Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления и генотипирования вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней первого типа в полимеразной цепной реакции Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и молекулярной биологии, может быть использовано для выявления РНК вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней первого типа и последующего генотипирования при помощи филогенетического анализа. Изобретение может быть использовано специалистами научно-исследовательских учреждений, ветеринарных диагностических лабораторий, занимающихся изучением инфекционных болезней и их возбудителей. Репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС) остается одной из наиболее экономически значимых вирусных болезней свиней для современного промышленного свиноводства. Заболевание проявляется различными симптомами в зависимости от возраста животных. При заражении свиноматок заболевание проявляется репродуктивными проблемами. Наблюдаются аборты во второй половине супоросности, рождения слабых поросят, мертворождение и мумификация плодов. У поросят болезнь проявляется как системными (лихорадка, анорексия, цианоз, вялость), так и респираторными симптомами (одышка, тахипноэ, кашель), а также повышенной смертностью на фоне вторичных бактериальных инфекций.

По современной классификации возбудителями относятся к двум разным видам вирусов, относящихся к семейству Arteriviridae роду Betaarterivirus, Betaarterivirus suid 1 (вРРСС-1, европейский вид) и Betaarterivirus suid 2 (вРРСС-2, американский вид). Вирусный геном представлен линейной молекулой РНК положительной полярности длинной около 15000 нуклеотидов На 5' конце генома находится кэп, 3' конец полиаденилирован. Геном вирусов РРСС является крайне изменчивым, он содержит по меньшей мере 10 открытых рамок считывания, две из них занимают первые две трети генома и кодируют неструктурные белки ответственные за репликацию вируса в клетке. Основные структурные белки кодируются генами, расположенными в последней трети генома.

Филогенетический анализ последовательностей гена ОРС7 показал, что Европейские вирусы РРСС разделены натри генотипа, вРРСС-1.1, 1.2 и 1.3. У вирусов из разных генотипов оказалась разная длинна капсидного белка, 128, 125 и 124 аминокислоты, и соответственно гена ОРС7, который этот белок кодирует. К первому генотипу относились вирусы, широко распространенные в Европе и родственные штамму Lelystad. Интересно, что вирусы генотипов 2 и 3 обнаруживаются только в странах восточнее Польше, в Литве, Беларуси, Украине и России. Дальнейшее изучение вирусов из этих стран показало, что ситуация с генотипом 1 также не однозначна, если при анализе последовательностей гена ОРС7 вирусы из России относились к первому генотипу, то при анализе последовательностей гена ОРС5 тех же вирусов, они были ближе к вирусам второго и третьего генотипа. Эти вирусы формировали так называемую «Российскую» группу вирусов, так как не обнаруживались больше ни в одной стране мира. Показано, что вирусы как Европейского вида значительно отличаются по патогенным свойствам, в зависимости от генотипа, что обуславливает важность определения циркулирующего генотипа в хозяйстве.

Получение олигонуклеотидных синтетических праймеров и применение их для постановки ОТ-ПЦР и последующего филогенетического анализа позволит дополнить и усовершенствовать методы изучения вирусов РРСС-1 и диагностики репродуктивного и респираторного синдрома свиней - одной из наиболее опасных, широко распространенных и экономически значимых проблемы в свиноводстве.

Уровень техники

Известен способ дифференциальной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней [патент № RU 2115929]. Способ дифференциальной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней от клинически сходных заболеваний путем выявления специфических антител гистохимическим вариантом иммуноферментного анализа, включающий использование культуры клеток, инфицированной вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней, фиксацию данной культуры, инкубирование ее последовательно с исследуемыми сыворотками и антисвинными ПХ-иммуноглобулинами, обработку субстратом, отличающийся тем, что используют стандартную перевиваемую культуру клеток MARS-145, инфицированную вирусом репродуктивно-респираторного синдрома, которую фиксируют ацетоном, дифференцирую репродуктивно-респираторный синдром свиней от клинически сходных заболеваний при диагностическом титре 1:80 и выше. Способ крайне трудоемок и время затратен, занимает от 2-х недель до месяца.

Известен также способ диагностики репродуктивного респираторного синдрома свиней непрямым иммуногистохимическим анализом на основании моноклональных антител. Способ диагностики репродуктивного респираторного синдрома свиней непрямым иммуногистохимическим анализом на основании моноклональных антител, отличающийся тем, что в качестве патологического материала используют органы свиней, далее выявляют вирус непрямым иммуногистохимическим способом, в качестве моноклональных антител берут моноклон 4h7h9 для идентификации антигена rN вируса репродуктивного респираторного синдрома свиней и антитела с меткой пероксидазы хрена с последующей специфической окраской, и учетом результатов по выявлению конгломератов красно-кирпичного цвета. Данный способ пригоден для выявления и идентификации вирусных частиц РРСС в пораженных органах и тканях.

Кроме того, применяется способ ретроспективной диагностики репродуктивного и респираторного синдрома свиней путем выявления специфических вируснейтрализуюших антител у переболевших животных. Способ может быть использован не ранее, чем через 14-30 дней после исчезновения клинических признаков болезни. Этот способ не позволяет отличить вакцинированных животных от переболевших [Каньшина А.В., Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней: диссертация … кандидата ветеринарных наук: 16.00.03. - Владимир. 2004. - 124 с.].

