от других возбудителей инфекций свиней со схожей клинической картиной.

Уровень техники

Для диагностики РРСС используют разнообразные лабораторные методы, направленные на выделение вируса, обнаружение его антигена или нуклеотидной последовательности. Среди исследований, направленных на достижение данной цели, применяют выделение вируса в клеточных культурах, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА), флуоресцентную гибридизацию in-situ и иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.researchgate.net/publication/355234953 In Situ Hybridization of PRRSV-1 Combined with Digital Image Analysis in Lung Tissues of Pigs Challenged with PRRSV-1; Stafford V.V., Yuzhakov A.G., Raev S.A., Alekseev K.P., Kostina L.V., Streltsova Ya.B., Zaberezhniy A.D., Aliper T.I. immunohistochemical diagnostics of porcine reproductive and respiratory syndrome. В сборнике: ЮР Conference Series: Earth and Environmental Science. Krasnoyarsk Science and Technology City Hall of the Russian Union of Scientific and Engineering Associations. - 2019. - C. 22044.].

Реализацию метода гибридизации in-situ для диагностики РРСС иностранные коллеги осуществляют следующим образом. Патологический материал от вскрытых свиней фиксируют в забуференном нейтральном 10% растворе формалина. Все растворы, применяемые в предварительной обработке срезов и, непосредственно, в гибридизации in situ, готовят на воде, содержащей 0,1% DEPC. Срезы тканей толщиной 5 мкм гидратируют и стабилизируют в PBS 3 минуты. Депротеинизацию проводят в растворе 0,2N HCl в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем срезы промывают водой, содержащей DEPC в течение 1 минуты. Далее следует обработка раствором протеинкиназы К (20 мкг протеинкиназы в 1 мл ФСБ) при температуре 37С,с экспозицией 20 мин. Следующим этапом идет обработка срезов РНКазой A (Boehringer Mannheim) при 10 мкг/мл в 10 мл Трис-HCl (рН 7,4) в течение 10 минут для удаления РНК-мишеней в качестве контроля специфичности. Далее срезы фиксируют в 4% растворе параформальдегида, растворенном в ФСБ в течение 5 минут. После чего предметные стекла двукратно промывают в ФСБ и ацетилировали в 300 мл 0,1 мм тетраноламин-HCl буфера (рН 8,0), к которому добавили 0,75 мл уксусного ангидрида (0,25%), далее срезы двукратно промывают в растворе SSC (SSCxl в 150 мл HCl + 15 мл цитрата натрия) (Рн 7,0).

В ходе предварительной гибридизации на предметные стекла наносят по 200 мкл специальной смеси. Данный раствор содержал: 50% денонсированного формамида, 4xSSC, 10% раствор сульфата декстрана, 1х Денхардта (0,02 Фиколл 400; 0,02% поливинилпирролидон; 0,02% бычий альбумин), 2 мл FDTA, 500 мкг ДНК семенников лосося (Sigma) в 1 мл. Срезы с описанным раствором выдерживают в условиях влажной камеры в течение 1 часа при температуре 65°С. Дополнительно применяют гетерологичный ДНК зонд 346 hp из гена гликопротеина gG в качестве контраста специфичности. Меченые зонды (0,1 нг/мл) разводят в 300 мкл смеси для гибридизации, затем отжигают в нагревательном блоке при температуре 95°С. Перед нанесением на срезы раствор меченых зондов охлаждают на льду, а предметные стекла предварительно промывают в растворе 2xSSC. После раствор зондов в количестве 70 мкл наносят на срезы ткани, на всю ночь при температуре 6°С. После гибридизации срезы дважды промывают в SSCx4 в течение 5 минут при комнатной температуре, а после один раз в SSCx2 в течение 10 минут при температуре 37°С и один раз в SSCx0,2, содержащем 60% формамида - в течение 10 минут при температуре 37°С. После чего дважды повторяют обработку раствором SSCx2 в течение 5 минут при комнатной температуре, далее - дважды раствором SSCx0,2 в течение 5 минут при комнатной температуре, после чего срезы один раз промывают в буфере (100 мл малеиновой кислоты, 150 мл NaCl, Ph 7,5) в течение 5 минут при комнатной температуре.

