Способ оценки динамики тромбообразования при использовании гемостатических средств Российский патент 2024 года по МПК G01N33/86 G09B23/28 G01N1/30 

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии, а именно к оценке динамики тромбообразования при использовании гемостатических средств

Тромбоэластография – методика, направленная на оценку и регистрацию свертывания крови и фибринолиза. При использовании данного лабораторного метода исследования крови оцениваются следующие показатели: время свертываемости крови (t) – время с начала теста до достижения амплитуды в 2 мм; время реакции (R) – время, необходимое для формирования первых волокон фибрина; время, затраченное на формирование сгустка крови (K) – время формирования сгустка определенной прочности; кинетика образования сгустка (Angle) – скорость роста фибриновой сети и её структурообразование; максимальная амплитуда (МА) – отражает максимальную прочность сгустка; прочность сгустка (G); амплитуда (A) – характеризует плотность и стабильность сгустка крови; коагуляционный индекс (Ci) – характеризует направленность изменений гемостаза и степень их компенсации; расчетный процент лизиса (EPL) – это процентное изменение максимальной амплитуды с течением времени; индекс лизиса за 30 минут (Ly30) – характеризует процесс растворения сгустка за 30 минут.

Наиболее близким к предлагаемому способу метод описан в работе Е.Ф. Чередникова и др. Экспериментальное изучение влияния современных порошкообразных гемостатических средств на систему регуляции агрегатного состояния крови // Вестник новых медицинских технологий. - 2021. - № 4. - С. 30-34. Коллеги оценивали следующие показатели: контактную фазу коагуляции, её интенсивность, константу тромбиновой активности, скорость свертывания крови, интенсивность коагуляционного драйва, интенсивность полимеризации сгустка, время формирования фибрин-тромбоцитарного сгустка, максимальную плотность сгустка, интенсивность тотального свертывания, время начала фибринолиза. К недостаткам представленного Е.Ф. Чередниковым и др. способа можно отнести отсутствие пробоподготовки материала, а также стоит отметить такое соотношение массы крови и исследуемого порошка, которое в значительной мере будет изменять вязкость крови ввиду механического её повышения. В связи с чем данный метод не позволяет объективно оценить влияние гемостатического порошка на динамику тромбообразования и требует доработки.

Техническим результатом изобретения является разработка способа оценки динамики тромбообразования при использовании гемостатических средств с целью сравнительного изучения влияния на показатели свертывания изучаемых образцов. Предлагаемый способ прост для выполнения, позволяет с высокой точностью оценить влияние гемостатических средств на процесс тромообразования.

Технический результат изобретения достигается тем, что используется метод тромбэластографии донорской крови стабилизированной цитратом натрия (Na₃C₆H₅O₇), предварительно смешанной с тестируемым гемостатическим средством. При этом соотношение массы крови и тестируемого образца определяется методом подбора для каждого гемостатического средства таким образом, чтобы масса тестируемого средства не влияла на вязкость крови.

Способ осуществляется следующим образом.

В стерильных условиях кровь доноров-добровольцев с их письменного согласия, соблюдая правила асептики и антисептики, для исследования забирают из локтевой вены в вакутайнер, объемом 4,5 мл и содержащий 3,2% раствор цитрата натрия – Na₃C₆H₅O₇. Соотношение объемов крови и цитрата натрия – 9:1. Перемешивание крови с антикоагулянтом производят аккуратным переворачиванием вакутайнера 3 раза.

На аналитических весах производят навеску гемостатического порошка или предварительно измельченного гемостатического средства. Соотношение массы крови и тестируемого образца подбирается, таким образом, чтобы масса тестируемого средства не влияла на вязкость крови. С помощью микропипетки кровь донора переносят из вакутайнера в мерный стеклянный стакан, который затем помещают на платформу магнитной мешалки. После чего в него постепенно течение 30 секунд засыпают указанную массу тестируемого порошкообразного кровоостанавливающего средства для наиболее полного контакта всех его частиц с донорской кровью. Перемешивают в течение 3-х минут со скоростью 1000 об/мин. Затем в кюветку тромбоэластографа добавляют кровь, смешанную с порошкообразным гемостатическим средством или предварительно измельченным гемостатическим средством до состояния порошка в объеме 100 мкл и 100 мкл тромбопластин-кальциевой смеси согласно стандартной методике. Запускают процесс исследования в соответствии с инструкцией к тромбоэластографу.

