Способ получения биокомпозита с антибактериальными свойствами Российский патент 2024 года по МПК A61K6/00 A61L27/10 A61L27/12 A61L27/20 A61L27/54 C04B35/16 C04B35/447 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения биорезорбируемых остеопластических дисперсных биокомпозитов синтетического типа, предназначенных для лечения заболеваний и повреждений костной системы человека, и может найти применение в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, где существует необходимость регенерации поврежденных челюстных костей, устранения костных дефектов, возникающих при травмах, удалении кист, секвестрэктомии, после костной пластики.

Известен способ получения керамических порошков на основе гидроксиапатита и волластонита (ГАП и ВТ соответственно), которые биологически совместимы с костной тканью человека и предназначены для устранения дефектов зубов и костей в стоматологии, челюстно-лицевой хирургии, травматологии, ортопедии, в котором смешивают водные растворы гидроксида кальция, ортофосфорной кислоты и пятиводного силиката натрия при соотношении концентраций Са/Р = 1,67 и Ca/Si = 1,00, при этом количества Са(ОН)₂, Н₃РО₄ и Na₂SiO₃ рассчитывают исходя из значений Са/Р и Ca/Si и выбранной пропорции ГАП/ВТ, а значение рН реакционных сред поддерживают на уровне 12,00 ± 0,05, после осаждения полученную твердую фазу выдерживают под маточным раствором в течение 24 часов при температуре 22-25°С, отфильтровывают, промывают дистиллированной водой, высушивают при 90°С до постоянной массы, прокаливают при 1000°С в течение 2 часов и перемалывают полученную керамическую массу до порошкообразного состояния (см. патент РФ № 2657817, МПК A61L 27/46, A61L 27/10, A61L 27/12, C04B 35/16, C04B 35/447, дата публикации 15.06.2018 г.).

Тонкая структура и пористость получаемого известным способом дисперсного керамического материала зависят от ряда не всегда поддающихся контролю факторов (в частности, от механического размола на последнем этапе обработки), что в конечном итоге не позволяет получить композит достаточно высокого качества. Температура спекания 1000°С является критичной для термообработки ГАП: в результате двухчасовой обработки проявляются признаки нестабильности структуры, наблюдается нарушение его микроструктуры, уменьшение пористости при сохраняющемся количественном содержании кальция-фосфора, происходит снижение его биологической активности, ухудшение свойств композита в целом.

В качестве ближайшего аналога (прототипа) принят способ получения биокомпозита на основе волластонита и гидроксиапатита при использовании в качестве прекурсоров метасиликата натрия, кальция хлористого и гидрофосфата аммония в виде водных растворов, включающий приготовление содержащей прекурсоры реакционной смеси, отделение, промывание, сушку полученного на ее основе биокомпозита и его прокаливание путем нагревания в атмосфере воздуха до достижения температуры 800°С с последующей выдержкой при достигнутой максимальной температуре в течение 60 минут (см. патент РФ № 2741015, МПК A61K 6/00, A61L 27/10, A61L 27/12, C04B 35/16, C04B 35/447, дата публикации 22.01.2021 г.).

Недостатками прототипа являются:

- отсутствие сведений, указывающих и/или подтверждающих антибактериальные свойства готового материала;

- использование силоксан-акрилатной эмульсии и углеродного волокна предусматривает необходимость их выжигания из объема биокомпозита с потенциальным риском наличия остаточной нежелательной примеси углерода в готовом материале.

Проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка технологии получения биорезорбируемого остеопластического дисперсного биокомпозитного материала с антибактериальными свойствами.

Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, выражается в следующем:

- упрощение (и как следствие удешевление) технологии за счет сокращения количества реагентов, требующих более тщательного выжигания из объема биокомпозита;

- получение биокомпозита, обладающего биосовместимыми и антибактериальными свойствами.

