Тест-система для выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней Российский патент 2019 года по МПК C12Q1/68 

Описание патента на изобретение RU2703401C1

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики вирусных и инфекционных заболеваний у животных, в частности к методам выявления РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС).

Известно использование тест-системы для генотипирования нуклеотидной последовательности в образце, включающем n образцов, пару или множество пар индексированных праймеров для каждого образца, причем каждая пара индексированных праймеров состоит из прямого индексированного праймера и обратного индексированного праймера, представляющие собой вырожденные праймеры (патент РФ 2587606, кл. C12Q 1/68, C12N 15/11, 2016 г.).

Известен набор для диагностики вирусных заболеваний методом ПЦР, известный из документа WO/2012/053666, в котором для проведения ПЦР используют так называемые «вырожденные», или «дегенеративные» праймеры, которые фактически представляют собой смесь олигонуклеотидов различной структуры, в той или иной степени специфичных к вирусной ДИК различных генотипов.

Наиболее близким по технической сущности является техническое решение (КОЗЛОВА А.Д., автореферат «Разработка ПЦР-тест-систем для идентификации парвовируса и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, Москва, 2014 г., стр. 10-13),включающее буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, TAQ POLYMERASE; буфер для разведения РНК, внутренний контрольный образец на основе бактериофага MS2 и положительный контрольный образец, состоящий из внутреннего контрольного образца на основе бактериофага MS2, европейского и американского генотипов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и контрольных образцов.

Недостатком известного технического решения является отсутствие возможности получения достоверной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней и выявление различных серотипов вируса.

Техническим результатом является обеспечение достоверной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней и выявление различных серотипов вируса.

Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающей буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичных для вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, TAQ POLYMERASE; буфер для разведения РНК, внутренний контрольный образец на основе бактериофага MS2 и положительный контрольный образец, состоящий из внутреннего контрольного образца на основе бактериофага MS2, европейского и американского генотипов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и контрольных образцов, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую фрагменты нуклеиновых кислот европейского и американского генотипов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и фрагмент генома нативного бактериофага MS2, взятые в соотношении 1:1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

EU-F: 5'-GCTGCYGAAGAYGAYATYCG-3' - прямой праймер

EU-R: 5' - AAGCRACGCAGTYCCYGC-3' - обратный праймер

EU-P: FAM-5' - CTGYTTGCAATCGATYCAGACDGC-3' -BHQ1

NA-F: 5' - GCTGGCRTTCTTSAGRCATCYC-3' - прямой праймер

NA-R: 5' - GRTCRCCCTAAMTGAATAGGTG-3' - обратный праймер

NA-P: НЕХ-5' - TGTGGTKAAYGGCACTGATTGACA-3'-BHQ1

MS2F: 5' - TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3' - прямой праймер

MS2R: 5' - GTACGGGCGACCCCACGATGAC - обратный праймер

MS2P: Су5-5' - CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3' - BHQ2.

Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, инфекции, вызываемой вирусом PRRSV, используют метод ПЦР с использованием вырожденных праймеров и зондов, что позволяет выявлять различные серотипы вируса. Также для получения достоверной диагностики вируса РРСС используют две последовательные реакции: обратной транскрипции вирусной РНК для получения кДНК и полимеразной цепной реакции для амплификации фрагмента полученной кДНК матрицы. Обе реакции проводятся последовательно в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с применением разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага MS2: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ОТ-ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации и возможность ошибки при переносе кДНК в другую пробирку для ПЦР. Кроме того, детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемую тест-система рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, а именно к средствам выявления и генотипирования вируса РРСС, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Сущность изобретения поясняется чертежом, где представлены скриншоты графиков: на фиг. 1 представлен канал JOE/Yellow для специфического сигнала американского генотипа (тип 1) вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней; на фиг. 2 представлен канал Cy5/Red - для тестирования сигнала внутреннего контрольного образца (ВКО); на фиг. 3 - FAM/Green для специфического сигнала европейского генотипа (тип 2) этого же вируса.

Пример конкретного использования тест-системы для выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней

Для синтеза кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции используют внутренний контрольный образец на основе бактериофага MS2 в виде суспензии с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов и положительный контрольный образец, состоящий из внутреннего контрольного образца в виде смеси, содержащей фрагменты нуклеиновых кислот европейского и американского генотипов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и фрагмента генома нативного бактериофага MS2, взятые в соотношении 1:1:1, если не будут соблюдаться данные соотношения, то будут наблюдаться повторности сомнительных образцов. Фрагменты нуклеиновых кислот европейского и американского генотипов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и фрагмент генома нативного бактериофага MS2 представлены следующими нуклеотидными последовательностями:

EU-F: 5' - GCTGCYGAAGAYGAYATYCG-3' - прямой праймер

EU-R: 5' - AAGCRACGCAGTYCCYGC-3' - обратный праймер

EU-P: FAM-5' - CTGYTTGCAATCGATYCAGACDGC-3' - BHQ1

NA-F: 5' - GCTGGCRTTCTTSAGRCATCYC-3' - прямой праймер

NA-R: 5' - GRTCRCCCTAAMTGAATAGGTG-3' - обратный праймер

NA-P: HEX-5' - TGTGGTKAAYGGCACTGATTGACA-3' - BHQ1

MS2F: 5' - TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3' - прямой праймер

MS2R: 5' - GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3'- обратный праймер

MS2P: Cy5-5' - CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3'-BHQ2.