Для уменьшения фонового окрашивания предметные стекла инкубируют в буфере II в течение 40 минут при комнатной температуре. Конъюгат щелочной фосфатазы против DIG разбавляют в буфере II и наносят на срезы. Инкубацию проводят в условиях влажной камеры при комнатной температуре. Перед всеми инкубациями следует промывка в буфере I (2 смены) в течение 5 минут при комнатной температуре и отдельно в буферном растворе, состоящем из 100 мл Трис-HCl, 100 мл NaCl, 50 мл MgCl₂ (Ph 9,5)- 10 минут.

После вышеописанной инкубации срезы тканей помещают на подложку с красящим раствором (в 10 мл буфера III растворены: 45 мг тетразола синего и 35 мг 5-метилхлор-3-индилифосфата, тилуолфосфата, 50 мг/мл диметилформамида). Экспозиция составляла 3-8 часов при отсутствии освещения. После чего предметные стекла обрабатывают ТЕ буфером (10 мл Трис-HCL, 1 мл ЭДТА, Ph 8,0). Дополнительное окрашивание осуществляют с использованием 0,5% метиленового зеленого, а затем срезы промывают в дистиллированной воде в течение 1 минуты и полностью высушивают.Затем предметные стекла помещают в ксилол, далее на срезы наносят монтирующую среду (Permount) и закрывают под покровное стекло. [Jung-Hyang Sur, Vicker L. Cooper, Judith A. Galeota, Richard A. Hesse, Allan R. Doster, Fernando A. Osorio. In Vivo Detection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus RNA by In Situ Hybridization at Different Times Postinfection. Journal of clinical microbiolody 34 (9). 1996. P. 2280-2286]. Данную разработку мы взяли за прототип.

На территории Российской Федерации для диагностики репродуктивного и респираторного синдрома свиней используют биопробу, полимеразную цепную реакцию, реакцию иммунофлюоресценции, реакцию нейтрализации, иммуноферментный анализ и иммуногистохимический способ [Стаффорд В.В., Раев С.А., Алексеев К.П., Южаков А.Г., Алипер Т.Н., Забережный А.Д., Гулюкин М.И., Верховский О.А. Иммуногистохимическая диагностика репродуктивного и респираторного синдрома свиней. Ветеринария. - 2017. - №2. - С. 26-30].

Технической проблемой является необходимость разработки меченного гибридизационного зонда комплементарного участку гена ORF7 вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для создания эффективного и доступного способа диагностики РРСС, для обнаружения генетического материала разных типов данного вируса (европейского и американского) в тканях и органах свиней, выполнимого в условиях гистологических лабораторий без использования дорогостоящих расходных материалов, и для расширения арсенала способов диагностики вирусного репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является выявление генетической последовательности вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в восприимчивых к вирусу клетках органов (легкое и бронхиальный лимфатический узел) и расширение арсенала способов диагностики РРСС.

Данный способ гибридизации in-situ позволяет определить локализацию генома вируса в клетках органов в организме, а также изучить патогенез болезни, сопоставить данные при комплексной диагностике, с патогистологическими изменениями, тем самым подтвердить патологическое влияние вируса на зараженные ткани и органы и поставить окончательный диагноз при латентном течении болезни. Использование данного способа важно для патоморфологических исследований и способствует точной дифференциальной диагностике, изучению патогенеза и иммунного ответа у больного животного.

Предложенный способ заключается в следующем.

Для выполнения гибридизации in-situ на нативных гистологических срезах органов свиней используют олигонуклеотидный ДНК зонд. Для получения гибридизационного ДНК зонда используют специфичный фрагмент размером 128 п.н., соответствующий участку гена ORF7 вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Для этого выполняли гнездовую ПЦР. Сайты связывания праймеров ORF7 полностью консервативны между последовательностями вируса РРСС европейского генотипа и американского генотипа (Lelystad М96262 и Amervac GU067771). Выделение РНК из штамма «Lelystad» вируса РРСС осуществляли при помощи коммерческого набора «РИБО преп» («ИнтерЛабСервис», Россия) по методике производителя.

В первом раунде ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) используют прямой праймер Fl 5'-GCTGTTAAACGRGGAGTGGT-3' (14564 14583) и обратный Rl 5'-TCGCCCTAATTGAATAGGTGACT-3' (15028-15050). Цифры в скобках относятся к последовательности вируса Lelystad (GenBank М96262). При этом реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 5 мкл образца, 5 мкл 5х буфера для ОТ-ПЦР (Диам, Россия), 0,5 мкл смесь dNTP (Диам, Россия), 12,1 мкл воды без нуклеаз, 0,25 мкл Taq-полимеразы (Диам, Россия), 0,125 MMLV-ревертазы и по 10 пМ прямого и обратного праймеров. Термический цикл состоит из следующих этапов: 50°С - 30 мин, 94°С - 5 мин, затем 25 циклов: 95°С - 30 с, 58°С - 30 с и 72°С - 90 с; в конце 72°С - 5 мин.

