Способ допплерографической оценки антиангиогенного действия в модели куриного эмбриона Российский патент 2024 года по МПК A61B8/06 A61M37/00 

Изобретение относится к экспериментальной биологии, медицине и фармакологии и может быть использовано при изучении механизмов действия новых цитостатиков с антиангиогенным эффектом.

Известен способ моделирования ангиогенеза и васкуляризации (реваскуляризации) глаза, зрительного нерва головного мозга и изучения гемодинамики во вновь образованных капиллярах, анастомозах и оболочках глаза кролика. Для этого проводят аутотрансплатнтацию сосудисто-мышечно-фасциального лоскута в склеру глаза экспериментального животного, в оболочки зрительного нерва или в клетчатку орбиты за тенонову оболочку. Аутотрансплантацию производят с наложением артериального и венозного анастомозов центрального конца лоскута с дополнительным источником питания или без наложения. Предлагаемый способ обеспечиваетмодель ангиогенеза с васкуляризацией, которая может быть использована для изучения ангио- и антиангиогенного действия новых лекарственных препаратов, (см. патент RU 2313134, МПК G09B 23/28 (2006.01), опубл. 20.12.2007 г.).

Недостатками указанного аналога являются сложность выполнения микрохирургических процедур на животных в специализированных помещениях, удовлетворяющих санитарным требованиям класса А, длительность исполнения метода, высокая трудоемкость при отслеживании изменений в динамике. Указанные обстоятельства увеличивают объем необходимых манипуляций с животными, требующими специального содержания и значительных трудозатрат высококвалифицированных специалистов.

Известен способ ингибирования глазного ангиогенеза у мышей. Для формирования модели ретинопатии недоношенных детенышей мышей помещают в атмосферу 75% кислорода с 7 по 12 сутки, после чего в стекловидное тело глаз грызунов вводят исследуемые ингибиторы ангиогенеза и возвращают мышей к нормальным условиям содержания. На 17-е сутки глаза извлекают и погружают их в 4% раствор параформа или фиксатор Давидсона для приготовления срезов. Гистологические срезы толщиной 16 микрон анализируют с помощью сканера AperioScanScope, оснащенного программным пакетом для количественного подсчета зон неоваскуляризации. (см. патент №2530583, МПК (2006.01), A61K 39/395 А61Р 27/00, опубл. 10.10.2014 г.).

Недостатками указанного аналога являются сложность выполнения микрохирургических процедур на животных в специализированных помещениях, удовлетворяющих санитарным требованиям класса А, длительность исполнения способа, необходимость использования дорогостоящего оборудования и программного обеспечения. Указанные обстоятельства увеличивают объем необходимых манипуляций с животными и требуют значительных трудозатрат высококвалифицированных специалистов.

Наиболее близким к данному техническому решению является способ тестирования активности ангиогенина на куриных эмбрионах, включающий отбор 6-дневных эмбрионов кур, которым на поверхности хорионаллантоисной оболочки размещают лигниновые диски, пропитанные исследуемым раствором (см. патент RU №2166511, МПК C07K 14/515 (2000.01), A61K 38/18 (2000.01), опубл. 10.05.2001 г.).

Недостатками прототипа являются длительность процедуры оценки анатомии сосудистой системы, включающей стадию извлечения и фиксации хорионаллантоисной оболочки, что исключает возможность исследования патофизиологии гемодинамики и снижает научную ценность получаемых результатов.

Технический результат предлагаемого технического решения заключается в высокой информативности, доступности инструментального обеспечения способа, его экспрессности и возможности изучения процесса во времени, а также снижении трудозатрат, поскольку исключает необходимость извлечения, фиксации и подсчета сосудов в хориоаллантоисной оболочке зародыша цыпленка.

Технический результат достигается тем, что в способе допплерографической оценки антиангиогенного действия в модели куриного эмбриона, включающем отбор 6-дневных эмбрионов кур, на поверхности хорионаллантоисной оболочки которых размещают лигниновые диски, пропитанные исследуемым раствором, согласно изобретению, 6-дневные яйца с эмбрионами дезинфицируют, затем выбирают место васкуляризации хорионаллантоисной оболочки и над ним вырезают часть яичной скорлупы, удаляют излишки белка, обеспечивая доступ к сосудам, экспозицию проводят в течение 24 часов, а лигниновые диски пропитывают исследуемыми раствором цитостатика, затем на место аппликации наносят гель для ультразвуковых исследований и под углом 60° к артериолам, соблюдая порядок бифуркации, располагают датчик с частотой 20-25 МГц, при этом на основании количественного анализа допплерограмм и осуществления визуальной оценки сосудистой сети на поверхности хорионаллантоисной оболочки яйца оценивают антиангиогенное действие цитостатика в модели куриного эмбриона.