Пример конкретного использования

Исследование проводили под наблюдением регионального этического комитета при ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России согласно действующим международным этическим нормам. Каждый донор-доброволец подписывал информированное добровольное согласие на медицинское вмешательство. В стерильных условиях лаборатории экспериментальной хирургии и онкологии научно-исследовательского института экспериментальной медицины ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России в утренние часы, натощак у 10 здоровых доноров-добровольцев (юноши в возрасте 20-23 лет), не имеющих в анамнезе патологии системы гемостаза вакуумным способом забирали кровь из кубитальной вены 4,2 мл.

Предварительно взвешивали 0,006 г (соотношение массы пробирки крови и тестируемого образца 1:650) исследуемого гемостатического порошка собственного производства состоящей из натриевой соли карбоксиметиллцеллюлозы с добавлением коллагена глубоководного кальмара в разных концентрациях. Данное соотношение определяли методом подбора в первой части исследования (период пробоподготовки). С помощью микропипетки кровь донора переносили из вакутайнера в мерный стеклянный стакан, который затем размещали на платформе магнитной мешалки (RH basic 2 IKAMAG, IKA, Германия). После этого постепенно засыпали указанную массу порошка для полного контакта частиц порошка с кровью в течение 30 секунд, перемешивая в течение 3-х минут при 1000 об/мин. Затем, в кювету тромбоэластографа (TEG 5000, Haemonetics Corporation, США) добавляли 100 мкл тромбопластина с кальцием (реагент для определения протромбинового времени, кампании НПО «Ренам», Россия) для рекальцификации цитратной крови. Сюда же добавляли 100 мкл цитратной крови, заранее смешанной с исследуемым гемостатическим порошком. Запускали процесс исследования в соответствие с инструкцией к тромбоэластографу.

Исследования проводили в следующих группах:

Первая экспериментальная группа: измельченная до состояния порошка губка кровоостанавливающая на основе натриевой соли карбоксиметиллцеллюлозы (Na-КМЦ) с добавлением 15% коллагена относительно массы Na-КМЦ (Na-КМЦ+коллаген (85/15);

Вторая экспериментальная группа: измельченная до состояния порошка губка кровоостанавливающая на основе Na-КМЦ с добавлением 25% коллагена относительно массы Na-КМЦ (Na-КМЦ+коллаген (75/25);

Третья экспериментальная группа: измельченная до состояния порошка губка кровоостанавливающая на основе Na-КМЦ с добавлением 50% коллагена относительно массы Na-КМЦ (Na-КМЦ+коллаген (50/50).

В каждой экспериментальной группе выполняли по 10 исследований.

Согласно полученным результатам исследования, которые представлены в таблице (таблица 1), можно сделать вывод о том, что наибольшее значение среднего времени свертывания крови (t) характерно для первой экспериментальной группы – 13,68 секунд, наименьшее – для второй экспериментальной группы – 12,82 секунд. Статистически значимые отличия обнаружены при сравнении первой и третьей, также второй и третьей экспериментальной группы. Среднее время свертывания в первой группе на 0,28 секунд меньше чем в третьей, во второй группе на 0,58 секунд меньше, чем в третьей.

