Область техники.
Группа изобретений относится к молекулярной биологии и биотехнологии, к консервации биологических объектов, а именно, к способам контроля состояния биологических тканей, органов при их консервации.
Уровень техники.
В настоящее время для консервации биологических тканей и органов, фиксации макропрепаратов и бальзамирования известно использование способов, при которых биологические ткани и органы помещают в различные консервирующие растворы.
Например, известен консервирующий раствор и способ сохранения для поддержания высокой клеточной активности образца ткани (источник [1]: патент CN 111418581A). Изобретение обеспечивает консервирующую жидкость и способ консервирования для поддержания высокой клеточной активности образца ткани, при этом консервирующая жидкость содержит компоненты ионного буферного раствора, углеводные компоненты, компоненты, предотвращающие образование кристаллов льда при низкой температуре, компоненты для анаболизма клеток тканей.
Известен способ консервации биологических образцов, обеспечивающий сохранность нуклеиновых кислот (источник [2]: патент RU 2322058). Способ включает смешивание биологического материала с консервирующим раствором, а также с компонентами, препятствующими деградации нуклеиновых кислот.
Известен раствор для консервации биологических тканей и способ его применения (источник [3]: патент JP2012116823A). Раствор для консервации биологической ткани представляет собой раствор для сохранения биологической ткани в незамерзающем состоянии и содержит альбумин. Раствор обеспечивает такую консервацию биологической ткани, при которой период консервации удлиняется без ухудшения функции ткани.
Задача консервации состоит в сохранении биологической ткани в состоянии, пригодном для практического применения в течение длительного срока. Однако, биологические ткани и органы вне организма подвергаются деструктивным изменениям, разрушаются, в связи с чем при консервации необходимо производить оценку состояния биологической ткани, степени ее сохранности. Также желательно иметь средство для сравнительной оценки эффективности различных способов консервации сохранять биологические ткани в исходном состоянии, способности обеспечивать сохранность структуры ткани, для выбора наиболее эффективного способа, консервирующего раствора в конкретном случае.
Известные способы контроля сохранности биологических тканей при их консервации, для длительного хранения основаны на морфологическом анализе микропрепаратов биологических тканей. При оценке качества консервации учитывают макроскопические данные: консистенция, прочность ткани, форма, цвет органов, сохранность гистологических структур, рост микроорганизмов в консерванте и на тканях. Для гистологического исследования используют окраску (источник [4]: Ашихмин С.П., Алипов В.В., Зайцева О.О., Мешандин А.Г. Возможность использования азида натрия в консервации биологического материала для отработки новых хирургических технологий в эксперименте // Вятский медицинский вестник. 2006. № 2. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/vozmozhnost-ispolzovaniya-azida-natriya-v-konservatsii-biologicheskogo-materiala-dlya-otrabotki-novyh-hirurgicheskih-tehnologiy-v).
Отбор проб биологического материала для анализа состояния с использованием методов световой и электронной микроскопии со временем (при многократном взятии проб) приводит к физической деградации сохраняемого биологического материала.
Решение задачи оценки качества консервации может быть осуществлено путем анализа состава и свойств консервирующего раствора. При оценке качества консервации учитывают рост микроорганизмов в консервирующем растворе, на поверхности раствора может наблюдаться рост плесени, который может указывать на разрушение биологической ткани (источник [5]: О.О. Зайцева, С.П. Ашихмин, О.Б. Жданова, П.Г. Распутин, А.А. Грухин Новый способ консервации биоматериала // Современные проблемы природопользования, охотоведения и звероводства. 2007. № 1. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/novyy-sposob-konservatsii-biomateriala). При этом для роста плесени может быть множество факторов, не связанных с состоянием клеток биологической ткани, помещенной в консервирующий раствор, с сохранением исходных свойств ткани.
Возможность контролировать состояние биологических тканей при их консервации без необходимости брать пробы сохраняемого материала обладает очевидными преимуществами.
Техническая проблема заключается в необходимости осуществления неразрушающего контроля сохранности биологических тканей при консервации в растворе.
Другой подход к решению задачи объективного контроля состояния биологических тканей, при их консервации, состоит в анализе состава и свойств консервирующего раствора с целью определения маркеров деградации, в качестве которых выступают внутриклеточные молекулы. Выход этих молекул в консервирующий раствор, в котором хранится биологический объект, может указывать на повреждение клеточных мембран, а также деградацию внутриклеточных компартментов биологических тканей.
Сущность изобретения.
