Способ диагностики бактериальной абдоминальной хирургической инфекции при аппендиците Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/49 G01N33/573 C07K14/79 

Изобретение относится к области медицины, а именно к абдоминальной хирургии, и может быть использовано для диагностики бактериальной абдоминальной хирургической инфекции при аппендиците путем биохимического исследования сыворотки крови хирургических больных.

Анализ структуры летальности у больных с бактериальной абдоминальной хирургической патологией показывает, что основной причиной смерти у этих больных был и остается перитонит (Абдоминальная хирургическая инфекция: клиника, диагностика, антимикробная терапия. Практическое руководство / Под ред. B.C. Савельева, Б.Р. Гельфанда. - М.: Литтерра, 2006. - 168 с.), а летальность при перитоните колеблется в пределах 18-20%, а при распространенной форме она повышается до 60%. Такой большой процент летальности у этой категории больных связан с клинически важной особенностью интраабдоминальных инфекций, во многом определяющей неудовлетворительный прогноз, заключающейся в быстром развитии генерализованной реакции макроорганизма в ответ на инфекционный процесс, обусловленной действием бактериальных эндо- и экзотоксинов и различных медиаторов воспаления.

Исследования, проведенные в клиниках России, подтверждают полимикробный характер интраабдоминальных инфекций с участием широкого спектра аэробных и анаэробных грамотрицательных и грамположительных бактерий (Гельфанд Б.Р., Гологорский В.А., Бурневич С.З. Антибактериальная терапия при отдельных формах абдоминальной хирургической инфекции. // Consilium medicum. - 2000. - №4. С. 21-26; Савельев B.C., Гельфанд Б.Р. Абдоминальная хирургическая инфекция: клиника, диагностика. Антимикробная терапия: практическое руководство 2006. - 168 с; Чернов В.Н. Неотложная хирургия: диагностика и лечение острой хирургической патологии. М., 2007. - 350 с.).

Однако в 43,62% случаев при абдоминальной хирургической инфекции из перитонеального экссудата высеивается монокультуры патогенных бактерий (Волков А.Г., Заривчацкий М.Ф. Микробный пейзаж абдоминальных хирургических инфекций у больных многопрофильного стационара // Пермский медицинский журнал. - 2014. - Том XXXI, №1. - С. 53-57).

Поэтому единственным объективным и достоверным методом диагностики бактериальной абдоминальной хирургической инфекции является бактериологическое исследование, регламентированное на всех этапах официальными инструкциями. Данные микробиологических исследований играют решающую роль для рациональной антибиотикотерапии абдоминальной инфекции в хирургии. Окончательную идентификацию возбудителей и определение их чувствительности к антибактериальным препаратам проводят после получения чистой культуры. Результаты нативной бактериоскопии помогают в назначении первичной эмпирической антибактериальной терапии (Волков А.Г. Клинико-микробиологическая характеристика абдоминальной хирургической инфекции и ее этиотропная терапия: Автореф. дис.… канд. мед. наук.. 2016. - Пермь. - 20 с.).

Однако специфическая бактериологическая диагностика инфекции трудоемка, длительна и доступна не всем лечебным учреждениям: через 24-48 часов после посева культуральные и морфологические свойства выросших колоний оценивают визуально и, как правило, осуществляется пересев отдельных колоний на специализированные среды. Затем проводится идентификация штаммов на основе биохимического обнаружения специфических маркеров-ферментов или типовых метаболитов.

В стадии изучения клинической эффективности находятся высокотехнологичные способы диагностики доминирующих в микробной ассоциации возбудителей, независимо от их количественного содержания. К таким методам относится, к примеру, газовая хроматография, позволяющая распознать характерные метаболиты отдельных микробиотов, которые по своим микробиологическим свойствам способны выступить в качестве доминирующих патогенов (Патент РФ №2235325 от 26.08.2002 «Способ определения инфицированного выпота брюшной полости и способ лечения заболеваний, сопровождающихся выпотом в брюшную полость»).

Недостатками всех перечисленных специфических бактериологических методов идентификации возбудителя бактериальной абдоминальной хирургической инфекции являются:

- недоступность в обозримом будущем для большинства хирургических отделений из-за высокой стоимости аппаратуры, реагентов и квалифицированного персонала для обслуживания соответствующего оборудования;

- клиницистами подвергается сомнению целесообразность всеобъемлющего микробиологического мониторинга при ведении больных с абдоминальными инфекционными процессами.