Поставленная задача решается тем, что способ получения биокомпозита с антибактериальными свойствами на основе волластонита и гидроксиапатита при использовании в качестве прекурсоров метасиликата натрия, кальция хлористого и гидрофосфата аммония в виде водных растворов, включающий приготовление содержащей прекурсоры реакционной смеси, отделение, промывание, сушку полученного на ее основе биокомпозита и его прокаливание путем нагревания в атмосфере воздуха до достижения температуры 800°С с последующей выдержкой при достигнутой максимальной температуре в течение 60 минут отличается тем, что для приготовления реакционной смеси в форме коллоидного раствора дополнительно используют гидроксид аммония в виде водного раствора, указанный коллоидный раствор помещают в автоклав, нагревают пока температура не достигнет 180°С и выдерживают при указанной температуре в течение 6 часов, полученный биокомпозит в форме аморфного осадка отделяют, промывают, сушат и прокаливают со скоростью разогрева 10°С/мин пока температура не достигнет 800°С, далее выдерживают при достигнутой максимальной температуре в течение 60 минут, полученный биокомпозит кристаллического состава обрабатывают раствором хитозана, содержащим ионы серебра, для приготовления которого хитозан растворяют в уксусной кислоте, перемешивают со скоростью 300 об/мин в течение 6 часов, вводят порошок нитрата серебра при соотношении хитозан : уксусная кислота : порошок нитрата серебра 0,4 г : 40 мл : 0,9 г соответственно, после чего кипятят полученную смесь при 100°С в течение 2 часов, отделяют обработанный биокомпозит и сушат на воздухе при температуре 20-25°С в течение 1 часа.

Кроме того, обработку биокомпозита производят путем его однократного окунания в раствор хитозана, содержащий ионы серебра.

Кроме того, обработку биокомпозита производят путем его выдерживания в растворе хитозана, содержащем ионы серебра, в течение 24 часов.

Сопоставительный анализ признаков заявляемого изобретения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».

При этом отличительные признаки формулы изобретения обеспечивают решение следующих функциональных задач.

Признаки «для приготовления реакционной смеси в форме коллоидного раствора дополнительно используют гидроксид аммония NH₄OH в виде водного раствора, указанный коллоидный раствор помещают в автоклав, нагревают пока температура не достигнет 180°С и выдерживают при указанной температуре в течение 6 часов, полученный биокомпозит в форме аморфного осадка отделяют, промывают, сушат и прокаливают со скоростью разогрева 10°С/мин пока температура не достигнет 800°С, далее выдерживают при достигнутой максимальной температуре в течение 60 минут» описывают технологию получения биокомпозита кристаллического состава, обладающего биосовместимыми свойствами.

Признак «биокомпозит кристаллического состава обрабатывают раствором хитозана, содержащим ионы серебра», а также признаки зависимых пунктов формулы придают биокомпозиту, обладающему биосовместимыми свойствами, антибактериальные свойства вследствие допирования наночастиц серебра во всем объеме готового материала.

Признаки «для приготовления [раствора хитозана, содержащего ионы серебра] хитозан растворяют в уксусной кислоте, перемешивают со скоростью 300 об/мин в течение 6 часов, вводят порошок нитрата серебра и кипятят полученную смесь при 100°С в течение 2 часов» описывают технологию приготовления раствора хитозана, содержащего ионы серебра.

Признак «соотношение хитозан : уксусная кислота : порошок нитрата серебра составляет 0,4 г : 40 мл : 0,9 г соответственно» описывает компоненты, входящие в состав раствора хитозана, содержащего ионы серебра, и их соотношение между собой.

Признаки «после [обработки биокомпозита раствором хитозана, содержащим ионы серебра] отделяют обработанный биокомпозит и сушат на воздухе при температуре 20-25°С в течение 1 часа» позволяют удалить излишки раствора из биокомпозита.