Технический результат достигается тем, что в способе неразрушающего контроля сохранности биологических тканей при консервации, включающий анализ консервирующего раствора, в котором хранятся биологические ткани, анализ консервирующего раствора заключается в определении содержания аденина и его концентрации в консервирующем растворе, для чего берут пробу консервирующего раствора, центрифугируют, добавляют в пробу хлороформ, подвергают обработке на виброплатформе и высушивают в вакуумном испарителе, полученный осадок растворяют в растворе NaOH и добавляют раствор AgNO3, приготовленный на водном растворе аммиака, полученный раствор инкубируют и производят определение оптической плотности раствора путем фотометрии, по результатам которой определяют содержание и концентрацию аденина.
Технический результат заключается в обеспечении неразрушающего контроля сохранности биологических тканей при консервации.
Способ повышает точность контроля сохранности биологических тканей при их консервации за счет определения маркеров клеточной деструкции.
Предусмотрено, что в способе для определения концентрации аденина в консервирующем растворе для неразрушающего контроля сохранности биологических тканей при консервации пробу консервирующего раствора центрифугируют, в пробу консервирующего раствора добавляют хлороформ, подвергают раствор обработке на виброплатфоме, отбирают раствор и высушивают в вакуумном испарителе, полученный осадок растворяют в растворе NaOH и добавляют раствор AgNO3, приготовленный на водном растворе аммиака, полученный раствор инкубируют, затем производят определение оптической плотности раствора путем фотометрии, строят калибровочную кривую, оценивают концентрацию аденина.
Причем в способе определения концентрации аденина в консервирующем растворе центрифугирование консервирующего раствора осуществляют при 20000g в течение 30 мин, и хранят раствор при -26°С, в пробу объёмом 0,5 мл консервирующего раствора добавляют 2 мл хлороформа и подвергают обработке на виброплатфоме в течение 1 часа, полученный осадок растворяют в 5 мл 10% раствора NaOH и добавляют 0,5 мл 5% раствора AgNO3, приготовленного на водном растворе аммиака, полученный раствор инкубируют в течение 1 часа при 37°С, определяют оптическую плотность фотометрически при длине волны 610 нм.
Осуществление изобретения.
Способ неразрушающего контроля сохранности биологических тканей при консервации основан на неинвазивном, не разрушающем сохраняемый биологический объект методе анализа выявления маркеров в консервирующем растворе. Для определения маркеров клеточной деструкции биологической ткани достаточно 1 мл консервирующего раствора, то есть способ позволяет использовать микрообъемы, является микрометодом.
Способ особенно актуален для контроля сохранности генетического (наследственного) материала биотканей - нуклеиновых кислот (ДНК) ядра и митохондрий клеток. Может применяться в качестве скринингового исследования перед морфологическом анализом образцов биологических тканей.
В способе неразрушающего контроля сохранности биологических тканей при консервации осуществляют анализ консервирующего раствора, в котором хранятся биологические ткани. В консервирующем растворе определяют аденин, оценивают концентрацию аденина в растворе, используют сведения о концентрации аденина как индикатор сохранности биологической ткани, причем выявление аденина в растворе указывает на повреждение клеточных мембран биологической ткани, а увеличение концентрации аденина в растворе со временем указывает на увеличение повреждений биологической ткани.
Аденин (6-аминопурин) - пуриновое азотистое основание, которое не имеет ферментов деградации пуринового кольца (в организме человека) и в силу этого обстоятельства чрезвычайно стабилен и не разрушается с течением времени, является маркерной молекулой, указывающей на повреждение клеточных мембран биологической ткани.
В свободной форме аденин в клетке или межклеточном пространстве не обнаруживается, но всегда включен в состав более крупных молекул. Аденин входит в состав многих исключительно важных клеточных молекул: АТФ, коферментов (НАД+ и НАДФ+), нуклеотидов, нуклеиновых кислот (РНК и ДНК).
При консервации биологических тканей в клетках биологических тканей идет процесс спонтанного или ферментативного гидролиза крупных аденин-содержащих молекул с высвобождением свободного аденина в клетках биологических тканей. При повреждении клеточных мембран свободный аденин поступает в консервирующий раствор, и его наличие и концентрация показывают степень сохранности биологических тканей.