Большинство исследователей ориентируется на изучение лабораторных тестов, таких, как количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, уровень веществ средней молекулярной массы (ВСММ), лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ), осмолярность плазмы крови, эффективная концентрация альбумина (Грдчик И.Е., Закиров Д.Б., Пар В.И. К прогнозу течения абдоминального сепсиса // Вестник интенсивной терапии, 2004, №1, с. 32-36), определение уровня прокальцитонина и пр. (Савельев B.C., Гельфанд Б.Р., Филимонова М.И. Перитонит. - М., Литтера, 2005, с. 58). Однако ни один из выше перечисленных лабораторных показателей не диагностирует послеоперационную абдоминальную хирургическую инфекцию на ее ранней стадии. При вялотекущей форме перитонита все эти показания размыты или отсутствуют вообще.

Среди способов небактериологической диагностики бактериальной абдоминальной хирургической инфекции существуют способы биохимической диагностики бактериальной инфекции или сепсиса, заключающиеся в исследовании крови и определении в сыворотке крови больных повышенных уровней маркерных белков (Вельков В.В. Комплексная лабораторная диагностика системных инфекций и сепсиса: С-реактивный белок, прокальцитонин, пресепсин. 2015. - 117 с.; Чернов В.Н., Таранов И.П., Бабиев В.Ф. Способ диагностики анаэробной хирургической инфекции мягких тканей // Патент РФ № 2073245 от 10.02.1997).

Недостатками этих способов являются:

- неэффективность в отношении диагностики микробиологической структуры абдоминальной хирургической инфекции;

- диагностика основывается на определении в крови определенной пороговой величины биохимического аналита и не свободна от различного рода ошибок измерения (в том числе, связанных с гемодилюцией);

- для установления диагноза необходимо неоднократное исследование крови у одного и того же пациента ввиду чрезвычайно широкого интервала индивидуальных значений биохимических маркерных белков.

Доказано, что нейтрофилы плазмы крови и перитонеального экссудата секретируют лактоферрин, липокалин, кателицидин, α- и β-дефенсины и другие пептиды (Ihi Т., Nakazato М., Mukae Н., Matsukura S. / Elevated concentrations of human neutrophil peptides in plasma, blood, and body fluids from patients with infections // Clin. Infect. Dis. - 1997. - Vol. 25, №5. - P. 1134-1140).

Было обнаружено, что структурным участком белка лактоферрина, ответственным за бактерицидные свойства, является короткий концевой пептид, называемый лактоферрицином (Серебряков А.А., Коханов А.В., Николаев А.А. Уропротеины с антибактериальными свойствами: клинико-диагностическое значение. // Астраханский медицинский журнал. - 2020. -Т. 15, №3. - С.:32-47; BellamyW., Takase М., Yamauchi K., Wakabayashi Н., Kawase K., Tomita М. / Identification of the bactericidal domain of lactoferrin // Biochim. Biophys. Acta. - 1992. - Vol. 1121, № 1-2. - P. 130-136).

Существуют способы биохимической диагностики отдельных видов абдоминальной хирургической инфекции, путем определения нескольких специфических для данной бактериальной абдоминальной хирургическую инфекции белков. Способ диагностики стрептококковой абдоминальной хирургической инфекции (Патент РФ №2705385 от 10.01.2019, Зурнаджьянц В.А. и соавт.), способ диагностики грамотрицательной абдоминальной хирургической инфекции (Патент РФ №2705384 от 10.01.2019, Зурнаджьянц В.А. и соавт.), способ диагностики стафиллококковой абдоминальной хирургической инфекции (Патент РФ №2705415 от 10.01.2019, Зурнаджьянц В.А. и соавт.). Однако данные способы не позволяют определять сам факт наличия бактериальной абдоминальной хирургической инфекции независимо от вида бактериальной абдоминальной хирургической инфекции.

