Описание
Настоящее изобретение относится к применению белкового компонента, выделенного из хроматина растений. Изобретение, в частности, относится к применению белкового компонента, выделенного из растительного хроматина после диссоциации последнего, в качестве антимикробного агента, а также к методу получения указанного антимикробного агента.
Большинство организмов-эукариотов демонстрирует широкое разнообразие защитных механизмов, направленных против инфекционных агентов. Несколько подобных механизмов основано на фундаментальных отличиях, которые имеют место в составе и структуре мембран микробов и клеток сложного многоклеточного организма, т.е. эти механизмы направлены против внешних мембран микробов, которые чувствительны к такому воздействию. Указанные мембраны образованы липидами, имеющими отрицательно заряженные головные группы, которые обращены наружу, и микробам, вероятно, трудно оказать сопротивление подобному воздействию путем изменения состава и структуры своей мембраны. Таким образом, вещества, обладающие антимикробным действием, являются вероятными кандидатами для замены антибиотиков.
Одним из примеров являются белки переноса фосфолипидов, которые способны перемещать фосфолипиды между мембранами. Описаны антимикробные белки переноса фосфолипидов, выделенные из широкого круга образцов растений, в том числе хлебных злаков, и эти белки различаются по их активности по отношению к различным патогенам. Например, в патенте США 5698200 показано, что части растения можно защитить от растительных патогенных бактерий с помощью водного экстракта, полученного из осоложенного зерна злаков.
Тем не менее, наиболее изученным классом защитных средств являются антимикробные пептиды. Их находят во всех формах жизни от растений до насекомых и животных, в том числе у моллюсков, ракообразных, земноводных, птиц, рыб, млекопитающих и человека.
Указанные пептиды непосредственно взаимодействуют с бактериями и убивают их. Их называют антимикробными, поскольку они обладают необычайно широким спектром активности, в том числе способностью убивать или нейтрализовать грамотрицательные и грамположительные грибки (в том числе дрожжи), паразиты (в том числе планарии и нематоды), раковые клетки и имеющие оболочки вирусы, такие как ВИЧ и вирус герпеса. В общем случае указанные агенты отличаются по своей длине, начиная всего лишь с 12 аминокислот, и до молекул, содержащих более 70 аминокислотных остатков. Обнаружено свыше 500 подобных пептидов.
Характер антимикробного действия в большинстве своем катионогенных антимикробных пептидов подробно изучен для таких пептидов, как меллитин, магаинин, грамицидин, цекропин и дефензины. Антимикробные молекулы обычно также повреждают мембраны организмов, которых они атакуют.Было обнаружено, что катионогенные антимикробные пептиды обладают бактерицидной активностью как in vitro, так и in vivo. Они убивают очень быстро, с трудом выбирают стойкие мутанты, проявляют синергизм при смешении с обычными антибиотиками, другими пептидами, а также лизоцимами и способны убивать бактерии в животных моделях.
Как следствие, антимикробные пептиды животного происхождения в настоящее время разрабатывают в качестве новых антибиотических лекарств. Примерами являются синтетический вариант магаинина (пексиганан) и аналог протегрина, антимикробного пептида, который первоначально был выделен из нейтрофилов свиньи.
Однако оказалось, что природные источники экономически невыгодны для производства новых альтернативных антибиотиков. Единственным исключением является атимикробный пептид низин, который может быть эффективно получен от штамма Lactococcus lactis, обладающего высокой стойкостью по отношению к этому веществу.
Было также обнаружено большое количество белков, имеющих большие размеры, или их фрагментов, которые обладают антимикробной активностью. Например, белок макрофага крысы, убиквидицин, оказался тождественным рибосомальному белку S30. Кроме того, два антимикробных пептида в желудке лягушки-быка (Rana catesbeina) являются производными пепсиногена по N-концу. Аналогичным образом антимикробный пептид, получивший название буфорин I, выделен из тканей желудка азиатской жабы (BBRC 218: 408, 1996). Было показано, что аминокислотная последовательность этого пептида, содержащая 39 аминокислот, совпадает с 37 из 39 аминотерминальных остатков гистона H2A из Xenopus.