Во втором раунде проводят ПЦР с праймерами: прямым F2 5'-GCTCCGATGGGGAATGG-3' и обратным R2 5'-CCTGAGAAGCCACATTTTCC-3'. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 5 мкл образца, 2,5 мкл 10х буфер для ПЦР (Диам, Россия), 0,5 мкл смесь dNTP (Диам, Россия), 14,6 мкл воды без нуклеаз, 0,25 мкл Taq полимеразы (Диам, Россия) и по 10 пМ прямого и обратного праймеров. Термический цикл включает в себя: 94°С - 5 мин, затем 25 циклов: 94°С - 30 с, 59°С - 30 с и 72°С - 90 с; в конце 72°С - 5 мин. После амплификации выполняют электрофорез в 1% агарозном геле, приготовленном на трис-ацетатном буферном растворе (рН 8,0) с добавлением 40 мкл бромистого этидия на литр буфера. ПЦР-фрагмент, соответствующий по электрофоретической подвижности размеру в 128 п.н., вырезают и выделяют из геля при помощи набора «LumiPure» (Lumiprobe, Россия) согласно инструкции производителя.

Для мечения пробы ДНК с помощью ПЦР используют: Реакционная смесь содержит следующие компоненты: 4,0 мкл смеси флуоресцеин-12-dUTP 1/3, 2,5 мкл Taq-буфера (х10), по 1 мкл праймеров F2 и R2 до конечной концентрации каждого праймера 0.1-1 мкМ, 0,25 мкл Taq-полимеразы, 5 мкл матричной ДНК (0.02-0.15 мкг/25 мкл смеси), деионизированной воды до 25 мкл. Программа амплификации: 40 циклов: 94°С - 10 с; 55°С - 10 с; 72°С - 30 с, после последнего цикла инкубируют при 72°С - 3 мин.

Дополнительно нуклеотидную последовательность зонда определяют по методу Сэнгера с использованием набора «BigDye 3.1» (Applied Biosystems, США). В итоге получают нуклеотидную последовательность, которую используют в качестве меченного флуоресцеином зонда для реакции гибридизации in-situ:

После этого приступают ко второму этапу - реакции гибридизации in-situ. Методика заключается в следующем:

В качестве патологического материала для определения локализации генетического материала вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней от павших животных или вынужденно убитых берут легкое и бронхиальный лимфатический узел. Нативный патологический материал охлаждают в течение 6 часов в холодильной камере при температуре 4°С. Транспортировку проб выполняют в сумке-холодильнике с хладоэлементами, поддерживающими температуру 4°С на всем этапе перевозки. Затем для длительного хранения материал помещают в морозильную камеру низкотемпературного холодильника и хранят при температуре -70°С. Непосредственно перед исследованием пробы размораживают. Далее из отобранных органов иссекают необходимые образцы размером 0,5 см в длину и ширину и 2 см в толщину. Иссеченные участки органов фиксируют на столиках для криотомии, заполняя область между столиком и тканью специальным криогелем, так чтобы на одном столике был образец легкого и образец бронхиального лимфатического узла, получая тем самым 1 блок с 2 видами тканей. Столики с объектами помещают в камеру криостата при температуре -34°С на 60 минут. Из готового блока нарезают срез толщиной 10 микрон и наклеивают на поляризированное стекло. После этого обрабатывают срезы смесью изопропилового спирта 70 мл и физиологического раствора 30 мл, 1 час при 4°С. Затем промывают их в 0,1М ФСБ 3 раза по 5 минут в каждой порции при комнатной температуре.

Приготовление 0,1М ФСБ для отмывки срезов:

Na₂HPO₄*12H₂O - 1,79 г/500 мл,

NaH₂PO₄*2H₂O - 0,78 г/500 мл,

рН=7.0.

Затем срезы ополаскивают в 4% растворе параформальдегида 15 минут при температуре +4°С. Пропись раствора:

40% параформальдегид - 4 г растворяют в 100 мл 0,1 М ФСБ при помощи кипячения.

Перед использованием охлаждают раствор во льду.