Данный способ допплерографической оценки антиангиогенного действия в модели куриного эмбриона позволит повысить информативность, экспрессность и возможность изучения процесса во времени, а также снизить трудозатраты, поскольку исключает необходимость извлечения, фиксации и подсчета сосудов в хориоаллантоисной оболочке зародыша цыпленка.

Сущность способа допплерографической оценки антиангиогенного действия в модели куриного эмбриона поясняется таблицей, где приведены результаты исследования объема и скорости кровотока в малых артериях и фотографиями, где на фиг.представлены куриные эмбрионы (а - контрольные, б, в - опытные зародыши птиц), полученные на 6-е сутки эмбриогенеза (контроль: аппликация лигниновых дисков с физиологическим раствором; «Метотрексат 1:100, 1:50» - аппликация лигниновых дисков, импрегнированных 20 мкл раствора «Метотрексата» в соответствующем разведении физиологическим раствором, из исходного «Метотрексат Эбеве», раствора для инъекций 10 мг/мл; время экспозиции - 24 ч).

Развитие патологии сосудистой системы у эмбрионов курицы под воздействием «Метотрексата» (цитостатика из группы антиметаболитов -антагонистов фолиевой кислоты) сопровождается глубокими перестройками в гемодинамике и носит выраженную зависимость «доза-эффект». У эмбрионов контрольной группы (растворитель - физиологический раствор) сосудистая сеть развитая, соответствующая стадии образования внезародышевых органов, характеризуется высокой линейной и объемной скоростями кровотока. Экспозиция зародышей раствором цитостатика приводит к закономерному статистически значимому снижению средних объемной и линейной скоростей, изменениям индексов Гослинга и Пурсело. Так, при введении «Метотрексата» в низкой концентрации (см. таблицу, Опыт «МТХ 1:100») происходит компенсаторное повышение максимальной систолической скорости Vs на 24,2% (Р<0,05) на фоне снижения средних линейной (Vam) и объемной (Qam) скоростей кровотока на 9,9% (см. таблицу) - относительно эмбрионов контрольной группы. Максимальная диастолическая (Vd) скорость оказывается сниженной на 43,2% (Р<0,001), что в совокупности приводит к статистически значимому росту индекса циркуляторного сопротивления RI. Рост периферического сопротивления кровотоку может объясняться редукцией микрокапилляров, общая площадь которых превышает площадь поперечного сечения магистральных сосудов в 500 раз (см. http://minimax.ru/articles/general-informatiori/blood-flow.html?ysclid=lmgeaxphpk377720738).

Редукция микроциркуляторного русла (снижение общего объема сосудистого бассейна) сопровождается адаптивным ростом пульсационного индекса PI на 36% (Р<0,001 относительно контрольной группы), отражающего увеличение интенсивности кровотока за один сердечный цикл для купирования признаков гипоксии.

Увеличение токсической нагрузки цитостатиком на развивающиеся эмбрионы (Опыт «МТХ 1:50») приводит к более глубоким перестройкам в организме зародышей птиц: закономерно снижаются средние линейная (Vam) и объемная (Qam) скорости - на 30,8% (Р<0,001 относительно контрольной группы). Максимальные систолическая и диастолическая скорости выявляют декомпенсацию функций сердечно-сосудистой системы, поскольку происходит их снижение на 24,9 и 41,5%, соответственно. Vakd (конечная диастолическая скорость) в варианте «МТХ 1:100» снижается на 26,3%, а в максимальной дозировке «МТХ 1:50» - статистически значимо (Р<0,02) на 43,6%, что выявляет нарастание клинических признаков диастолической дисфункции.

Способ допплерографической оценки антиангиогенного действия в модели куриного эмбрион осуществляли следующим образом.