Далее, антимикробным потенциалом может обладать вся молекула пептида. Антимикробная активность была обнаружена в кислотных экстрактах печени, кишечника и желудка атлантических лососей (BBRC 284: 549, 2001). Соответствующий антимикробный белок может быть выделен из печени лосося с помощью кислотной экстракции с последующим осаждением сульфатом аммония, препаративной гель-хроматографией (гель-фильтрацией), ВЭЖХ с обращенной фазой и ВЭЖХ по размеру молекул. Было установлено, что антимикробный белок лосося имеет молекулярную массу 27,7 кДа и был идентифицирован как белок гистон H1. В патентной заявке WO 200110901 белок гистон H1, выделенный из тимуса коровы, используют в составах антимикробных композиций, предназначенных для лечения микробных инфекций в различных организмах- эукариотах. Таким образом, оказалось, что белки, выполняющие многие уже установленные функции, проявляют еще одно свойство, являясь антимикробными.
Однако использования белков коровы, в частности белков из тимуса коровы, следует избегать, поскольку указанный материал может быть загрязнен вредными вирусами, особенно вирусом гепатита, или другими патогенными агентами, например прионами. Исходный материал, полученный от коровы - как загрязненный, так и не загрязненный - если его намереваются использовать для лечения человека, должен быть подвергнут особенно строгим испытаниям.
Далее, выделение новых альтернативных антибиотиков включает сбор определенных органов или тканей животного с последующей комплексной очисткой с целью получения продукта, который можно использовать для людей или домашних животных.
Целью настоящего изобретения является новый антимикробный агент, который позволяет устранить указанные выше проблемы.
Еще одной целью изобретения является антимикробный агент, при использовании которого устраняется риск передачи инфекционных агентов, являющихся патогенными для человека и/или животных.
Еще одной целью изобретения является антимикробный агент, который не обладает вкусом при его использовании вместе с пищей.
Еще одной целью изобретения является способ получения антимикробного агента, в котором используют дешевые исходные материалы.
Еще одной целью изобретения является способ получения антимикробного агента практически в неограниченном количестве.
Наконец, еще одной целью настоящего изобретения является способ получения антимикробного агента, который не требует больших затрат на заводах на проведение бактериальной ферментации.
Поставленные цели достигаются путем использования способа по настоящему изобретению.
В соответствии с изобретением предлагается способ, позволяющий просто и рационально получать белковый компонент, который может быть использован в качестве антимикробного препарата, например лекарства, полного консервирующего агента, применяемого в процессе производства и при транспортировании, в качестве функциональной пищевой или нутрицевтической добавки, а также в качестве питательной добавки для животных.
Белковый компонент может быть получен на удивление легко из изначально инертного исходного материала, содержащего растительный хроматин. В способе по изобретению ДНК отделяют от основного ядерного хроматина растений. Растительный хроматин преимущественно получают из семян растений. Подходящие семена растений получают от овса, сорго, пшеницы, ячменя, ржи, кукурузы, риса, рапса, сои, проса или гречихи. Тем не менее, для получения антимикробного белкового компонента в широких масштабах может быть использован любой хроматинсодержащий растительный материал, такой как морские водоросли и другие морские растения.
Растительный хроматин, который используют для выделения белкового компонента, должен представлять собой гетерохроматин (скрытый хроматин или «замусоренные» ДНК). Гетерохроматин является гипоацетилированным (деацетилированным) хроматином, который вследствие большего электроположительного заряда принимает более сжатую форму, чем гиперацетилированный хроматин.
Далее, выбор исходного материала для последующего проведения специфической экстракции белка зависит также от расположения клеточной ткани растений и состояния дифференциации. Например, ткани, образованные маленькими клетками, обладают более высокой клеточной плотностью, а потому, вероятно, содержат больше нуклеиновых кислот и сопутствующего антибактериального белкового компонента, чем то же самое количество ткани, образованной клетками более крупных размеров.
По аналогии многие растения вследствие большого содержания гетерохроматина имеют базальные геномы очень больших размеров, что еще более усиливается вследствие возможной полиплодии. В данном описании рассматривается количество ДНК на одну гаплоидную клетку, которое измеряют количеством пар оснований (с-значение). Вариация содержания ДНК в организме отражается его с-значением или размером базального генома. С-значение определяют как содержание ДНК, измеренное по массе или количеству пар оснований в единичной копии полной последовательности ДНК, обнаруженной внутри клеток данного организма. Оно представляет собой количество ДНК в ее нереплицированном гаплоиде или гаметическом ядре независимо от уровня плоидности таксона. Таким образом, с-значение равно размеру генома в диплоидных видах, однако всегда превосходит размер генома в полиплоидных видах.