Другие отличительные признаки и преимущества изобретения ясно вытекают из описания, приведенного ниже для иллюстрации и не являющегося ограничительным, со ссылками на прилагаемые чертежи:

на фиг.1 показана дифрактограмма биокомпозита CaSiO₃-ГАП;

на фиг.2 приведены РЭМ изображения биокомпозита CaSiO₃-ГАП;

на фиг.3 изображены изотермы низкотемпературной адсорбции-десорбции азота в биокомпозите CaSiO₃-ГАП;

на фиг.4 показано распределение пор биокомпозита CaSiO₃-ГАП по размерам:

а - расчет по методу BJH;

б - расчет по модели DFT;

на фиг. 5 представлена морфология поверхности биокомпозита, полученного согласно примеру 1;

на фиг. 6 представлена морфология поверхности биокомпозита, полученного согласно примеру 2;

на фиг. 7 представлена морфология поверхности биокомпозита, полученного согласно примеру 3.

Заявляемый способ осуществляют на стандартном оборудовании в несколько этапов.

1. Получение биокомпозита CaSiO₃-ГАП.

В качестве основных прекурсоров используют метасиликат натрия, кальций хлористый, гидрофосфат аммония и гидроксид аммония в виде водных растворов.

Готовят реакционную смесь в форме коллоидного раствора, для чего в тефлоновом стакане перемешивают 88 мл 1 М водного раствора кальция хлористого, 80 мл 1 М водного раствора метасиликата натрия, 5 мл 1 М водного раствора гидрофосфата аммония, 7 мл 25 %-ного водного раствора гидроксида аммония и 20 мл дистиллированной воды.

Взаимодействие прекурсоров происходит по следующим уравнениям реакций:

CaCl₂+Na₂SiO₃→CaSiO₃+2NaCl

10CaCl₂+6(NH₄)₂HPO₄+8NH₄OH→Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂+20NH₄Cl+6H₂O

Далее тефлоновый стакан с коллоидным раствором помещают в стальной автоклав, нагревают в сушильном шкафу пока температура не достигнет 180°С и выдерживают при указанной температуре в течение 6 часов.

После этого автоклав охлаждают, полученный биокомпозит в форме аморфного осадка отделяют путем фильтрации через фильтр «синяя лента», промывают дистиллированной водой в количестве 2 литров и сушат при 100°С на воздухе до удаления остаточной влаги.

Полученный материал просеивают и отбирают фракцию порошка частицами размером 100-200 мкм.

Порошок прокаливают в муфельной печи на воздухе со скоростью разогрева 10°С/мин пока температура не достигнет 800°С, далее выдерживают при достигнутой максимальной температуре в течение 60 минут.

Полученный биокомпозит CaSiO₃-ГАП имеет кристаллический состав и обладает биосовместимыми свойствами.

2. Приготовление раствора хитозана, содержащего ионы серебра.

Хитозан растворяют в уксусной кислоте, перемешивают со скоростью 300 об/мин в течение 6 часов, вводят порошок нитрата серебра при соотношении хитозан : уксусная кислота : порошок нитрата серебра 0,4 г : 40 мл : 0,9 г соответственно, после чего кипятят полученную смесь при 100°С в течение 2 часов.

3. Обработка биокомпозита CaSiO₃-ГАП раствором хитозана, содержащим ионы серебра.

Биокомпозит CaSiO₃-ГАП, полученный на этапе 1, однократно окунают в раствор хитозана, содержащий ионы серебра, приготовленный на этапе 2, либо выдерживают в упомянутом растворе в течение 24 часов.

4. Сушка обработанного биокомпозита.

Обработанный биокомпозит отделяют от раствора хитозана, содержащего ионы серебра, и сушат на воздухе при температуре 20-25°С в течение 1 часа.

В примерах осуществления заявленного способа использовали следующее сырье.

1). Для получения биокомпозита CaSiO₃-ГАП в качестве прекурсоров были использованы соответствующие химреактивы марки «хч»;

2). Для приготовления раствора хитозана, содержащего ионы серебра, использовали:

- хитозан средне-молекулярный, молекулярный вес около 5⋅10⁵ Да (ОАО «Биопрогресс»);

- уксусную кислоту ледяную (CH₃COOH);

- порошок нитрата серебра (AgNO₃, хч, ЗАО «Реактив»).

