СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО НЕФРОТОКСИЧЕСКОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2010 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии, патологической физиологии и экспериментальной медицине. Может быть использовано для изучения патогенеза хронического гломерулонефрита и доклинического исследования эффективности новых лекарственных препаратов при данной патологии.

На сегодняшний день известно несколько моделей хронического нефротоксического гломерулонефрита у экспериментальных животных, воспроизводимого путем введения экспериментальному животному нефротоксической сыворотки.

Наиболее близким аналогом является способ воспроизведения модели нефротоксического нефрита у белых беспородных крыс путем введения экспериментальному животному нефротоксической сыворотки, полученной от иммунизированных суспензией почечного антигена беспородной белой крысы кроликов (М.В.Дикал, Ю.Е.Роговый. Роль препарата GA-40 в коррекции тубулоинтерстициального синдрома при хроническом нефрите Масуги // Научно-практический медицинский журнал «Клиническая анатомия и оперативная хирургия», 2006, Т 5, №3, с 10-14).

Недостатками известного способа являются сложность проводимого эксперимента и дороговизна исследования. Для приготовления нефротоксической сыворотки используются кролики, работа с которыми является трудоемкой и дорогостоящей. Кроме того, в воспроизведенной модели отсутствует описание морфологических изменений, характерных для хронического нефротоксического нефрита. Авторы описывают изменения лишь в канальцах и интерстициальной ткани почек, не описывают патологические изменения в клубочках. Не отмечена М.В.Дикалом и Ю.Е.Роговым процентная воспроизводимость эксперимента.

Технический результат: упрощение способа моделирования хронического нефротоксического нефрита, удешевление методики, создание воспроизводимой модели.

Указанные задачи достигаются путем иммунизации белых беспородных крыс нефротоксической сывороткой, получаемой в результате предшествующей иммунизации морской свинки суспензией почечного антигена беспородной белой крысы, по схеме: двухкратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 24 часа, из расчета 100 мкл нефротоксической сыворотки на 100 г массы животного.

Способ осуществляют следующим образом.

Эксперимент выполнен на (14) животных - самцах и самках беспородных белых крыс четырехмесячного возраста, содержащихся в стандартных условиях вивария. Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.

Животные были разделены на экспериментальные группы:

I группа - контрольная (интактные животные), n=7;

II группа - моделирование хронического нефротоксического нефрита, n=7.

Для получения нефротоксической сыворотки берут самку белой беспородной крысы, массой 230 г. Животное содержат в стандартных условиях вивария: стандартное содержание в пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой, стандартный рацион вивария. Сразу после декапитации животного, проведенной под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии, почки перфузируют in situ стерильной охлажденной средой 199 до получения равномерного серо-коричневого цвета. После этого их отсекают от почечной ножки и переносят на стерильный лоток. Все последующие манипуляции выполняются при температуре +4°С. Отделив от капсулы, почку разрезают сагиттально, выделяют корковый слой (масса коркового слоя - 369 мг). Корковый слой суспендируют в стерильной ступке, дополнительно измельчают в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН - 2Т, в режиме 44 мГц, в течение 10 минут, затем переносят суспензию в центрифужный стаканчик, добавляя охлажденный физиологический раствор до 10 мл и мертиолят 1 мг в качестве антисептика. Полученную суспензию центрифугируют на холоде трехкратно по 3 минуты 2000 оборотов в минуту, каждый раз удаляя супернатант и доводя суспензию до 10 мл охлажденным физиологическим раствором. После этого суспензию центрифугируют при 5000 оборотов в минуту в течение 10 минут. Осадок переносят на стерильную фольгу и взвешивают на торсионных весах. Масса суспензионного осадка составила 370 мг.

Для приготовления антигена берут 200 мг осадка из расчета 1,0 мл полного адъюванта Фрейнда на 20 мг осадка. Полученную взвешенную антигенную суспензию коркового слоя почки крысы хранят при температуре 0°С+4°С.

Проводят иммунизацию морских свинок (n=3), из расчета 100 мкл полученной антигенной суспензии на 100 г массы тела животного, по следующей схеме: трехкратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией 24 часа.

Спустя 30 дней от начала иммунизации морских свинок выводят из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Сыворотку забирают из полостей сердца сразу после биологической смерти животного, центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 10 минут до получения прозрачной жидкости. Полученную нефротоксическую сыворотку хранят в течение последующих 2-х дней при температуре +4°С.

Иммунизацию белых беспородных крыс проводят по следующей схеме: двухкратно внутрибрюшинно с интервалом в 24 часа, из расчета 100 мкл нефротоксической сыворотки на 100 г массы тела животного.

Перед началом эксперимента у животных контрольной (интактной) и опытной группы проводят анализ разовой порции мочи на белок, используя качественную реакцию с 20% сульфосалициловой кислотой. Через 1 час после иммунизации и затем последующего эксперимента в динамике проводят контрольное исследование мочи на белок.