Предпочтительнее также использовать самообновляющиеся недифференцированные стволовые клетки растений. Их находят в меристемах, т.е. областях, которые обеспечивают новый рост кончиков побегов и корешков. Таким образом, концы корешков сеянцев растений являются непревзойденным исходным материалом для экстракции хроматина и последующего выделения белкового компонента по настоящему изобретению. Подобный исходный материал легко доступен в неограниченных количествах, поскольку представляет собой отходы в производстве пивоваренного солода и масла из ростков пшеницы.
Для получения белкового компонента по настоящему изобретению подходят также другие исходные растительные материалы из клеток, которые митотически делятся в оптимальных условиях роста. Могут быть использованы любые развивающиеся побеги, корешки или ростки в стадии всхожести. Преимущественно используют семена одного из четырех видов кукурузы, которым дают прорасти.
Экономичным исходным материалом для использования по настоящему изобретению является так называемый зеленый солод, который представляет собой исходный материал для производства пива. Пивоваренная промышленность производит зеленый солод из ячменя, которому после увлажнения дают прорастать в течение шести дней (осоложение). Этот промышленно получаемый зеленый солод или его побочные продукты (корешки), в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы для производства антимикробного белкового компонента.
Таким образом, подходящими для экстракции материалами являются корешки диплоидной кукурузы и ячменя (с-значение ДНК составляет 5000 мегапар оснований), а также лука (с-значение ДНК составляет 18000 мегапар оснований). Предпочтительно антибактериальный белковый компонент экстрагируют из источника хроматина, с-значение ДНК которого превышает 3000 мегапар оснований.
Наиболее предпочтительно, когда исходным материалом на стадии очистки служит растительный хроматин, выделенный из быстроразмножающихся клеток растений, находящихся в S-фазе. Так, прорастающие семена (зерна) с их корешками, а также молодыми листьями содержат большое количество клеток в S-фазе.
В способе получения белкового растительного компонента по настоящему изобретению, который обладает антимикробной активностью, включаются следующие стадии:
гомогенизация растительного материала с целью высвобождения его растительного хроматина;
разложение растительного хроматина с помощью агента разложения в гидрофобных условиях;
разделение подвергнутого разложению растительного хроматина на индивидуальные фракции, одна из которых содержит растительный белковый компонент, с помощью методов разделения путем гидрофобного взаимодействия.
Таким образом, растительный материал вначале подвергают гомогенизации. В этом смысле термин гомогенизация означает разрушение клеточных стенок растительного материала таким образом, что высвобождается растительный хроматин и образуется гомогенат в виде суспензии. Стенки клеток могут быть разрушены любыми способами, известными специалистам из области техники, включая, но этими примерами не ограничивается, интенсивное перемешивание с большими сдвиговыми усилиями, обработку ультразвуком, механическое разрушение, разрыв под действием давления и т.д. Клеточные стенки разрушаются с помощью подходящего устройства, при этом получают гомогенат.
Растительный хроматин в гомогенате затем разлагают в гидрофобных условиях с помощью агента разложения в виде его водного раствора. Этими условиями являются такие, которые способствуют гидрофобным взаимодействиям.
Подходящими агентами разложения являются мочевина, гуанидинхлорид и соль соляной кислоты. Предпочтительно солью соляной кислоты является хлорид натрия с большой ионной силой.
Определенные преимущества предоставляются, если гомогенизацию растительного материала проводят в присутствии агента разложения. В этом случае процедура очистки упрощается, а количество стадий очистки уменьшается.
Процедуру очистки зеленого солода проводят путем гомогенизации солода в практически насыщенном растворе соли, содержащем 4 М хлорида натрия. Высокая ионная сила раствора вызывает разложение хроматина, а также нуклеосом, при этом одновременно предотвращается деградация белкового материала под действием протеаз. Гомогенизацию предпочтительно проводят в присутствии гидрофобной матрицы.
Гомогенат можно пропустить сквозь сита или проволочную сетку или т.п. с целью удаления клеточного дебриса или других частиц, выделившихся из растительного хроматина, которые остаются на сите. В итоге получают прозрачный раствор, что облегчает последующую очистку подвергнутого разложению растительного хроматина.