Таблица 1 Группа t, sec R, min K, min Angl, degr MA, mm G, d/sec EPL,% A,
min Ci Ly 30, % Na-КМЦ+
коллаген (85/15) 13,68
[12,06;15,5] 6,8 [5,83; 7,55] 2,8 [2,2; 5,3] 56 [40,7; 59,7] 56,8 [50,5; 61,3] 6,6 [5,3; 8,15] 0,15 [0; 0,38] 52,1 [50,2; 63,3] 1,1 [0,8; 2,5] 0,2 [0,03; 0,38] Na-КМЦ+
коллаген (75/25) 12,82
[10,74;14,78] 5,9 [5,05; 6,45] 6,45 [3,8; 10,9] 41,85 [19,7; 54,9] 44,95 [39,3; 50,45] 4,1 [3,28; 5,08] 0
[0;0] 44,15 [42,6; 50,7] 0,5 [0,1; 0,95] 0[0;0] Na-КМЦ+
коллаген (50/50) 13,4
[12,33;14,45] 7,5
[7,2; 7,8] 2,4 [2,4; 2,6] 57,25 [52,7; 58] 58,2 [52,7; 58,6] 7
[5,7;
7,1] 2,1 [2;
4,15] 49,7 [41,4; 50,9] 1,5 [0,6; 1,7] 2,1[2; 4,15] p₁ 0,07 0,03* 0,02* 0,02* 0,00* 0,00* 0,05 0,02* 0,01* 0,02* p₂ 0,00* 0,07 0,16 0,21 0,57 0,85 0,00* 0,09 0,62 0,00* p₃ 0,01* 0,00* 0,00* 0,01* 0,00* 0,00* 0,00* 0,73 0,02* 0,00*

Примечание: * – статистически значимые значения (p≤0,05);

р₁ – достоверность отличий значений группы № 1 и группы № 2;

р₂ – достоверность отличий значений группы № 1 и группы № 3;

р₂ – достоверность отличий значений группы № 2 и группы № 3.

Наименьшее среднее время реакции (R) характерно для второй контрольной группы – 5,9 минут, а наибольшее отмечено в третьей группе – 7,5 минут, промежуточные значения обнаружены в первой опытной группе – 6,8 минут. Статистически значимые различия (р≤0,05) были получены при сравнении первой и второй, а также второй и третьей групп. Среднее время реакции в первой группе оказалось на 0,7 минут больше, чем в третьей, а во второй на 1,6 больше чем в третьей.

При оценке результатов времени затраченного на формирование сгустка (K), выяснили, что быстрее всего данный процесс проявлялся в третьей группе – 2,4 минут, дольше всего во второй группе – 6,45 минут. Статистически значимые различия (р≤0,05) наблюдались между первой и второй, второй и третьей экспериментальными группами. Время, затраченное на формирование сгустка, во второй группе было на 3,65 минут больше, чем в первой, и на 4,05 больше чем в третьей.

Оценивая кинетику образования сгустка (Angle), обнаружили, что наибольшее значение (таблица 1) имело место во второй группе – 57,25 градусов, а наименьшее в третьей – 41,85 градусов. При сравнении первой и второй, второй и третьей групп были получены статистически значимые отличия (р≤0,05). Кинетика образования сгустка во второй группе на 14,15 градусов меньше, чем в первой, и на 15,4 градусов меньше, чем в третьей.

Наибольшая максимальная амплитуда (МА) наблюдалась в третьей опытной группе – 58,2 мм, а наименьшая во второй группе – 56,8 мм. Между перовой и второй, а также второй и третьей группой обнаружены статистически значимые отличия (р≤0,05). Максимальная амплитуда во второй группе на 11,85 мм меньше, чем в первой, и на 13,25 меньше, чем в третьей.

Наибольшая прочность сгустка (G) была обнаружена в третьей группе – 7 градусов/секунду, наименьшая прочность наблюдалась во второй группе – 4,1 градусов/секунду. Статистически значимые отличия (р≤0,05) были получены при сравнении перовой и второй, второй и третьей группы. Значения во второй группе сравнения оказались на 2,5 меньше, чем в первой, и на 2,9 меньше чем в третьей.

Исследуя результаты расчетного процента лизиса (EPL), установили, что наибольшее значение отмечается в третьей группе – 2,1%, наименьший во второй – 0%. При оценке результатов статистически значимые отличия (р≤0,05) получены при сравнении первой и третьей, а также второй и третьей групп. Расчетный процент лизиса во второй группе на 0,15% меньше, чем в первой, а также на 2,1% меньше, чем в третьей.

Исходя из результатов (таблица 1), наибольшая амплитуда (A) наблюдалась в первой опытной группе – 52,1 минут, наименьшее во второй опытной группе – 44,15 минут. Статистические отличия обнаружены при сравнении первой (на 7,95 минут больше) и второй экспериментальной групп.