Использование нативного бактериофага MS2, т.е. неповрежденного при исследовании обеспечивает стабильное состояние РНК, что улучшает синтез кДНК.

Для исследования по выбору используют следующий материал:

• Плазма крови, сыворотка крови. Кровь забирается в пробирку с 6% ЭДТА из расчета 50 мкл раствора ЭДТА на 1 мл крови, закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают. Для получения сыворотки забирают кровь в пробирку без антикоагулянта.

• Мазки со слизистой глотки и трахеи берут сухими ватными зондами. Зонд с материалом помещают для транспортировки в пробирки со стерильным физиологическим раствором (конец отламывают, что бы пробирку можно было закрыть);

• Сперму в объеме не менее 2 мл, в стерильную посуду;

• Плацента и плодовые оболочки от абортировавших животных берут на исследование целиком;

• Фрагменты тканей и органов павших животных (миндалины, селезенка, легкие, печень и др.) отбирают в стерильный контейнер.

Мазки и смывы, цельную кровь используют для выделения РНК без предварительной подготовки.

Для получения плазмы пробирку с цельной кровью центрифугируют в течение 10 мин при 1000 g (если кровь стояла при температуре от 2°С до 8°С более 1 ч после ее взятия, то пробирку следует аккуратно несколько раз перевернуть для равномерного перемешивания крови). Переносят плазму в количестве не менее 1 мл одноразовыми наконечниками с фильтром в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.

Для получения сыворотки пробирки с кровью (без антикоагулянта) отстаивают при комнатной температуре в течение 30 минут до полного образования сгустка. Затем центрифугируют при 600-1600 g (3000 об/мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 10 минут при комнатной температуре. Сыворотку переносят отдельными наконечниками с фильтром в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.

К образцу спермы добавляют 4 объема стерильного физиологического раствора, тщательно перемешивают и центрифугируют 5 мин при 10000 оборотов (на центрифуге MiniSpin, Eppendorf, Германия). Для экстракции РНК используют 100 мкл надосадочной жидкости.

Исследуемые пробы тканей и органов (небольшие кусочки до 1 г весом) гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков или автоматических гомогенизаторов. Затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 600-1600 g (3000 об/мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 2 мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции РНК.

Для проведения анализа используют набора реагентов «ПЦР-РРСС-ФАКТОР».

Исследование состоит из трех этапов:

- экстракция нуклеиновых кислот (НК), на этом этапе дополнительно используют реактивы для экстракции, например набор «ДНК/РНК-С-ФАКТОР»;

- проведение ОТ-ПЦР РВ;

- учет результатов анализа.

Набор позволяет специфически амплифицировать фрагмент генома вируса РРСС и генома внутреннего положительного контроля (бактериофага MS2) в мультиплексной полимеразной цепной реакции.

Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах:

1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)

2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы). Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.

Наборы используются в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-РРСС-ФАКТОР» для выявления РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в биологическом материале методом совмещенной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ОТ ПЦР РВ) ТУ 21.10.60-131-51062356-2017, для диагностики in vitro http://www. vetfaktor.ru/.

Реакция ОТ-ПЦР РВ проводится в одной пробирке.

Экстракция (выделение) НК из исследуемых проб

Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО), в качестве которого используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×10 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл РРСС.

Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы вносят ОКО (пробирку обозначить как ВК-).

Выделяют НК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.

Выделенную РНК можно хранить до 3 часов при температуре от 2°С до 8°С или в течение месяца при температуре не выше минус 70°С.

Подготовка образцов к проведению ПЦР

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем РНК-пробы - 10 мкл.

Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО) РРСС, ВКО РРСС и РНК буфера.

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:

10 мкл ПЦР БУФЕР РРСС

5 мкл ПЦР СМЕСЬ РРСС

0,75 мкл RTPCRENZ.

Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации НК исследуемых и контрольных проб и вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Используя наконечники с фильтром, в подготовленные пробирки вносят:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл РНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл НК соответствующей пробы (включая пробу ВК-);

в) в пробирку с положительным контролем ПЦР (К+) 10 мкл ПКО РРСС.

Проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией осуществляют с помощью прибора «Rotor-Gene Q».

Параметры температурно-временного режима амплификации на этом приборе представлены в таблице 3.

Далее помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора, программируют прибор согласно инструкции производителя.

Интерпретация результатов анализа

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала - анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору.

Накопление флуоресцентного сигнала измеряли по каналам: FAM/Green для специфического сигнала европейского генотипа (тип 1) вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней; JOE/Yellow для специфического сигнала американского генотипа (тип 2) этого же вируса и Cy5/Red для сигнала внутреннего контроля. Учет результатов ОТ-ПЦР РРСС РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца), если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считают положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции НК в соответствии с таблицей 4 и фиг. 1, 2, 3).

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на каналах FAM /Green, JOE (HEX)/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Образцы, для которых по каналу Cy5/Red значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (при этом по всем каналам FAM /Green, JOE (HEX)/YelIow и отсутствует значение Ct), требуют повторного проведения исследования. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале Cy5/Red указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при постановке реакции ОТ-ПЦР РРСС РВ. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции НК.

Результат амплификации кДНК вируса РРСС европейского генотипа (тип 1) регистрируется на канале FAM/Green, результат амплификации кДНК вируса РРСС американского генотипа (тип 2) регистрируется на канале JOE/Yellow, результат амплификации экзогенного ВКО регистрируется на канале Cy5/Red.

Образец считается положительным (РНК вируса репродуктивно-респираторный синдрома свиней присутствует), если наблюдается экспотенциальный рост сигнала на хотя бы одном из каналов FAM /Green, JOE (HEX)/YelIow, при этом значение Ct на данном канале, соответствующем амплификации кДНК вируса РРСС, определяется не позднее 37 цикла, a Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4, фиг 1, 2, 3).

Если для исследуемого образца по каналу (каналам) детектирующим наличие вируса РРРС (FAM /Green, JOE (HEX)/Yellow) значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct), тогда требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПНР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики.

При получении сомнительных результатов рекомендуется исследование смывов с поверхностей в лаборатории для исключения риска внутри лабораторной контаминации.

Образец считается отрицательным (НК вируса репродуктивно-респираторный синдрома свиней отсутствует) если не наблюдается рост сигнала флуоресценции ни на одном из каналов - FAM /Green, JOE (HEX)/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (см. Табл. 4, фиг. 1, 2, 3).

Для доказательства эффективности использования набора для ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с применением разных видов контроля с различными формами материала бактериофага MS2: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом проводился сравнительный анализ чувствительности и специфичности заявляемого с прототипом. В результате исследований чувствительность и специфичность заявляемого способа на 1,5-2% выше, чем у прототипа, а именно имеет чувствительность 104 коп/мл РНК вируса РРСС в крови, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 7×10 коп/мл в сперме.

Похожие патенты RU2703401C1

название год авторы номер документа
Способ выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней 2018
  • Баннов Василий Александрович
  • Черных Олег Юрьевич
  • Малышев Денис Владиславович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Дунин Иван Михайлович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Амерханов Харон Адиевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Дорожкин Василий Иванович
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Племяшов Кирилл Владимирович
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Бахарев Алексей Александрович
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Коломиец Сергей Николаевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Кривоногова Анна Сергеевна
RU2703394C1
Способ выявления генома возбудителя вируса парагриппа 3 типа у крупного рогатого скота 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Сочнев Василий Васильевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Иванов Аркадий Васильевич
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Калошкина Инна Муратовна
  • Кулакова Анна Леонидовна
RU2696069C2
Способ выявления генома возбудителя ротовирусной инфекции у сельскохозяйственных животных 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Василевич Федор Иванович
  • Стекольников Анатолий Александрович
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Морозов Виталий Юрьевич
  • Забашта Сергей Николаевич
  • Кулакова Анна Леонидовна
RU2689718C1
Тест-система для обнаружения генома вируса парагриппа 3 типа у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Клименко Александр Иванович
  • Девришов Давудай Абдулсемедович
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Калошкина Инна Муратовна
  • Забашта Сергей Николаевич
  • Кулакова Анна Леонидовна
RU2681473C1
Тест-система для выявления РНК вируса болезни Шмалленберга у сельскохозяйственных животных 2018
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Черных Олег Юрьевич
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Уша Борис Вениаминович
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Клименко Александр Иванович
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Юлдашбаев Юсупжан Артыкович
  • Гулюкин Алексей Михайлович
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кривоногова Анна Сергеевна
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Дельцов Александр Александрович
  • Дайбова Любовь Анатольевна
RU2694719C1
Способ выявления РНК вируса болезни Шмалленберга у сельскохозяйственных животных 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Василевич Федор Иванович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Гринь Светлана Анатольевна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кривоногова Анна Сергеевна
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Дорожкин Василий Иванович
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Семененко Марина Петровна
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Шкуратова Ирина Алексеевна
  • Дайбова Любовь Анатольевна
RU2696306C1
Тест-система для обнаружения генома возбудителя ротовируса типа А у сельскохозяйственных животных с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Джавадов Эдуард Джавадович
  • Макаров Юрий Анатольевич
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Морозов Виталий Юрьевич
  • Солдатенко Николай Александрович
  • Кулакова Анна Леонидовна
RU2694501C1
Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Уша Борис Вениаминович
  • Племяшов Кирилл Владимирович
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Мищенко Алексей Владимирович
  • Кулакова Анна Леонидовна
RU2694499C1
Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Мищенко Алексей Владимирович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лайшев Касим Анверович
  • Сисягин Павел Николаевич
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Чернов Альберт Николаевич
  • Кулакова Анна Леонидовна
RU2694558C1
Способ выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей 2018
  • Баннов Василий Александрович
  • Черных Олег Юрьевич
  • Малышев Денис Владиславович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Стекольников Анатолий Александрович
  • Уша Борис Вениаминович
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Иванов Аркадий Васильевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Калашникова Татьяна Валерьевна
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Барашкин Михаил Иванович
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Кузьминова Елена Васильевна
RU2700481C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 703 401 C1