Подвергнутый разложению растительный хроматин затем разделяют на индивидуальные фракции, одна из которых содержит растительный белковый компонент, обладающий антимикробной активностью. Разделение предпочтительно проводят с помощью методов разделения путем гидрофобного взаимодействия. Методом разделения путем гидрофобного взаимодействия преимущественно является гидрофобная хроматография.
Другими примерами подходящих методов разделения являются способы распределения в полимерных системах, такие как распределительная хроматография, распределение в противотоке и распределение в газовом афроне. Разделение компонентов подвергнутого разложению хроматина иначе проводят на колонке с гелями на основе хелатов металлов или с иммобилизованным гепарином.
Функциональный лиганд матрицы, используемой для осуществления процедуры гидрофобного взаимодействия и/или разделения, должен быть простой эфирной группой, изопропильной, бутильной или октильной группой. Следует избегать фенильных групп. Предпочтительно функциональным лигандом является бутильная группа на агарозной матрице, которая имеет 4% сшивок. Получаемая плотность лиганда составляет 40-50 мкмол/мл, что обеспечивает способность к связыванию, соответствующую 7 мг IgG на миллилитр.
Например, после проведения скрининга гомогената зеленого солода в виде суспензии к полученному раствору порциями добавляют гидрофобную матрицу, при этом гидрофобной матрицей служит гель для проведения хроматографии путем гидрофобного взаимодействия, содержащий активные бутильные группы. Подходящими матрицами являются Novarose® S-Butyl 1000/40 от компании Inovata AB, Бромма, Швеция, и Butyl Sepharose® 4 от компании Amersham Pharmacia Biotech, Швеция. Затем гидрофобную матрицу промывают раствором соли с большой ионной силой, при этом ДНК вымывается.
Гидрофобную матрицу далее помещают в колонку и подвергают поэтапному градиентному элюированию раствором хлорида натрия с понижающейся ионной силой. Отдельный антимикробный белковый компонент элюируется при концентрации 1М NaCl.
Белковый компонент можно затем очистить с помощью обычных методов, пригодных для очистки пептидов/белков. Подобные методы включают центрифугирование, осаждение в изоэлектрической точке, фазовые разделения, ультрафильтрацию, гель-хроматографию (хроматографию по размеру молекул), ионообменную хроматографию или ВЭЖХ, а также комбинации указанных методов. Последующий процесс разделения предпочтительно проводят с помощью гель-хроматографии или ионообменной хроматографии.
Этап проведения препаративной гель-хроматографии наиболее предпочтительно осуществляют на колонке, заполненной гелем с пределом исключения, равным 100 кДа. Перед загрузкой фракции 1 М раствора NaCl, проявляющей антимикробную активность, колонку приводят в равновесное состояние с помощью дистиллированной воды. Затем колонку элюируют дистиллированной водой или ацетатом аммония. В этом случае обессоливание и очистка происходит в одно и то же время и на одной и той же стадии. Белковый компонент может быть сконцентрирован до сухого состояния с помощью лиофилизации без применения дальнейших стадий очистки.
Выделяют фракцию белка, имеющую кажущуюся молекулярную массу от 10 до 20 кДа, которая проявляет антимикробные свойства.
Опытному специалисту должно быть понятно, что очистку белкового компонента можно осуществить с помощью многих других способов, известных специалистам из данной области техники, которые все охватываются настоящим изобретением.
В качестве разлагающего агента может также использоваться комплексообразующий агент, такой как гепарин, альгиновая кислота, фитиновая кислота или соединение ванадия, при условии, что он разлагает растительный хроматин на индивидуальные компоненты. В качестве разлагающего агента особенно предпочтительна альгиновая кислота, при этом она образует альгинатные комплексы с белковым компонентом, обладающим антимикробной активностью. Подобные комплексы могут использоваться для последующей очистки или же применяться сами по себе для медленного высвобождения из них антимикробной активности.
Перед разделением разложенного растительного хроматина на индивидуальные фракции, в соответствии с изобретением, с помощью, например, методов разделения путем гидрофобного взаимодействия, никакая вообще антимикробная активность не обнаруживается в исходном материале или разложенном хроматине. После того как растительные белковые компоненты очищены в соответствии с описанием настоящего изобретения, автоматически используют гетерохроматин. Таким образом, биологическая активность последовательно образуется при физическом разделении компонентов хроматина. Теоретически процедура разделения может привести к изменению молекулярной структуры компонентов.