После этого промывают в 0,1М ФСБ 3 раза по 5 минут. Готовят раствор протеиназы К в ФСБ из расчета 5 мкл на 1 мл 0,1М ФСБ. Общий объем раствора рассчитывают исходя из 0,3 мл на 1 стекло. Выдерживают в растворе протеиназы К 15 минут при комнатной температуре. Затем промывают в 0,1М ФСБ 3 раза по 5 минут. Готовят гибридизационный буфер (ГБ) рН=7.2:

Формамид 5 мл,

50% раствор декстрана сульфата натрия на дистиллированой воде - 1 мл,

0,1 М ФСБ 1 мл,

20хЦитратный буфер (ЦСБ) - 1 мл (87,5 г NaCl+44 г Na3цитрат *2H₂O + 400 мл бидистиллированной воды) - 1 мл,

Регулируют кислотность 37% HCl (12М=>1 мл HCl/11 мл H₂O=>1М).

Затем готовят гибридизационную смесь (ГС) из расчета:

Гибридизационный буфер 500 мкл,

Гибридизационный зонд 5 мкл.

Гибридизационную смесь наносят на стекла в количестве 200 мкл на срез, закрывают покровным стеклом и запечатывают резиновым клеем. Помещают в чашки Петри на подставках на нагревательный столик при 96°С на 15 минут. После инкубации в ГС снижают температуру до 37°С и переносят чаши в термостат, на 16 часов при 37°С.

По истечении 16 часовой инкубации аккуратно размонтируют срезы от покровного стекла в трех порциях 4хЦСБ по 5 минут в каждой:

20хЦСБ - 60 мл,

H₂O бидистиллированная - 240 мл.

И затем сразу помещают в формамидно-солевую смесь и ополаскивают при комнатной температуре 3 раза по 10 минут в каждой порции:

Формамид - 150 мл,

20хЦСБ - 60 мл,

H₂O бидистиллированная - 90 мл.

После этого срезы вновь ополаскивают в 4х ЦСБ 3 раза по 5 минут при комнатной температуре. Затем срезы инкубируют в Трис-HCl буфере 30 минут при комнатной температуре и монтируют их покровным стеклом на флуоресцентную монтирующую среду. Пропись Трис-HCl буфера:

50 μМ Трис HCl - 5 мл,

100 μМ NaCl - 0.58 г,

H₂O бидистиллированная до 100 мл.

Данный способ применим для гибридизации in-situ на нативных криосрезах легкого, бронхиального лимфатического узла и других органов с использованием гибридизационного зонда комплементарного участку гена ORF7 вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Детекция нуклеотидной последовательности вируса происходит в цитоплазме восприимчивых клеток зараженных органов путем визуализации флуоресцентной метки гибридизационного зонда в виде ярко-зеленого свечения в потоке ультрафиолетового луча с длиной волны 480 нм. При использовании предложенного способа при положительной реакции визуализируется флюоресцентная метка, в виде изумрудно-зеленого свечения в цитоплазме восприимчивых клеток (фиг. 1-2).

Сектор патоморфологии ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН успешно апробировал вышеуказанный способ диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней при выполнении грантовой темы (Проект N 075-15-2021-948 (вн. №13.2251.21.0017)), в научной и практической деятельности. Согласно результатам испытаний, данный способ исследования может быть рекомендован для применения в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.

Осуществление изобретения иллюстрируется следующим примером.