Оплодотворенные куриные яйца закладывали в инкубатор (или термостат при температуре 37,8±0,1°С). Дважды в сутки яйца переворачивали вокруг большой оси и одновременно один раз в сутки с помощью овоскопа вели наблюдения за эмбриогенезом. Яйца с нормальным развитием рандомизировано распределяли на контрольную и опытные группы с общим количеством в одной группе не менее десяти. На 6-е сутки эмбриогенеза скорлупу яиц дезинфицировали (хлоргексидина биглюконат, раствор дезинфицирующий 0,05%), затем с помощью овоскопа выбирали место активной васкуляризации хорионаллантоисной оболочки и аккуратно над ним вырезали часть скорлупы и удаляли излишки белка, обеспечивая доступ к сосудам (см. фиг). Предварительно пропитанные исследуемыми раствором цитостатика, в объеме 20 мкл лигниновые диски (лигнин медицинский) диаметром 6 мм помещали на поверхность обнаженной хорионаллантоисной оболочки и сверху скорлупу заклеивали клейкой лентой. Контрольная группа: физиологический раствор; опытные: «Метотрексат 1:100», «Метотрексат 1:50», полученные путем соответствующего разведения исходного раствора «Метотрексат Эбеве» 10 мг/мл физиологическим раствором. При экспозиции в течение 24 ч работу проводили в помещениях, отвечающих классу чистоты Б (СанПиН 2.1.3.1375-03. Гигиенические требования к размещению, устройству, оборудованию и эксплуатации больниц, родильных домов и других лечебных стационаров).

На следующие сутки после аппликации на поверхность хорионаллантоисной мембраны, контактировавшей с исследуемым раствором цитостатика, наносили гель для ультразвуковых исследований и под углом 60° к артериолам располагали датчик с частотой 20-25 МГц (частота выбиралась в зависимости от диаметра исследуемых сосудов). Корректировали положение датчика, таким образом, чтобы добиться максимальных по звуку и амплитуде сигналов. Регистрировали систолические и диастолические скорости кровотока (линейные и объемные), а также основанные на них индексы Гослинга и Пурсело (при необходимости количество расчетных индексов увеличивали). Для корректного сравнения контрольной и опытных групп порядок бифуркации сосудов выбирали одинаковым. В течение всего времени измерений яйца термостатировали при температуре 37,8±0,1°С. Заключение об антиангиогенном действии делали на основании количественного анализа допплерограмм и визуальной оценки состояния сосудистой сети на поверхности хорионаллантоисной оболочки яйца.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли по критерию Манна-Уитни или аналогичного ему по информативности в соответствующих программах (например, SPSS).

Способ обеспечивал возможность ультразвуковой диагностики структурно-функциональной патологии сосудистой системы в динамике или на конечной стадии эксперимента и обладал высокой информативностью и экспрессностью.

Использование предлагаемого способа допплерографической оценки антиангиогенного действия в модели куриного эмбриона позволит, по сравнению с прототипом, повысить информативность, экспрессность и возможность изучения процесса во времени, а также снизить трудозатраты, поскольку исключает необходимость извлечения, фиксации и подсчета сосудов в хориоаллантоисной оболочке зародыша цыпленка.

Изобретение относится к экспериментальной биологии, медицине и фармакологии и может быть использовано для допплерографической оценки антиангиогенного действия в модели куриного эмбриона. Осуществляют отбор 6-дневных эмбрионов кур и дезинфицируют яйца с эмбрионами. Затем выбирают место васкуляризации хорионаллантоисной оболочки и над ним вырезают часть яичной скорлупы. Удаляют излишки белка, обеспечивая доступ к сосудам и размещают лигниновые диски пропитанные исследуемым раствором цитостатика. экспозицию проводят в течение 24 часов. Затем на место аппликации наносят гель для ультразвуковых исследований и под углом 60° к артериолам, располагают датчик с частотой 20-25 МГц. На основании количественного анализа допплерограмм и осуществления визуальной оценки сосудистой сети на поверхности хорионаллантоисной оболочки яйца оценивают антиангиогенное действие цитостатика в модели куриного эмбриона. Способ позволяет повысить информативность, экспрессность и возможность изучения процесса во времени, за счет исключения необходимости извлечения, фиксации и подсчета сосудов в хориоаллантоисной оболочке зародыша цыпленка. 1 ил., 1 табл.

Способ допплерографической оценки антиангиогенного действия в модели куриного эмбриона, включающий отбор 6-дневных эмбрионов кур, на поверхности хорионаллантоисной оболочки которых размещают лигниновые диски, пропитанные исследуемым раствором, отличающийся тем, что 6-дневные яйца с дезинфицируют, затем выбирают место васкуляризации хорионаллантисной оболочки и над ним вырезают часть яичной скорлупы, удаляют излишки белка, обеспечивая доступ к сосудам, экспозицию проводят в течение 24 часов, а лигниновые диски пропитывают исследуемым раствором цитостатика, затем на место аппликации наносят гель для ультразвуковых исследований и под углом 60° к артериолам, соблюдая порядок бифуркации, располагают датчик с частотой 20-25 МГц, при этом на основании количественного анализа допплерограмм и осуществления визуальной оценки сосудистой сети на поверхности хорионаллантоисной оболочки яйца оценивают антиангиогенное действие цитостатика в модели куриного эмбриона.