Считается, что антимикробные пептиды осуществляют свое воздействие на прокариоты посредством положительного заряда. Ожидается, что наиболее вероятный механизм действия белкового компонента по настоящему изобретению не отличается от известного для других катионогенных полипептидов. Однако известные основные пептиды допускают взаимодействие с клеточными мембранами, которое напоминает действие детергентов. Подобный механизм действия белкового компонента подтверждается его активностью по отношению как к грамположительным, так и грамотрицательным бактериям.
В соответствии с изобретением из других растительных материалов после элюирования из гидрофобной матрицы при использовании других процедур очистки могут быть получены другие белковые компоненты, обладающие антимикробной активностью. Это вызвано тем фактом, что белки из разных биологических материалов обладают различными послесинтетическими модификациями, которые отражают активность клеток растительного материала. Так, на схему разделения должна оказать влияние, например, степень ацетилирования, фосфорилирования, метилирования, убиквитинизации, гликозилирования, а также АДФ-рибозилирования белкового компонента, полученного по настоящему изобретению.
Кроме того, белковый компонент, выделенный из растительного хроматина, может быть затем химически модифицирован. Подобные модификации включают изменения в молекулярной массе и/или уровне ацетилирования и могут привести к формам препаратов, которые обладают более специфической биологической активностью.
Антимикробный эффект белкового компонента, полученного с использованием метода по настоящему изобретению, может быть установлен стандартным методом Bioscreen®, при этом в качестве контрольного вещества применяют низин. По сравнению с низином для белкового компонента был получен эффект, соответствующий 2-4 мг/мл, при этом эффект проявляется через гибель. Более того, обнаружен эффект по отношению к грамотрицательным бактериям, который отсутствует у низина.
Простой метод очистки по настоящему изобретению позволяет производить антимикробный белковый компонент практически в неограниченных масштабах. Выход по процессу составляет приблизительно 1 г белка из 1 кг сырого материала (например, корешков). При использовании прорастающих семян с максимальным синтезом белка выход можно сделать максимальным, что было показано, например, при осолаживании в течение шести дней. Если используются быстро разрастающиеся растительные клетки в S-фазе, то синтез натурального белка хроматина является максимальным и его содержание может составлять до 80% от общего количества синтезируемого белка.
Действие белкового компонента, выделенного в соответствии с изобретением в качестве антимикробного средства из растительного хроматина, может быть синергически усилено при совместном использовании с одним или более антимикробных средств. Примером подобных синергических средств являются лизоцим, протамин, хелатообразующие агенты, соединения меди (II) и бактериоцины.
Белковый компонент растительного хроматина подходит для приготовления фармацевтической композиции для лечения микробных инфекций. Изобретение также относится к способам лечения микробных инфекций у млекопитающих, в том числе у людей, при этом вводят терапевтически эффективное количество белкового компонента.
Белковый компонент может использоваться для орального применения для лечения заболеваний зубов и десен, для местного применения для наружного использования при лечении дерматологических заболеваний, заболеваний кожи и заболеваний волос и для лечения ото-офтальмологических заболеваний. Белковый компонент растительного хроматина может также использоваться при лечении полостей тела, таких как рот, горло, легкие, влагалище и прямая кишка, а также использоваться орально при лечении желудочно-кишечных заболеваний после попадания патогенных микроорганизмов.
В том случае, если белковый компонент предполагается использовать в качестве антимикробного средства, его можно готовить в буферной водной среде, содержащей разнообразные соли и буферные добавки. Солями предпочтительно являются галогениды щелочных и щелочно-земельных металлов, в частности хлорид натрия, хлорид калия и сульфат натрия. Могут быть использованы различные буферы, такие как цитратный, фосфатный, HEPES, Tris и т.п., в количестве, в котором указанные буферы физиологически приемлемы для предназначенного способа применения.
В том случае, когда белковый компонент готовят в виде лиофилизованного порошка, предназначенного для последующего применения в растворе, то могут быть использованы различные наполнители или другие добавки. Добавки могут включать различные полиолы, инертные порошки или другие наполнители.
Применение по настоящему изобретению включает также композиции, которые содержат очищенный белковый компонент в количестве, эффективном для уничтожения бактерий или грибков, и подходящий носитель. Подобные композиции вместе с хорошо известными из области техники носителями могут находить многочисленное применение для борьбы с бактериями и грибками, например, в виде бытовых или лабораторных препаратов.