Пример 1

Готовят реакционную смесь в форме коллоидного раствора, для чего в тефлоновом стакане перемешивают 88 мл 1 М водного раствора кальция хлористого, 80 мл 1 М водного раствора метасиликата натрия, 5 мл 1 М водного раствора гидрофосфата аммония, 7 мл 25 %-ного водного раствора гидроксида аммония и 20 мл дистиллированной воды.

Далее тефлоновый стакан с коллоидным раствором помещают в стальной автоклав, нагревают в сушильном шкафу пока температура не достигнет 180°С и выдерживают при указанной температуре в течение 6 часов.

После этого автоклав охлаждают, полученный биокомпозит в форме аморфного осадка отделяют путем фильтрации через фильтр «синяя лента», промывают дистиллированной водой в количестве 2 литров и сушат при 100°С на воздухе до удаления остаточной влаги.

Полученный материал просеивают и отбирают фракцию порошка частицами размером 150 мкм.

Порошок прокаливают в муфельной печи на воздухе со скоростью разогрева 10°С/мин пока температура не достигнет 800°С, далее выдерживают при достигнутой максимальной температуре в течение 60 минут.

Хитозан растворяют в уксусной кислоте, перемешивают со скоростью 300 об/мин в течение 6 часов, вводят порошок нитрата серебра и кипятят полученную смесь при 100°С в течение 2 часов, причем соотношение хитозан : уксусная кислота : порошок нитрата серебра составляет 0,4 г : 40 мл : 0,9 г соответственно.

Биокомпозит CaSiO₃-ГАП однократно окунают в раствор хитозана, содержащий ионы серебра.

Обработанный биокомпозит отделяют от раствора хитозана, содержащего ионы серебра, и сушат на воздухе при температуре 25°С в течение 1 часа.

Пример 2.

Биокомпозит получают аналогично примеру 1 со следующими отличиями.

При получении биокомпозита CaSiO₃-ГАП отбирают фракцию порошка частицами размером 200 мкм.

Биокомпозит CaSiO₃-ГАП выдерживают в растворе хитозана, содержащего ионы серебра, в течение 24 часов.

Пример 3.

Биокомпозит получают аналогично примеру 1 со следующими отличиями.

При получении биокомпозита CaSiO₃-ГАП отбирают фракцию порошка частицами размером 100 мкм.

Биокомпозит CaSiO₃-ГАП выдерживают в растворе хитозана, содержащего ионы серебра, в течение 64 часов.

Исследовали полученные образцы.

Ренгенофазовый анализ (РФА) проводили на дифрактометре D8 Advance «Bruker AXS» (Германия).

Согласно данным РФА (см. фиг.1), состав биокомпозита CaSiO₃-ГАП включает кристаллическую фазу волластонита ВТ (CaSiO₃) в составе с гидроксиапатитом ГАП (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂). Посторонние примеси отсутствуют.

Изображения структуры были получены методом растровой электронной микроскопии (РЭМ) на приборе Carl Zeiss Ultra 55 (Германия).

По данным РЭМ (см. фиг.2) морфология полученного порошка CaSiO₃-ГАП биокомпозита характеризуется неоднородной структурой из-за композитного состава.

Материал состоит из смешанных игольчатых (волластонит) и монолоитных (гидроксиапатит) агломератов. Структура агломератов рыхлая, что указывает на наличие пористости у биокомпозита.

Удельную поверхность исследовали на анализаторе низкотемпературной адсорбции азота Autosorb IQ «Quantochrome» (США).

По данным анализа пористой структуры порошка CaSiO₃-ГАП биокомпозита установлено, что изотерма низкотемпературной 77 К сорбции-десорбции азота соответствует IV типу кривых классификации IUPAC (см. фиг.3).