Пример №1

От 40 павших свиней был отобран свежий материал для исследования (легкое и бронхиальный лимфоузел), в течение 12 часов материал был доставлен в лабораторию в сумке холодильнике, в плотно закрытой таре при 4°С. В лаборатории с соблюдением правил асептики и антисептики, иссекли образцы размером 0,5 см на 0,5 см из каждого органа, приморозили их к криотомным столикам в камере криостата и нарезали по 1 срезу на стекло из каждого блока. Срезы толщиной 10 микрон, поместили на поляризованные стекла, высушили. После этого срезы обрабатывали смесью изопропилового спирта 70 мл и физиологического раствора 30 мл, 1 час при 4°С. Затем промывали их в 0,1 М ФСБ 3 раза по 5 минут в каждой порции при комнатной температуре. После ополаскивали в 4% растворе параформальдегида 15 минут при температуре +4°С. И промывали в 0,1М ФСБ 3 раза по 5 минут. Далее готовили раствор протеиназы К в ФСБ из расчета 5 мкл на 1 мл 0,1 М ФСБ. Общий объем раствора рассчитывали исходя из 0,3 мл на 1 стекло. Выдерживали в растворе протеиназы К 15 минут при комнатной температуре. Затем промывали в 0,1М ФСБ 3 раза по 5 минут. Во время ополаскиания в ФСБ готовили гибридизационный буфер (ГБ) рН=7.2 и гибридизационную смесь. ГС наносили на стекла в количестве 200 мкл на стекло, закрывали покровным стеклом и запечатывали резиновым клеем. Монтированные стекла помещали в чашки Петри на подставках на нагревательный столик при 96°С на 15 минут. После периода инкубации в ГС снижали температуру столика до 37°С затем переносили чашки в термостат при температуре 37°С на 16 часов. По истечении заданного времени инкубации, аккуратно размонтировали срезы от покровного стекла окуная их в разные порции в 4х ЦСБ 3 раза по 5 минут. После последней порции, стекла со срезами сразу помещали в формамидно-солевую смесь и ополаскивают при комнатной температуре 3 раза по 10 минут в каждой порции. После этого, срезы вновь ополаскивали в 4х ЦСБ 3 раза по 5 минут при комнатной температуре. Затем инкубировали их в Трис-HCl буфере 30 минут при комнатной температуре и монтировали их покровным стеклом на флуоресцентную монтирующую среду.

В результате исследования материала, было выявлено, что 32 свиньи было инфицировано вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

Положительный результат реакции на наличие генома вируса РРСС продемонстрирован на фигурах 1 и 2, где четко визуализируется изумрудно-зеленое свечение в цитоплазме восприимчивых клеток. При получении отрицательного результата исследования на наличие генома вируса участки изумрудно-зеленого свечения отсутствуют, что наглядно показано на фигурах 3, 4.

Пример №2. Получение гибридизационной смеси

Для выполнения исследования нативных гистологических образцов от 40 павших свиней (легкое, бронхиальный лимфатический узел) потребовалось 8,08 мл гибридизационной смеси. Для этого вначале мы приготовили гибридизационный буфер с рН=7.2, состоящий из 15 мл формамида, 3 мл 50% раствора декстрана сульфата натрия на дистиллированной воде, 3 мл ОДМ ФСБ, 3 мл 20хЦСБ. Затем из получившегося объема отбирали 8 мл в отдельную емкость и добавляли 80 мкл гибридизационного зонда для получения гибридизационной смеси.

Пример №3. Получение гибридизационного зонда

Для приготовления 8,08 мл объема гибридизационной смеси потребовалось приготовить 80 мкл гибридизационного зонда. Для этого, необходимый объем нарабатывали исходя из строгой схемы количества веществ, и этапов наработки, описанных ниже. Таким образом, для получения олигонуклеотидного ДНК зонда соответствующего специфичному фрагменту размером 128 п.н. участка гена ORF7 вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней выполняли гнездовую ПЦР с помощью коммерческого набора «РИБО-преп» («ИнтерЛабСервис», Россия) по методике производителя.

В первом раунде ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) использовали прямой праймер Fl 5'-GCTGTTAAACGRGGAGTGGT-3' (14564-14583) и обратный Rl 5'-TCGCCCTAATTGAATAGGTGACT-3' (15028-15050). При этом реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 5 мкл образца, 5 мкл 5х буфера для ОТ-ПЦР (Диам, Россия), 0,5 мкл смесь dNTP (Диам, Россия), 12,1 мкл воды без нуклеаз, 0,25 мкл Taq-полимеразы (Диам, Россия), 0,125 MMLV-ревертазы и по 10 пМ прямого и обратного праймеров. Термический цикл состоял из следующих этапов: 50°С - 30 мин, 94°С - 5 мин, затем 25 циклов: 95°С - 30 с, 58°С - 30 с и 72°С - 90 с; в конце 72°С - 5 мин.