Реферат патента 2019 года Тест-система для выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой тест-систему для выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающую буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, TAQ POLYMERASE; буфер для разведения РНК, внутренний контрольный образец на основе бактериофага MS2 и положительный контрольный образец, состоящий из внутреннего контрольного образца на основе бактериофага MS2, европейского и американского генотипов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и контрольных образцов, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую фрагменты нуклеиновых кислот европейского и американского генотипов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и фрагмент генома нативного бактериофага MS2, взятые в соотношении 1:1:1. Изобретение позволяет обеспечить достоверную диагностику репродуктивно-респираторного синдрома свиней и выявление различных серотипов вируса. 3 ил., 4 табл.

Формула изобретения RU 2 703 401 C1

Тест-система для выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающая буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, TAQ POLYMERASE; буфер для разведения РНК, внутренний контрольный образец на основе бактериофага MS2 и положительный контрольный образец, состоящий из внутреннего контрольного образца на основе бактериофага MS2, европейского и американского генотипов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и контрольных образцов, отличающаяся тем, что для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×10 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую фрагменты нуклеиновых кислот европейского и американского генотипов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и фрагмент генома нативного бактериофага MS2, взятые в соотношении 1:1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

EU-F: 5'-GCTGCYGAAGAYGAYATYCG-3' - прямой праймер

EU-R: 5'-AAGCRACGCAGTYCCYGC-3' - обратный праймер

EU-P: FAM-5'-CTGYTTGCAATCGATYCAGACDGC-3' -BHQ1

NA-F: 5'-GCTGGCRTTCTTSAGRCATCYC-3' - прямой праймер

NA-R: 5'-GRTCRCCCTAAMTGAATAGGTG-3' - обратный праймер

NA-P: НЕХ-5'-TGTGGTKAAYGGCACTGATTGACA-3'-BHQ1

MS2F: 5'-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3' - прямой праймер

MS2R: 5'-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3' - обратный праймер

MS2P: Су5-5'-CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3' - BHQ2.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2019 года RU2703401C1

КОЗЛОВА А.Д., Разработка ПЦР-Тест-систем для идентификации парвовируса и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, автореферат диссертации, Москва, 2014
НОВЫЙ СПОСОБ ПЦР-СЕКВЕНИРОВАНИЯ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В ГЕНОТИПИРОВАНИИ HLA 2011
  • Ли Цзянь
  • Чэнь Шипин
  • Чжан Сяндун
  • Лю Ин
  • Чжан Цайфэнь
  • Лю Тао
  • Чжао Мэйжу
RU2587606C2

RU 2 703 401 C1

Авторы

Черных Олег Юрьевич

Котельникова Александра Андреевна

Баннов Василий Александрович

Малышев Денис Владиславович

Дробин Юрий Дмитриевич

Донник Ирина Михайловна

Стекольников Анатолий Александрович

Уша Борис Вениаминович

Лысенко Александр Анатолиевич

Морозов Виталий Юрьевич

Кривонос Роман Анатольевич

Исаева Альбина Геннадиевна

Шевкопляс Владимир Николаевич

Кощаев Андрей Георгиевич

Барашкин Михаил Иванович

Дайбова Любовь Анатольевна

Кузьминова Елена Васильевна

Винокурова Диана Петровна

Даты

2019-10-16Публикация

2018-10-24Подача