Наибольшее значения коагуляционного индекса (Ci) выявлены в третьей группе – 1,5, наименьшее во второй – 1,1. Статистически значимые отличия (р≤0,05) наблюдались при сравнении первой и второй, а также второй и третьей группами. Коагуляционный индекс во второй группе был на 0,6 меньше, чем в первой, а также на 1 меньше, чем в третьей.

Наибольший индекс лизиса через 30 минут (Ly30) наблюдался в третьей экспериментальной группе – 2,1%. При сравнении групп между собой, статистически значимые различия (р≤0,05) были получены во всех случаях. Индекс лизиса в первой группе на 0,2% больше, чем во второй, на 1,9%, чем в третьей. Во второй группе на 2,1% меньше, чем в третьей.

Изменения указанных параметров отражает динамику изменения вязкости крови, т.е. тромбообразования при внесении гемостатического порошка. Причем важно отметить, что колебания оцениваемых параметров (в сторону гиперкоагуляции) нарастает с увеличением количества коллагена в составе гемостатического средства.

Таким образом, был разработан способ оценки динамики тромбообразования при использовании гемостатических средств, который позволяет с высокой точностью оценить влияние гемостатических средств на тромообразования, а также прост для выполнения.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для сравнительной оценки динамики тромбообразования при использовании местных гемостатических средств. Осуществляют выполнение тромбоэластографии. Исследуемые порошкообразные кровоостанавливающие средства или предварительно измельченные твердые формы кровоостанавливающих средств добавляют в стеклянный стакан после помещения в него стабилизированной цитратом натрия крови донора в соотношении массы тестируемого образца и массы крови с учетом массы пробирки 1:650 с добавлением коллагена в соотношении от 15% до 50%, которое определяют на этапе пробоподготовки, таким образом, чтобы подобранная масса тестируемого средства не влияла на вязкость крови. Перемешивают кровь и тестируемый материал с помощью магнитной мешалки в течение трех минут. 100 мкл полученной после смешивания крови помещают в кювету тромбоэластографа, затем запускают процесс исследования в соответствии с инструкцией к тромбоэластографу. Сравнительную оценку тромбообразования осуществляют по параметрам: время свертываемости крови (t), время реакции (R), время, затраченное на формирование сгустка крови (K), кинетика образования сгустка (Angle), максимальная амплитуда (МА), прочность сгустка (G), амплитуда (A), коагуляционный индекс (Ci), расчетный процент лизиса (EPL), индекс лизиса за 30 минут (Ly30). Способ обеспечивает возможность оценки динамики тромбообразования при использовании гемостатических средств с целью сравнительного изучения влияния на показатели свертывания изучаемых образцов за счет использования метода тромбоэластографии, при этом соотношение массы крови и тестируемого образца определяется методом подбора для каждого гемостатического средства таким образом, чтобы масса тестируемого средства не влияла на вязкость крови. Предлагаемый способ прост для выполнения, позволяет с высокой точностью оценить влияние гемостатических средств на процесс тромбообразования. 1 табл., 1 пр.

Способ сравнительной оценки динамики тромбообразования при использовании местных гемостатических средств, включающий выполнение тромбоэластографии, отличающийся тем, что исследуемые порошкообразные кровоостанавливающие средства или предварительно измельченные твердые формы кровоостанавливающих средств добавляют в стеклянный стакан после помещения в него стабилизированной цитратом натрия крови донора в соотношении массы тестируемого образца и массы крови с учетом массы пробирки 1:650 с добавлением коллагена в соотношении от 15% до 50%, которое определяют на этапе пробоподготовки, таким образом, чтобы подобранная масса тестируемого средства не влияла на вязкость крови, перемешивают кровь и тестируемый материал с помощью магнитной мешалки в течение трех минут, 100 мкл полученной после смешивания крови помещают в кювету тромбоэластографа, затем запускают процесс исследования в соответствии с инструкцией к тромбоэластографу, сравнительную оценку тромбообразования осуществляют по параметрам: время свертываемости крови (t), время реакции (R), время, затраченное на формирование сгустка крови (K), кинетика образования сгустка (Angle), максимальная амплитуда (МА), прочность сгустка (G), амплитуда (A), коагуляционный индекс (Ci), расчетный процент лизиса (EPL), индекс лизиса за 30 минут (Ly30).