В качестве наиболее близкого аналога предлагается способ диагностики послеоперационного перитонита (Патент РФ №2456621 от 31.03.2011, Топчиев М.А. и соавт.) путем биохимического исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови и перитонеальном экссудате послеоперационных больных определяют уровень ферритина, 100 нг/мл которого принимают за 1 балл, затем баллы ферритина в экссудате и сыворотке суммируют, определяют суммарный индекс ферритина и при его повышении более 12 баллов диагностируют развитие послеоперационного перитонита.

Недостатками прототипа являются:

- неспецифичность полученных результатов анализа;

- неспецифичность используемого индикатора в отношении инфекционного агента;

- необходимость для обследования двух жидкостей пациента;

- большое число ложноположительных и ложноотрицательных результатов;

- используется субъективная оценка результата по сумме набранных баллов.

Изобретение направлено на повышение чувствительности и точности процедуры диагностики бактериальной абдоминальной хирургической инфекции при аппендиците путем биохимического исследования сыворотки крови хирургических больных.

Поставленная в изобретении цель достигается тем, что в сыворотке крови хирургических пациентов методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа определяют концентрацию антибактериального пептида лактоферрицина и при обнаружении его в концентрации не менее 40 нг/мл у пациентов диагностируют бактериальную абдоминальную хирургическую инфекцию.

Иммуноферментный метод регистрации антимикробного пептида лактоферрицина, основанный на реакции антиген-антитело, имеет ряд преимуществ перед спектрофотометрическими и другими методами регистрации результата измерения, к числу которых относятся универсальность, избирательность, специфичность, высокая чувствительность.

Для получения иммуногенных конъюгатов для неиммуногенного пептида лактоферрицина его связывают с молекулой бычьего сывороточного альбумина (БСА) как описано в работах Чехонина В.П. (Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А. Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов. - М.: Медицина, 1999. - 416 c.).

Полученные конъюгаты далее используют для иммунизации кроликов по стандартным протоколам до получения гипериммунной поликлональной антисыворотки. После процедуры истощения (адсорбции) полученной антисыворотки препаратами БСА, получают моноспецифическую антисыворотку к лактоферрицину человека. Для различных иммунохимических методов определения лактоферрицина в пробах сыворотки крови хирургических больных в качестве тест-системы используют либо полученную антисыворотку, либо выделенную из нее иммуноглобулиновую фракцию, содержащую антитела против лактоферрицина человека.

Концентрацию лактоферрицина в сыворотках крови хирургических больных определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с помощью, разработанной в Астраханском государственном медицинском университете тест-системы с чувствительностью 1-5 нг/мл (Астрахань).

Предложенный способ внедрен в работу хирургического отделения ГБУЗ АО «ГБУЗ АО «ОДКБ им. Н.Н. Силищевой» и ГБУЗ АО «Городская клиническая больница №3» г. Астрахани и использован при обследовании 45 больных.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1

Больной С., 11 лет, заболел 07.10.21 года, за медицинской помощью не обращался. Больной доставлен в ГБУЗ АО «ОДКБ им. Н.Н. Силищевой» машиной скорой медицинской помощи 08.10.22 года в тяжелом состоянии, в сознании, вялый, температура кожных покровов 39,4°С. Кожные покровы бледного цвета сухие на ощупь, выражен спазм периферических сосудов. ЧСС 128 уд. в 1 минуту, ЧДД 32 дыхания в 1 минуту. Живот вздут, болезнен при пальпации. Симптом Щеткина-Блюмберга - положительный. Перистальтика вялая единичными волнами.

Общий анализ крови: эритроциты 3,37 × 10¹² /л; Hb - 118 г/л; Le - 15,4 × 10 ⁹/ л. СОЭ - 6 мм/час. Лейкоцитарный индекс интоксикации по Я.Я. Кальф-Калифу (ЛИИ) - 7,4 у.е. Общий белок 58 г/л. Креатинин 14,2 ммоль/л, мочевина 2,6 ммоль/л. Аланинаминотрансфераза 0,5 ед. Глюкоза 6,4 г/л.

Биохимический анализ сыворотки крови на лактоферрицин при поступлении пациента: лактоферрицин - 118 нг/мл, что свидетельствовало о наличии у пациента бактериальной абдоминальной инфекции.

На операции: острый гангренозно-перфоративный аппендицит. Разлитой гнойный перитонит. Парез кишечника П-Ш степени.