Описанные выше способы занимают продолжительное время. Кроме того, отсутствие чувствительных перевиваемых культур клеток и ограниченный рост в перевиваемых культурах клеток большинства вариантов вирусов РРСС-1 существенно ограничивают возможность проведения лабораторных исследований.

Наряду с представленными выше способами применяется детекция геномов вирусов РРСС в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ПЦР) и ПЦР с кДНК вируса.

Известен способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени [патент RU 2761496 C2]. Способ заключается в предварительном отборе крови и получении сыворотки крови, выделении вирусной РНК из сыворотки крови и осуществлении обратной транскрипции с проведением ПЦР в реальном времени. Для амплификации используются праймеры: прямой №1 (SEQ ID NO: I): TGGCTGCTGAAGATGA, прямой №2 (SEQ ID NO: 2): ACAGCTCCRATGGGGA, обратный (SEQ ID NO: 3): GAAGTCACGCGAATYA и TaqMan зонд (SEQ ID NO: 4): FAM-TGCAATCGATCCAGAC-BHQ1. К недостатком данного способа относится не возможность видовой дифференциации вРРСС.

Известен способ выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней [патент RU 2703394 C1]. Тест-система для выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающая буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней. TAQ POLYMERASE; буфер для разведения РНК, внутренний контрольный образец на основе бактериофага MS2 и положительный контрольный образец, состоящий из внутреннего контрольного образца на основе бактериофага MS2, европейского и американскою генотипов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и контрольных образцов, отличающаяся тем, что для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×10 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую фрагменты нуклеиновых кислот европейского и американского генотипов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и фрагмент генома нативного бактериофага MS2, взятые в соотношении 1:1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

EU-F: 5'-GCTGCYGAAGAYGAYATYCG-3' - прямой праймер

EU-R: 5'-AAGCRACGCAGTYCCYGC-3' - обратный праймер

EU-P: FAM-5'-CTGYTTGCAATCGATYCAGACDGC-3' -BHQ1

NA-F: 5'-GC 1 GGCRTTCTTSAGRCATCYC-3' - прямой праймер

NA-R: 5'-GRTCRCCCTAAMTGAATAGGTG-3' - обратный праймер

NA-P: HEX-5'-TGTGGTKAAYGGCACTGATTGACA-3' - BHQ 1

MS2F: 5'-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3' - прямой праймер

MS2R: 5'-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3' - обратный праймер

MS2P: Cy5-5'-CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3' - BHQ2.

Известно, что для генотипирования вирусов РРСС-1 ранее предлагали праймеры к различным областям генома. Stadejek et al. [Definition of subtypes in the European genotype of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: nucleocapsid characteristics and geographical distribution in Europe 4 Archives of Virology. 2008. №8 (153). C. 1479-1488] разработали праймеры для амплификации и генотипирования генов ОРС7 и ОРС5 с использованием двух раундовой ПЦР.

Технической проблемой является необходимость создания праймеров. позволяющих амплифицировать полные последовательности генов ОРС7 и OPC5 всех генотипов вРРСС-1.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является создание синтетических олигонуклеотидных праймеров, комплементарных областям генома вирусов РРСС-1, фланкирующих гены ОРС7 и ОРС5. Это позволяет нарабатывать фрагменты генома, содержащие полные последовательности генов ОРС5 и ОРС7 всех существующих генотипов вРРСС-1, и генотипировать циркулирующие изоляты методом филогенетического анализа.

Сущность изобретения заключается в том, что созданы синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные участкам генома вирусов РРСС-1, фланкирующих гены ОРС7 и ОРС5. Предлагаемые синтетические олигонуклеотидные праймеры имеют следующий нуклеотидную последовательность:

PRRSV-1 OPC7-F 5'-AGTGGTTAACCTCGTBAAGT-3'

PRRSV-1 OPC7-R 5'-TYGAATAGGTGACTYAGAGG-3'

PRRSV-1 OPC5-F 5'-TGGGCYACAACCATYGCTT-3'

PRRSV-1 OPC5-R 5'-ACACCTTHAGGGCRTATATCAT-3'

Выявление РНК вирусов репродуктивного и респираторного синдрома свиней первого типа проводят методом полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в термоциклере. В результате амплификации с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров синтезируются фрагменты двухцепочечной кДНК в количестве, превышающем 10⁹ раз и выше по сравнению с количеством исходной матрицы РНК. Результаты учитывают на основании наличия или отсутствия фрагментов ДНК специфического размера в гель-электрофорезе. Для гена ОРС7 размер фрагмента - 464-452 п.н., для гена ОРС5 - 743 п.н.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Для выбора праймеров проанализировали полные последовательности генома всех штаммов вРРСС-1, представленных в базе данных Gen Ban к [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/]. С помощью программы Primer Premier 5.0 были подобраны праймеры к участкам генома, фланкирующих гены ОРС7 и ОРС5 (Табл. 1).