Различные композиции обладают различной степенью активности по отношению к различным организмам. Эффективные количества, которые предполагается использовать для уничтожения вредных микроорганизмов, таких как бактерии и грибки, и других вредных агентов, могут быть легко определены специалистами.
Белковый компонент по настоящему изобретению может быть также объединен с другими белками, действующими как консерванты для защиты белкового компонента от протеолитической деградации. В качестве альтернативы белковый компонент или композиции по настоящему изобретению могут использоваться в качестве консервантов или дезинфицирующих средств в виде многочисленных составов, таких как растворы для контактных линз, мази, шампуни, лекарственные средства, пищевые продукты и т.п. Количество белкового компонента может варьировать в зависимости от типа других компонентов, требуемой степени антимикробной защиты и предполагаемого использования композиции.
Белковый компонент может, например, использоваться вместе с подходящим носителем в композиции для дезинфекции и холодной стерилизации поверхностей и в качестве вспомогательного средства в процессе пастеризации пищи под высоким давлением, а также в составе композиции в качестве консерванта для воды, в частности, в рыбоводстве. Белковый компонент может также использоваться в количестве, эффективном для уничтожения бактерий, в составе упаковочного материала, из которого белковый компонент может медленно высвобождаться.
ПРИМЕРЫ
Изобретение далее поясняется и иллюстрируется ссылками на следующие примеры. Необходимо, однако, отметить, что эти примеры не следует рассматривать как тем или иным образом ограничивающие настоящее изобретение.
Пример 1. Антимикробный анализ
Лунки микротитровального планшета заполняют 300 мкл среды для выращивания (питательный бульон+1% глюкозы) с двойной концентрацией. По два образца добавляют до конечной концентрации белкового компонента соответственно 2, 0,5 и 0,2 мг/мл.
Используют два тестируемых организма: Pseudomonas fluorescens (грамотрицательная аэробная бактерия) и Listeria innocua (грамположительная аэробная бактерия).
Культуры бактериальных штаммов после выдерживания в течение ночи разбавляют пептонной водой и по 50 мкл каждого штамма добавляют в лунки в количестве 104 клеток/мл. Для сравнения используют лунки (положительные контрольные лунки), в которых нет тестируемого материала.
Планшеты инкубируют при 30°С в течение 72 ч в аппарате Bioscreen® для проведения анализа и через каждые 15 мин определяют рост бактерий по увеличению поглощения в видимой области спектра.
Пример 2. Экстракция и фракционирование
При проведении экстракции и фракционирования растительных белков и полипептидов различие в структуре, физиологии и биохимии растительных тканей часто не позволяют применять современные или обычные животные буферы и/или методы мацерации. Более сложный макромолекулярный состав и взаимодействия внутри растительных тканей (в частности, наличие фенольных, углеводных и углеводородных соединений), а также более компактные клеточные стенки в процессе приготовления растительных экстрактов требуют использования более точных методов мацерации и выделения с целью обеспечения целостности полипептидов.
Листья ячменя (1 кг, сырой вес) подвергают экстракции и фракционированию по методике, приведенной в Langenbuch et al., Plant Molecular Biology 2, 207-220 (1983). Ядерный хроматин ячменя получают с помощью 0,4 N раствора серной кислоты, при этом типичный выход составляет 10-20 мг.
Затем проводят специальную операцию субфракционирования, которая позволяет проводить в больших масштабах препаративное выделение белкового компонента. Специфический белковый компонент (молекулярная масса 17300) получают методом дифференциальной растворимости в смеси этанол (80%): HCl (0,25 N).
Белковые компоненты исследуют на антимикробную активность по отношению к обычно встречающимся штаммам Listeria и Pseudomonas.
Полное угнетение роста обоих организмов достигается с использованием фракции, растворимой в этаноле и воде. Эффект зависит от концентрации, т.е. должно быть превышено определенное пороговое значение (никакого эффекта не обнаружено при разбавлении 1:1).
Антимикробная активность ограничивается исключительно специфическим белковым компонентом с молекулярной массой 17300. Никакой активности не обнаружено для белковых компонентов, имеющих бульшие размеры.
Пример 3. Альтернативная экстракция и фракционирование
Двухнедельные саженцы гороха, пшеницы, ржи и хлопка подвергают субфракционированию по методике, приведенной Сидоровой и Конаевым в журнале Биохимия 46, 1298 (1981).
Получают специфический белковый компонент с молекулярной массой 17300, а также белковый компонент большего размера.