Свободный аденин демонстрирует стойкость (стабильность) к разрушению в водной среде. Экспериментальные данные показали, что аденин проявляет стабильность под влиянием синхротронного излучения в вакуумном ультрафиолетовом диапазоне 12-21 эВ. (Pilling S, Lago AF, Coutinho LH, de Castilho RB, de Souza GG, de Brito AN. Dissociative photoionization of adenine following valence excitation. Rapid Commun Mass Spectrom. 2007;21(22):3646-3652. doi:10.1002/rcm.3259).
Период полураспада твердого аденина, подвергнутого воздействию моделируемого потока космических лучей межзвездной среды весьма продолжительный и оценивался как (10±8) × 106 лет (Vignoli Muniz GS, Mejía CF, Martinez R, et al. Radioresistance of Adenine to Cosmic Rays. Astrobiology. 2017;17(4):298-308. doi:10.1089/ast.2016.1488).
Использование определения концентрации аденина в среде консервации биологических объектов является хорошим индикатором сохранности биологических тканей.
Для определения концентрации аденина в консервирующем растворе для неразрушающего контроля сохранности биологических тканей при консервации, пробу консервирующего раствора центрифугируют, в пробу консервирующего раствора добавляют хлороформ, подвергают раствор обработке на виброплатфоме, отбирают раствор и высушивают в вакуумном испарителе, полученный осадок растворяют в растворе NaOH и добавляют раствор AgNO3, приготовленный на водном растворе аммиака, полученный раствор инкубируют, затем производят определение оптической плотности раствора путем фотометрии, строят калибровочную кривую, оценивают концентрацию аденина.
Способ основан на реакции взаимодействия пуриновых азотистых оснований с азотнокислым серебром с образованием окрашенного соединения. Консервирующий раствор (достаточно 1 мл) подвергают высокооборотному центрифугированию 20000g в течение 30 мин и хранят при -26°С. Экстракцию пуриновых азотистых оснований из консервирующего раствора проводят с использованием хлороформа. Для этого к 0,5 мл консервирующего раствора добавляют 2 мл хлороформа и подвергают обработке на виброплатфоме в течение 1 часа при комнатной температуре. Хлороформ (1 мл) с растворенными в нем пуриновыми азотистыми основаниями отбирают, переносят в сухие пробирки и пробы высушивают в вакуумном испарителе. Сухой осадок, содержащий, пуриновые азотистые основания, растворяют в 5 мл 10% раствора NaOH и добавляют 0,5 мл 5% раствора AgNO3, приготовленного на водном растворе аммиака. Пробы инкубируют в течение 1 часа при 37°С. В результате реакции, при наличии аденина, развивается светло-коричневое окрашивание. Пробы фотометрируют при длине волны 610 нм. Для построения калибровочной кривой используют аденин (Sigma). Калибровочный график был линеен в диапазоне 0-10 мг/мл.
Условия центрифугирования (20000g, 30 мин) выбраны, исходя из необходимости осаждения остатков клеточных мембран, которые возможно присутствуют в среде консервации при тканевой деструкции. Остатки клеточных мембран, присутствующие в среде консервации, могут исказить результаты за счет сорбированного на них аденина.
Хранение консервирующего раствора при низкой температуре гарантирует остановку деструктивных процессов остатков клеток, возможно присутствующих в растворе.
Красно-коричневое окрашивание реакционного раствора заставляет использовать длину волны света 610 нм как наиболее эффективную с позиции её поглощения. Чувствительность метода наиболее высока при использовании длины волны 610 нм. Развитие цветной реакции также зависит от времени и температуры. Проведение реакции в течение 1 часа при температуре 37°С является наиболее частым применением в биологических исследованиях.
В предварительных исследованиях было обнаружено, что калибровочный график имеет выраженный загиб при высоких концентрациях аденина, что является особенностью химической реакции. Вместе с тем, калибровочный график линеен в области низких концентраций аденина и это его свойство используется в заявляемом способе. Точными и правильными являются только те результаты, которые получены в его линейной области (в диапазоне 0-10 мг/мл) - области относительно низких концентраций аденина калибровочного графика. Линейность калибровочного графика в области низких концентраций аденина указывает на то, что выполняется закон Гесса (закон действующих масс). Согласно закону Гесса, концентрация продукта реакции определяется концентрациями реагирующих веществ. Однако, по мере увеличения концентрации одного из компонентов реакции происходит более быстрое увеличение концентрации продукта реакции, который, будучи структурно сходным с одним из компонентов реакции, тормозит взаимодействие реагирующих веществ. Так возникает загиб линейного участка при высоких концентрациях аденина.