Это указывает на то, что образец характеризуется наличием пористой структуры с широким диапазоном распределения микро-, мезо- и макропор по размерам.

По данным расчета экспериментальных данных распределения пор по размерам по методу BJH и согласно расчетам по теории функционала электронной плотности DFT определено, что образец CaSiO₃-ГАП не имеет узкого распределения пор по размерам, диапазон пор составляет в пределах от 4 нм и превышает размеры 60 нм и более (см. фиг.4).

Однако изотерма сорбции-десорбции имеет очень маленький сорбционный гистерезис, что свидетельствует о низкой величине объема пор. Это подтверждается низким значением величины удельной площади поверхности образца CaSiO₃-ГАП~4 м²/г.

Элементный состав поверхности образцов исследовали методом энергодисперсионной спектроскопией (ЭДС) на приставке Bruker (Германия), входящей в комплекс вышеуказанного растрового электронного микроскопа, результаты анализа представлены в таблице 1.

Таблица 1 Элементный состав поверхностей образцов биокомпозита в ат. % Номер спектра C O Si P Cl Ca Ag Спектр 1 9,45 32,49 21,12 9,98 1,62 24,84 0,52 Спектр 2 8,40 49,73 16,27 5,12 1,19 12,80 6,49 Спектр 3 10,86 62,05 11,92 2,35 0,80 6,06 5,96

Отмечено, что увеличение времени выдержки биокомпозита CaSiO₃-ГАП в растворе хитозана, содержащем ионы серебра, влияет на морфологию поверхности готового биокомпозита и на содержание наночастиц серебра в его объеме.

При кратковременном однократном окунании (согласно примеру 1), а также при выдержке биокомпозита CaSiO₃-ГАП в растворе хитозана, содержащем ионы серебра, в пределах 24 часов (согласно примеру 2), морфология образцов биокомпозита изменяется незначительно. Однако содержание наночастиц серебра в составе биокомпозита по данным ЭДС анализа значительно изменяется от 0,52 до 6,49 ат.% (см. табл. 1, спектры 1 и 2).

При увеличении времени выдержки биокомпозита CaSiO₃-ГАП в растворе хитозана, содержащем ионы серебра, наблюдается значительное изменение морфологии поверхности биокомпозита, так как она покрывается монолитной пленкой хитозана, изолируя открытые поры биокомпозита под своим слоем (см. фиг. 7). При этом у образца, полученного согласно примеру 3, содержание наночастиц серебра изменяется незначительно до 5,96 ат.% (см. табл. 1, спектр 3) в сравнении с образцом, полученным согласно примеру 2.

Антибактериальные свойства полученных образцов оценивали путем определения показателя общего микробного числа (ОМЧ) после культивирования указанных образцов в жидкой питательной среде (мясо-пептонный бульон) с бактериями Escherichia coli штамм ATCC 25922, в течение 24 часов, результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Значения общего микробного числа после 24-часового культивирования образцов биокомпозита в жидкой питательной среде с бактериями E.coli Исходное количество бактерий Общее микробное число после 24-часового культивирования биокомпозита
в жидкой питательной среде с бактериями E.coli Пример 1 Пример 2 Пример 3 1,5*10⁸ 0,9⋅10⁸ 1,7⋅10⁴ 2,0⋅10³

На основе сведений из таблицы 2 можно сделать вывод, что все исследуемые образцы биокомпозита обладают антибактериальным эффектом.

Величина ОМЧ снижается на несколько порядков в присутствии образцов, полученных длительной пропиткой в растворе хитозана, содержащем ионы серебра (см. табл. 2, примеры 2 и 3).

Повышенный эффект антибактериальной активности для образца, полученного согласно примеру 3, по сравнению с образцом, полученным согласно примеру 2, при практически равном содержании наночастиц серебра, что установлено по данным ЭДС (см. табл. 1), связан с большим содержанием хитозана на его поверхности, что определено по данным РЭМ (см. фиг. 6 и 7).