Белковые компоненты исследуют на антимикробную активность, при этом результаты идентичны тем, которые получены в Примере 1.
Пример 4. Улучшенная процедура фракционирования
Зеленый солод получают из местной пивоварни. Солод в течение 6 дней проращивают в обычном процессе осолаживания.
Зеленый солод (100 г) суспендируют в 4 М растворе NaCl и гомогенизуют в течение приблизительно 10 мин в миксере фирмы Braun. Гомогенат фильтруют через сито 20 мкм и полученный раствор затем добавляют к 20 г гидрофобной матрицы (Novarose® S-Butyl 1000/40, Inovata AB, Швеция), которую приводят в равновесное состояние с помощью 4 М раствора NaCl. Смесь перемешивают в течение 10 мин и матрицу отфильтровывают через сито 40 мкм.
Далее матрицу помещают в колонку (25×50 мм) и перед элюированием промывают 4 М раствором NaCl. При такой высокой ионной силе раствора ДНК не связывается с матрицей, что устанавливают по увеличивающемуся поглощению элюата при 254 нм, и, таким образом, ДНК элюируется в процессе заполнения и промывки колонки.
Отдельные пики белков регистрируют с помощью УФ-поглощения при 276 нм после ступенчатого элюирования соответственно 2 М раствором NaCl, 1 М раствором NaCl и водой. Это соответствует десорбции не содержащего хроматина материала 2 М раствором NaCl.
Пример 5. Процедура субфракционирования
Фракции, которые десорбируются в 1 М растворе NaCl в Примере 4, подвергают субфракционированию с помощью препаративной гель-хроматографии в 0,1 М растворе ацетата аммония на колонке (25×500 мм) с Novarose® SE-100/40 (Inovata AB, Швеция).
Получают и лиофилизуют три фракции белка. Средняя фракция имеет объем удержания, который соответствует молекулярной массе в интервале от 10 до 20 кДа.
Таким образом, растительный хроматин представляет собой удобный источник для выделения, в данном диапазоне молекулярной массы, гипоацетилированных основных гидрофобных белков, несущих большой электроположительный заряд.
После проведения аналитической гель-хроматографии в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,0 на колонке (8×300 мм) с Novarose® SE-100/17 (Inovata AB, Швеция) было установлено, что этой фракции соответствует среднемолекулярная масса приблизительно 14 кДа.
Пример 6. Альтернативная процедура фракционирования
Сравнительный эксперимент проводят в тех же условиях, которые приведены в Примере 4, однако в качестве гидрофобной матрицы используют Novarose® S-Phenyl (Inovata AB, Швеция). При элюировании 1 М раствором NaCl десорбция белка не обнаруживается и лишь одна фракция получена при элюировании водой. Десорбции белкового материала из гидрофобной матрицы не происходит и при использовании 22%-ного раствора этанола в воде, что свидетельствует о том, что связывание между матрицей и белковым материалом является весьма гидрофобным.
Пример 7. Установление антимикробной активности
Среднюю фракцию, полученную в соответствии с Примером 5, подвергают дальнейшему исследованию на предмет ее антимикробной активности. Образцы получают, растворяя лиофилизованную фракцию в фосфатном буфере (рН 7,0) до концентрации 4 мг/мл. Полученные растворы затем разбавляют от 4 до 10 раз фосфатным буфером.
Полученные результаты не отличимы от тех, что описаны в Примере 5 для специфического белкового компонента с молекулярной массой 17300, выделенного по методике, приведенной в Примерах 4 и 5.
Следует отметить, что другая фракция, полученная после проведения гель-хроматографии, вообще не проявляет какой-либо антимикробной активности.
Пример 8. Влияние с-значения
Белковые компоненты со сходной антимикробной активностью получают по тем же методикам, что приведены в Примерах 4 и 5 из хроматинов 72-часовых саженцев Arabidopsis и пшеницы. Средние выходы фракций с массой в интервале 10-20 кДа, полученные из этих образцов, заметно различаются друг от друга, при этом пшеница является более подходящим источником для проведения экстракции. По сравнению с ячменем требуемая фракция присутствует приблизительно вдвое большем количестве.
Пример 9. Аналитический электрофорез
Аналитический электрофорез, который проводят по стандартной методике (Panyim & Chalkley, Biochem. 8: 3972, 196), показывает многочисленные вариации специфического белкового компонента с молекулярной массой 17300 и отсутствие каких-либо субфракций белковых компонентов с большей молекулярной массой в интервале от 28000 до 35000.