Для лечения в послеоперационном периоде больной был переведен в реанимационное отделение. В первые послеоперационные сутки у больного сохранялась интоксикация тяжелой степени. Назначена антибактериальная терапия препаратами цефтриаксон по 4 г в сутки внутривенно капельно, метронидазол по 100 мл в сутки в/в 2 раза в сутки.

Анализ сыворотки крови на девятые сутки после операции: лактоферрицин - 15,6 нг/мл, что свидетельствовало об отсутствии на данный момент у пациента бактериальной абдоминальной хирургической инфекции.

Дальнейший послеоперационный период протекал гладко и 29 октября 2021 года больной был выписан из больницы.

Пример 2

Больной П. 28 лет, поступил 17.02.22 г. через двое суток от начала заболевания в приемное отделение ГБУЗ АО «Городская клиническая больница №3» г. Астрахани с жалобами на тошноту, боли в правой подвздошной области ноющего характера.

Общее состояние больного удовлетворительное. Температура тела 37,3°С, частота пульса 76 ударов в минуту, АД 125/75 мм рт.ст. Со стороны сердца и легких изменений нет.

Язык влажный, обложен белесоватым налетом. Живот правильной формы, участвует в дыхании, при пальпации напряжен и болезненен в правой подвздошной области. Симптом Щеткина-Блюмберга отрицателен.

Анализ крови: гемоглобин 134 г/л, эритроциты 4,8 × 10¹²/л, гематокрит 0,4 л/л, СОЭ 5 мм/ч, лейкоциты - 8,8 × 10⁹/л, эозинофилы - 2%, палочкоядерные нейтрофилы - 4% сегментоядерные - 69%, лимфоциты -22%, моноциты - 3%, ЛИИ - 1,7 у.е. Общий белок 62 г/л, креатинин 43 ммоль/л, общий билирубин - 13,3 мкмоль/л, мочевина 2,6 ммоль/л, глюкоза 4,4 ммоль/л. При исследовании мочи изменений не обнаружено.

Биохимический анализ сыворотки крови на лактоферрицин при поступлении пациента: лактоферрицин - 4,3 нг/мл, что свидетельствовало об отсутствии у пациента бактериальной абдоминальной хирургической инфекции.

Операция: Аппендэктомия. Гистологическим исследованием червеобразного отростка подтвержден диагноз флегмонозный аппендицит без признаков бактериальной абдоминальной хирургической инфекции.

Предлагаемым способом достигается повышение чувствительности и точности процедуры диагностики бактериальной абдоминальной хирургической инфекции, а именно:

- быстрота способа, достаточно только одного исследования, с затратой времени на исследование менее 1 часа;

- техническая простота, незначительные трудозатраты (для практического исполнения способа достаточно 1 специалиста);

- экономичность (способ не требует эксклюзивного и дорогостоящего оборудования и реактивов, вспомогательной аппаратуры и высококвалифицированного медперсонала);

- доступность реактивов необходимых для практической реализации данного способа;

- универсальность способа (возможность определения лактоферрицина в образце сыворотки крови хирургического больного любым доступным способом).

Предлагаемый способ может быть внедрен как экспресс-тест на наличие бактериальной абдоминальной хирургической инфекции у пациентов хирургических отделений больниц любого уровня.

Изобретение относится к медицине, а именно к абдоминальной хирургии, и может быть использовано для диагностики бактериальной абдоминальной хирургической инфекции при аппендиците путем биохимического исследования биологической жидкости человека. В сыворотке крови хирургических пациентов методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа определяют концентрацию антибактериального пептида лактоферрицина. При обнаружении его в концентрации не менее 40 нг/мл у пациентов диагностируют бактериальную абдоминальную хирургическую инфекцию. Способ обеспечивает возможность повышения чувствительности и точности процедуры диагностики бактериальной абдоминальной хирургической инфекции за счет определения концентрации антибактериального пептида лактоферрицина в сыворотке крови хирургических больных. 2 пр.

Способ диагностики бактериальной абдоминальной хирургической инфекции при аппендиците путем биохимического исследования биологической жидкости человека, отличающийся тем, что в сыворотке крови хирургических пациентов методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа определяют концентрацию антибактериального пептида лактоферрицина и при обнаружении его в концентрации не менее 40 нг/мл у пациентов диагностируют бактериальную абдоминальную хирургическую инфекцию.