Учитывая вышесказанное, оптимальная продолжительность выдержки биокомпозита CaSiO₃-ГАП в растворе хитозана, содержащем ионы серебра, принята равной 24 часам.

Изобретение относится к области медицины и касается способа получения биорезорбируемых остеопластических дисперсных биокомпозитов синтетического типа, предназначенных для лечения заболеваний и повреждений костной системы человека, и может найти применение в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. Предлагаемый способ получения биокомпозита с антибактериальными свойствами на основе волластонита и гидроксиапатита включает приготовление реакционной смеси, содержащей прекурсоры - метасиликат натрия, кальций хлористий, гидрофосфат аммония и гидроксид аммония в виде водных растворов, в форме коллоидного раствора. Указанный коллоидный раствор помещают в автоклав, нагревают, пока температура не достигнет 180°С, и выдерживают при указанной температуре в течение 6 часов. Полученный биокомпозит в форме аморфного осадка отделяют, промывают, сушат и прокаливают со скоростью разогрева 10 °С/мин, пока температура не достигнет 800°С, выдерживают при достигнутой максимальной температуре в течение 60 минут. Полученный биокомпозит кристаллического состава обрабатывают раствором хитозана, содержащим ионы серебра, после чего отделяют обработанный биокомпозит и сушат его на воздухе при температуре 20-25°С в течение 1 часа. При этом для приготовления раствора хитозана, содержащего ионы серебра, хитозан растворяют в уксусной кислоте, перемешивают со скоростью 300 об/мин в течение 6 часов, вводят порошок нитрата серебра при соотношении хитозан : уксусная кислота : порошок нитрата серебра 0,4 г : 40 мл : 0,9 г соответственно и кипятят полученную смесь при 100°С в течение 2 часов. Технический результат: упрощение технологии по сравнению с прототипом за счет сокращения количества реагентов, требующих более тщательного выжигания из объема биокомпозита; получение биокомпозита, обладающего биосовместимыми и антибактериальными свойствами. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр., 7 ил.

1. Способ получения биокомпозита с антибактериальными свойствами на основе волластонита и гидроксиапатита при использовании в качестве прекурсоров метасиликата натрия, кальция хлористого и гидрофосфата аммония в виде водных растворов, включающий приготовление содержащей прекурсоры реакционной смеси, отделение, промывание, сушку полученного на ее основе биокомпозита и его прокаливание путем нагревания в атмосфере воздуха до достижения температуры 800°С с последующей выдержкой при достигнутой максимальной температуре в течение 60 минут, отличающийся тем, что для приготовления реакционной смеси в форме коллоидного раствора дополнительно используют гидроксид аммония в виде водного раствора, указанный коллоидный раствор помещают в автоклав, нагревают, пока температура не достигнет 180°С, и выдерживают при указанной температуре в течение 6 часов, полученный биокомпозит в форме аморфного осадка отделяют, промывают, сушат и прокаливают со скоростью разогрева 10 °С/мин, пока температура не достигнет 800°С, далее выдерживают при достигнутой максимальной температуре в течение 60 минут, полученный биокомпозит кристаллического состава обрабатывают раствором хитозана, содержащим ионы серебра, после чего отделяют обработанный биокомпозит и сушат его на воздухе при температуре 20-25°С в течение 1 часа, при этом для приготовления раствора хитозана, содержащего ионы серебра, хитозан растворяют в уксусной кислоте, перемешивают со скоростью 300 об/мин в течение 6 часов, вводят порошок нитрата серебра при соотношении хитозан : уксусная кислота : порошок нитрата серебра 0,4 г : 40 мл : 0,9 г соответственно и кипятят полученную смесь при 100°С в течение 2 часов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку биокомпозита производят путем его однократного окунания в раствор хитозана, содержащий ионы серебра.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку биокомпозита производят путем его выдерживания в растворе хитозана, содержащем ионы серебра, в течение 24 часов.