В таблице 1 приведены результаты определения содержания пуриновых азотистых оснований (аденина) в различных образцах консервирующего раствора, в котором хранились музейные анатомические препараты. Характеристика консервирующего раствора: раствор для длительного хранения музейных анатомических препаратов (раствор Мельникова-Разведенкова), в состав которого входят глицерин, водный раствор ацетата калия.
Таблица 1.
Результаты определения содержания пуриновых азотистых оснований (ПАО) в представленных образцах
В представленных образцах консервирующего раствора №№ 1, 2, 4, 5 обнаружены очень низкие концентрации аденина, свидетельствующие об относительно хорошей сохранности биологических тканей музейных анатомических препаратов, хранящихся в растворах, что было подтверждено и при последующем макро- и микроскопическом обследовании этих анатомических препаратов. В представленном образце № 3 консервирующего раствора выявлено повышение содержания пуриновых азотистых оснований (аденина), что является признаком клеточной деструкции биологических тканей, хранящегося в нем анатомического препарата, что было подтверждено при последующем детальном макро- и микроскопическом исследовании данного музейного анатомического препарата. Анализ консервирующего раствора производят с целью определения внутриклеточных маркерных молекул. Выход этих молекул в раствор, в котором хранится биологический объект, указывает на повреждение клеточных мембран, а также деградацию внутриклеточных компартментов. В свободной форме аденин в клетке или межклеточном пространстве не обнаруживается, но всегда включен в состав более крупных молекул. Об уровне клеточной деструкции можно судить по выходу из ткани аденина, переход его в раствор - признак развития тканевой деструкции, а отсутствие аденина в консервирующем растворе - признак хорошей сохранности тканей.
Таким образом, использование определения концентрации аденина в растворе для консервации биологических объектов является индикатором сохранности образцов.
Группа изобретений поясняется примерами.
Пример 1. Неразрушающий контроль сохранности биологических тканей при консервации в растворе Мельникова-Разведенкова, в котором длительное время сохранялся биологический материал, содержащий костную, хрящевую и мышечную ткани человека.
Для неразрушающего контроля сохранности биологических тканей при консервации произведён химический анализ консервирующего раствора (раствор Мельникова-Разведенкова), в котором длительное время сохранялся биологический материал, содержащий костную, хрящевую и мышечную ткани человека.
В консервирующем растворе определяли аденин, оценивали концентрацию аденина в растворе, используя сведения о концентрации аденина как индикатор сохранности биологической ткани.
Для определения концентрации аденина в консервирующем растворе пробу консервирующего раствора центрифугировали при 20000g в течение 30 мин, и хранят раствор при -26°С, в пробу объёмом 0,5 мл консервирующего раствора добавляли 2 мл хлороформа , подвергали раствор обработке на виброплатфоме в течение 1 часа, полученный осадок, растворяли в 5 мл 10% раствора NaOH и добавляли 0,5 мл 5% раствора AgNO3, приготовленного на водном растворе аммиака, полученный раствор инкубировали в течение 1 часа при 37°С, определяли оптическую плотность фотометрически при длине волны 610 нм, строили калибровочную кривую, оценивали концентрацию аденина.
В консервирующем растворе обнаружена низкая концентрация аденина 0,039 мг/мл, свидетельствующая об относительно хорошей сохранности биологических тканей, хранящихся в растворе, что было подтверждено микроскопическим исследованием На фиг. 1 показано, что архитектоника мышечного пучка хорошо сохранена. На фиг. 2. показано, что ультраструктура мышечной ткани хорошо сохранена.
Пример 2. Неразрушающий контроль сохранности биологических тканей при консервации в растворе Мельникова-Разведенкова со сниженным содержанием активных компонентов, в котором длительное время сохранялся биологический материал, содержащий костную, хрящевую и мышечную ткани человека.
Для неразрушающего контроля сохранности биологических тканей при консервации произведён химический анализ консервирующего раствора (раствор Мельникова-Разведенкова со сниженным содержанием активных компонентов), в котором длительное время сохранялся биологический материал, содержащий костную, хрящевую и мышечную ткани человека.
В консервирующем растворе определяли аденин, оценивали концентрацию аденина в растворе, используя сведения о концентрации аденина как индикатор сохранности биологической ткани.