Высокую специфичность праймеров подтвердили с помощью on-line ресурса BLAST(NCBI) [https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi]. Данные праймеры предназначены для постановки ОТ-ПЦР.

Пример 2. Постановка ПЦР включала выделение суммарной РНК из 100 мкл исследуемого материала с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (Амплисенс, Россия). ОТ-ПЦР проводили в объеме 20 мкл при помощи набора реагентов для проведения ОТ-ПЦР БиоМастер ОТ-ПЦР-Стандарт (2×) (ООО «Биолабмикс», Россия). Реакционная смесь содержала: 2× смесь для ОТ-ПЦР-Color - 10 мкл. БиоМастер-микс - 2 мкл, 10 пмоль каждого праймера, и 6 мкл выделенной РНК В каждой серии анализов использовали по 2 контрольных образца: отрицательный - деионизированная вода; положительный - РНК, выделенная из культуры клею к VIARC-145, зараженной штаммом Lelystad вРРСС-1.

Пример 3. ОТ-ПЦР проводили по протоколу, указанному в Табл. 2.

Пример 4. Электрофорез ДНК в агарозном геле. Весь объем реакционной смеси внести в лунки агарозного геля. Электрофорез проводили при напряжении 8 вольт/см длины геля до тех пор, пока краситель пройдет от старта не менее половины длины геля. Использовали трансиллюминатор с ультрафиолетовым светом с длинной волны 254 нм. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся красноватых полос. Результаты учитывали на основании наличия или отсутствия фрагментов ДНК специфического размера в гель-электрофорезе. Для гена ОРС7 размер фрагмента - 464-452 п.н., для гена ОРС5 - 743 п.н. Положительные полосы вырезают и выделяют из геля при помощи коммерческого набора, например «Cleanup S-Сар», (Евроген, Россия).

Пример 5. Выделенную ДНК использовали для постановки секвенирующей реакции с помощью набора набора для секвенирования ДНК «Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit». (Applied Biosystems. США), no методике производителя. Полученные нуклеотидные последовательности выравнивали относительно последовательностей генов ORF5 и ORF7 референтных штаммов из международной базы данных GtnBank в компьютерной программе MEGA (version 7.0.) с использованием алгоритма MUSCLE. Для построения филогенетической дендрограммы использовали ген ОРС5 длиной 606 п.о. (с 13494 по 14099 нуклеотиды) и ген ОРС7 длиной 387 п.о. (с 14598 по 14984 нуклеотиды). Нумерация по последовательности референтного штамма Lelystad (номер в базе данных GenBank М96262).

Для построения, филогенетических дендрограмм. при помощи компьютерной программы Mega (version 7.0.), в качестве референтных, использовали следующие штаммы вирусов РРСС: для генотипа 1.1. - штамм Lelystad (М96262), для генотипа 1.1, «российская» группа - штамм Tyu16 (МТ008024), 1.2. - WestSib13 (KX668221), 1.3. Lena - (JF802085); ВРРСС-2 - VR2332 (EF536003) (фиг. 1).

Графические материалы

Фигура. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе гена ORF7 референтных вирусов РРСС-1.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Набор

синтетических олигонуклеотидных праймеров для генотипирования вируса

репродуктивного и респираторного синдрома свиней перового типа в

полимеразной цепной реакции..xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-05-29">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024102410</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-01-31</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ

БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ &quot;ФЕДЕРАЛЬНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР -

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ

ВЕТЕРИНАРИИ ИМЕНИ К.И. СКРЯБИНА И Я.Р. КОВАЛЕНКО РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ

НАУК&quot; (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal Scientific Centre VIEV (FSC

VIEV)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Южаков Антон

Геннадиевич</InventorName>

<InventorNameLatin>Yuzhakov Anton Gennadievich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Набор синтетических

олигонуклеотидных праймеров для выявления и генотипирования вируса

репродуктивного и респираторного синдрома свиней перового типа в

полимеразной цепной реакции.</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>porcine reproductive and respiratory

syndrome virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agtggttaacctcgtbaagt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>porcine reproductive and respiratory

syndrome virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tygaataggtgactyagagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>porcine reproductive and respiratory

syndrome virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgggcyacaaccatygctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>porcine reproductive and respiratory

syndrome virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acacctthagggcrtatatcat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к областям ветеринарной вирусологии и молекулярной биологии. Описан набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней первого типа в полимеразной цепной реакции и последующего генотипирования по генам ОРС5 и ОРС7. Техническим результатом является создание синтетических олигонуклеотидных праймеров, комплементарных областям генома вирусов РРСС-1, фланкирующих гены ОРС7 и ОРС5, что позволяет нарабатывать фрагменты генома, содержащие полные последовательности генов ОРС5 и ОРС7 всех существующих генотипов вРРСС-1, и генотипировать циркулирующие изоляты методом филогенетического анализа. 1 ил., 2 табл., 5 пр.

Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней первого типа в полимеразной цепной реакции и последующего генотипирования по генам ОРС5 и ОРС7, имеющих следующий нуклеотидный состав: Seq_1; Seq_2; Seq_3; Seq_4.