Во втором раунде проводили ПЦР с праймерами: прямым F2 5'-GCTCCGATGGGGAATGG-3' и обратным R2 5'-CCTGAGAAGCCACATTTTCC-3'. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 5 мкл образца, 2,5 мкл 10х буфер для ПЦР (Диам, Россия), 0,5 мкл смесь dNTP (Диам, Россия), 14,6 мкл воды без нуклеаз, 0,25 мкл Taq полимеразы (Диам, Россия) и по 10 пМ прямого и обратного праймеров. Термический цикл включал в себя: 94°С - 5 мин, затем 25 циклов: 94°С - 30 с, 59°С - 30 с и 72°С - 90 с; в конце 72°С - 5 мин. После амплификации выполняли электрофорез в 1% агарозном геле, приготовленном на трис-ацетатном буферном растворе (рН 8,0) с добавлением 40 мкл бромистого этидия на литр буфера. ПЦР-фрагмент, соответствующий по электрофоретической подвижности размеру в 128 п.н., вырезали и выделяли из геля при помощи набора «LumiPure» (Lumiprobe, Россия) согласно инструкции производителя.

Для мечения пробы ДНК с помощью ПЦР использовали: Реакционную смесь содержащую следующие компоненты: 4,0 мкл смеси флуоресцеин-12-dUTP 1/3, 2,5 мкл Taq-буфера (х10), по 1 мкл праймеров F2 и R2 до конечной концентрации каждого праймера 0.1-1 мкМ, 0,25 мкл Taq-полимеразы, 5 мкл матричной ДНК (0.02-0.15 мкг/25 мкл смеси), деионизированной воды до 25 мкл. Программа амплификации: 40 циклов: 94°С - 10 с; 55°С - 10 с; 72°С - 30 с, после последнего цикла инкубируют при 72°С - 3 мин.

Дополнительно нуклеотидную последовательность зонда определяли по методу Сэнгера с использованием набора «BigDye 3.1» (Applied Biosystems, США). В итоге получают нуклеотидную последовательность, которую использовали в качестве меченного флуоресцеином зонда для реакции гибридизации in-situ:

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - Легкое. Положительный результат FISH с ярким свечением флуоресцентной метки при гибридизации зонда с геномом вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в цитоплазме восприимчивых клеток. Ув. 630х.

Фиг. 2 - Бронхиальный лимфатический узел. Положительный результат FISH с ярким свечением флуоресцентной метки при гибридизации зонда с геномом вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в цитоплазме восприимчивых клеток. Ув. 630х.

Фиг. 3 - Легкое. Отрицательный результат гибридизации зонда с геномом вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в цитоплазме восприимчивых клеток. Ув. 630х.

Фиг. 4 - Бронхиальный лимфатический узел. Отрицательный результат гибридизации зонда с геномом вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в цитоплазме восприимчивых клеток. Ув. 630х.

--->

Перечень последовательностей

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОГО

РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ

ГИБРИДИЗАЦИИ IN-SITU (FISH).xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-12-27">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023128914</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-08</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>0</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ

БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ &quot;ФЕДЕРАЛЬНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР -

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ

ВЕТЕРИНАРИИ ИМЕНИ К.И. СКРЯБИНА И Я.Р. КОВАЛЕНКО РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ

НАУК&quot; (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal Scientific Centre VIEV (FSC

VIEV)</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОГО

РЕПРОДУКТИВНО - РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ С ПОМОЩЬЮ

ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ IN-SITU (FISH)</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>128</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..128</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>complementary section of the ORF7 gene of

the porcine reproductive and respiratory syndrome

virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctccgatggggaatggccagccagtcaatcaactgtgccagttgctgg

gtgcaatgataaagtcccagcgccagcaacctaggggaggacaggccaaaaagaaaaagcctgagaagcc

acattttcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу диагностики вирусного репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Указанный способ основан на флуоресцентной гибридизации in-situ (FISH) и включает использование гибридизационного ДНК зонда комплементарного к участку гена ORF7 вируса, причем в качестве гибридизационного зонда используется нуклеотидная последовательность с флуоресцеин-12-dUTP красителем. Изобретение обеспечивает выявление генетической последовательности вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в восприимчивых к вирусу клетках органов (легкое и бронхиальный лимфатический узел) и расширение арсенала способов диагностики РРСС. 4 ил., 3 пр.

Способ диагностики вирусного репродуктивно-респираторного синдрома свиней с помощью флуоресцентной гибридизации in-situ (FISH), включающий использование гибридизационного ДНК зонда комплементарного к участку гена ORF7 вируса, отличающийся тем, что объектом исследования являются нативные криотомные срезы из легкого и бронхиального лимфатического узла, а в качестве гибридизационного зонда используется нуклеотидная последовательность с флуоресцеин-12-dUTP красителем, детектируемым в ультрафиолетовом свете микроскопа в виде изумрудно-зеленого свечения внутри восприимчивых клеток.