Для определения концентрации аденина в консервирующем растворе пробу консервирующего раствора центрифугировали при 20000g в течение 30 мин, и хранят раствор при -26°С, в пробу объёмом 0,5 мл консервирующего раствора добавляли 2 мл хлороформа , подвергали раствор обработке на виброплатфоме в течение 1 часа, полученный осадок, растворяли в 5 мл 10% раствора NaOH и добавляли 0,5 мл 5% раствора AgNO3, приготовленного на водном растворе аммиака, полученный раствор инкубировали в течение 1 часа при 37°С, определяли оптическую плотность фотометрически при длине волны 610 нм, строили калибровочную кривую, оценивали концентрацию аденина.
Выявление аденина в растворе указывает на повреждение клеточных мембран биологической ткани, а увеличение концентрации аденина в растворе со временем указывает на увеличение повреждений биологической ткани.
В консервирующем растворе обнаружена высокая концентрация аденина 0,780 мг/мл, свидетельствующая о развитии тканевой деструкции биологических тканей, хранящихся в растворе, что было подтверждено микроскопическим исследованием (фиг. 3, 4), видно увеличение расстояния между мышечными волокнами и разрывы мышечных волокон, видны митохондрии с поврежденной наружной мембраной.
Изобретение относится к консервации биологических объектов, а именно к способам контроля состояния биологических тканей, органов, при их консервации. Способ неразрушающего контроля сохранности биологических тканей при консервации включает анализ консервирующего раствора, в котором хранятся биологические ткани, который включает определение содержания аденина и его концентрацию в консервирующем растворе, для чего берут пробу консервирующего раствора, центрифугируют, добавляют в пробу хлороформ, подвергают обработке на виброплатформе и высушивают в вакуумном испарителе. Далее полученный осадок растворяют в растворе NaOH и добавляют раствор AgNO3, приготовленный на водном растворе аммиака, полученный раствор инкубируют и производят определение оптической плотности раствора путем фотометрии, по результатам которой определяют содержание и концентрацию аденина. Отбирают пробу консервирующего раствора 5 мл, центрифугирование осуществляют при 20000g в течение 30 мин, хлороформ вносят в количестве 2 мл, обработку на виброплатформе осуществляют в течение 1 ч, используют 10%-ный раствор NaOH в количестве в 5 мл и 5%-ный раствора AgNO3 в количестве 0,5 мл, инкубацию проводят в течение 1 ч при 37°С, оптическую плотность определяют при длине волны 610 нм. Дополнительно перед проведением анализа консервирующего раствора пробу хранят при температуре -26°С. Предлагаемый способ неразрушающего контроля сохранности биологических тканей при консервации обеспечивает высокую точность контроля сохранности биологических тканей при их консервации за счет определения маркеров клеточной деструкции. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.
1. Способ неразрушающего контроля сохранности биологических тканей при консервации, включающий анализ консервирующего раствора, в котором хранятся биологические ткани, отличающийся тем, что анализ консервирующего раствора заключается в определении содержания аденина и его концентрации в консервирующем растворе, для чего берут пробу консервирующего раствора, центрифугируют, добавляют в пробу хлороформ, подвергают обработке на виброплатформе и высушивают в вакуумном испарителе, полученный осадок растворяют в растворе NaOH и добавляют раствор AgNO3, приготовленный на водном растворе аммиака, полученный раствор инкубируют и производят определение оптической плотности раствора путем фотометрии, по результатам которой определяют содержание и концентрацию аденина.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отбирают пробу консервирующего раствора 5 мл, центрифугирование осуществляют при 20000g в течение 30 мин, хлороформ вносят в количестве 2 мл, обработку на виброплатформе осуществляют в течение 1 ч, используют 10%-ный раствор NaOH в количестве в 5 мл и 5%-ный раствора AgNO3 в количестве 0,5 мл, инкубацию проводят в течение 1 ч при 37°С, оптическую плотность определяют при длине волны 610 нм.
3. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что пробу консервирующего раствора перед анализом хранят при температуре -26°С.
| ЗАЙЦЕВА О.О., АШИХМИН С.П., ЖДАНОВА О.Б., и др | |||
| "Новый способ консервации биоматериала", Современные проблемы природопользования, охотоведения и звероводства, 2007, N1, с.161-162; URL: https://cyberleninka.ru/article/n/novyy-sposob-konservatsii-biomateriala | |||
| Способ фиксации и хранения биоматериала с использованием высокоэффективного и нетоксичного реагента | 2018 |
|
RU2692917C1 |
| Консервант для анатомических препаратов | 2019 |
|
RU2717657C1 |
| СПОСОБ КОНСЕРВАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЙ СОХРАННОСТЬ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ | 2005 |
|
RU2322058C2 |
| DE | |||