Эти результаты также отражают различие в размере генома между видами растений. Arabidopsis имеет маленький диплоидный геном с размером 200 мегапар оснований и, соответственно, меньшие выходы по сравнению с пшеницей, которая имеет большой гексаплодный геном с размером 17000 мегапар оснований.
Таким образом, выход экстракции тесно связан с размером генома, выраженного его с-значением.
Сравнительный пример 1. Сравнение с гистонами животных
Поскольку аналитическая хроматография в буферной разделительной среде, как указано в Примере 5, приводит к молекулярной массе приблизительно 14 кДа, что соответствует молекулярной массе гистонов H2A и H2B теленка, то сравнение проводят между белковым компонентом по настоящему изобретению и животными гистонами.
Параллельные контрольные эксперименты с доступными на рынке гистонами H2A и H2B теленка (Sigma, США) и средней фракцией по Примеру 4, имеющей молекулярную массу в интервале от 10 до 20 кДа, проводят с помощью аналитической гель-хроматографии в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,0 на колонке (8×300 мм) с Novarose® SE-100/17 (Inovata AB, Швеция).
Все полученные фракции анализируют на антибактериальную активность, при этом положительные результаты повторены для белкового компонента, выделенного из растительного хроматина.
Другой сравнительный эксперимент не подтверждает какую-либо антимикробную активность первой фракции, близкой к свободному объему колонки, т.е. там, где ожидается растительный гистон H1. Более того, вновь устанавливают, что картина разложения нуклеосом в солевом растворе различается у животных и растений и что стандартная методика, используемая для животных, не может быть применена для растений.
Сравнительный пример 2. Экстракция водным растворителем
Известно лишь несколько методов, позволяющих провести экстракцию всех полипептидов из растительных тканей. Используемые методы благоприятствуют получению фракций различных тканей, которые обогащены субклеточными компонентами. Напротив, для животных систем описан ряд более или менее «универсальных» препаративных методов.
Подобные методы были изучены в патенте США 5698200, выданном на имя Karen Barret, при этом было исследовано несколько простых водных экстрактов из осоложенного зерна хлебных злаков.
Те же последующие методы, что и описанные в примере 1 и 2 патента США 5698200, были использованы для листьев ячменя (см. пример 2) в качестве исходного материала.
В интервале 10-20 кДа были идентифицированы лишь запасные белки. Эти белки не проявляют никакой антимикробной активности.
Сделан вывод, что хроматин не может быть выделен ни по одному из методов, приведенных в патенте США 5698200, если исходным материалом является вещество цитозолей. Наиболее вероятно, были получены тионины, которые являются хорошо известными дефензинами, представляющими собой цитотоксические серосодержашие полипептиды с низкой молекулярной массой, а именно 2-3 кДа.
Изобретение относится к применению белкового компонента, выделенного из растительного хроматина, в качестве антимикробного агента. Белковый компонент получают по методу, включающему стадии гомогенизации растительного материала, с целью выделения из него хроматина, разложения выделенного хроматина с помощью агента разложения в гидрофобных условиях и разделения разложенного растительного хроматина на индивидуальные фракции путем гидрофобного взаимодействия. Получаемый из одной из фракций белковый компонент, который имеет кажущуюся молекулярную массу в интервале от 10 до 20 кДа, обладает выраженной антимикробной активностью. 4 н. и 28 з.п. ф-лы.
гомогенизация растительного материала, с целью выделения из него растительного хроматина;
разложение указанного растительного хроматина с помощью агента разложения в гидрофобных условиях; и
разделение указанного разложенного растительного хроматина на индивидуальные фракции, одна из которых содержит указанный растительный белковый компонент, методом разделения путем гидрофобного взаимодействия.
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
| Способ получения суммарного гистонаиз жиВОТНОгО СыРья | 1979 |
|
SU843915A1 |
| СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРЕПАРАТА ГИСТОНА Н4 ИЗ ТКАНИ ТИМУСА | 1985 |
|
SU1319352A1 |
| US 5698200 A, 16.12.1997 | |||
| US 6086885 A, 11.07.2000 | |||
| Прибор, замыкающий сигнальную цепь при повышении температуры | 1918 |
|
SU99A1 |
| СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ТРУБ | 0 |
|
SU297598A1 |