Через 14 дней от начала иммунизации животных выводят из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забирают для проведения гистологического исследования. Препараты приготовлены по общепринятым методикам, окрашивают гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, нитратом серебра по Футу.

Результаты экспериментов подвергнуты статистической обработке с применением компьютерных программ Microsoft Excel и Biostat.

У животных контрольной группы не было выявлено лабораторных и гистологических признаков развития нефрита. В течение всего эксперимента в моче животных этой группы белок не выявлялся.

При проведении гистологического исследования в почках четко выявлялась капсула почки, корковое вещество с почечными тельцами и извитыми канальцами, мозговое вещество почки. Прямые канальцы в мозговом веществе и собирательные трубочки были без особенностей. Визуализировались сосочки и почечная лоханка, выстланная переходным эпителием. Капсула Боумена не утолщена, сосудистые клубочки нефрона не были изменены. Проксимальные и дистальные почечные канальцы находились между почечными тельцами, их структура была типичной.

При проведении иммунизации нефротоксической сывороткой у животных наблюдали выраженную протеинурию в первые сутки после иммунизации.

При проведении гистологического исследования аутопсийного материала, полученного от иммунизированных животных (крыса, иммунизированная нефротоксической сывороткой, полученной от морской свинки), в ткани почек выявлялось выраженное полнокровие сосудов коркового и мозгового слоев. В клубочках отмечалась пролиферация мезангиальных клеток. Клубочки увеличены в размерах, в ряде случаев имелись спайки капиллярных петель с капсулой Боумена, что значительно ограничивало объем мочевого пространства. У части клубочков отмечалось утолщение капсулы клубочка и стенок отдельных капилляров, выявляемое при окрашивании препаратов нитратом серебра по Футу. Капиллярные петли полнокровны, отдельные капилляры содержали тромбы.

В проксимальных и дистальных канальцах резко выражена гидропическая дистрофия, а также атрофия эпителия.

Таким образом, в гистологических препаратах почек иммунизированных животных наблюдалась морфологическая картина, соответствующая патоморфологическим изменениям, характерным для мезангиально-капиллярного гломерулонефрита человека.

Воспроизводимость эксперимента составила 100%, у всех иммунизированных животных отмечалась гистологическая картина хронического нефротоксического гломерулонефрита.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Самке беспородной белой крысы (№4), массой 205,0 г внутрибрюшинно вводили нефротоксическую сыворотку, полученную от морской свинки, иммунизированной суспензией почечного антигена беспородной белой крысы, по схеме: двухкратно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 24 часа, из расчета 100 мкл нефротоксической сыворотки на 100 г массы животного.

Перед началом эксперимента у экспериментального животного проводили анализ разовой порции мочи на белок, используя качественную реакцию с 20% сульфосалициловой кислотой. Через 1 час после иммунизации и затем последующего эксперимента в динамике проводили контрольное исследование мочи на белок.

По окончании опыта животное вывели из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забрали для проведения гистологического исследования.

При исследовании в проходящем свете образцов почечной ткани выявлено выраженное полнокровие сосудов коркового и мозгового слоев. Практически все клубочки увеличены в размерах, во всех отмечалась мезангиальная пролиферация. Объем мочевого пространства был значительно уменьшен. В нескольких клубочках имелись спайки капиллярных петель с капсулой Боумена. Во всех клубочках отмечалось утолщение капсулы и стенок отдельных капилляров, выявляемое при окрашивании препаратов нитратом серебра по Футу, полнокровие капиллярных петель.

В проксимальных и дистальных канальцах отмечалась резко выраженная гидропическая дистрофия и атрофия эпителия.

Пример 2. Самцу беспородной белой крысы (№2), массой 220,0 г внутрибрюшинно вводили нефротоксическую сыворотку, полученную путем иммунизации морской свинки суспензией почечного антигена беспородной белой крысы, по схеме: двухкратно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией 24 часа, из расчета 100 мкл нефротоксической сыворотки на 100 г массы животного.

Перед началом эксперимента у экспериментального животного проводили анализ разовой порции мочи на белок, используя качественную реакцию с 20% сульфосалициловой кислотой. Через 1 час после иммунизации и затем через 1 день проводили контрольное исследование мочи на белок.

По окончании опыта животное вывели из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забрали для проведения гистологического исследования.

При исследовании в проходящем свете образцов почечной ткани выявлялось ярко выраженное полнокровие сосудов коркового и мозгового слоев. Большинство клубочков увеличены в размерах с выраженной мезангиальной пролиферацией. Объем мочевого пространства в клубочках значительно уменьшен в результате пролиферативных изменений и спаек капиллярных петель с капсулой Боумена. Стенки капилляров были утолщены, что выявлялось при окрашивании препаратов нитратом серебра по Футу. Сами капиллярные петли полнокровны. Отмечались выраженные дистрофические и атрофические изменения эпителия в канальцах.

Пример 3. Самцу беспородной белой крысы (№7), массой 230,0 г внутрибрюшинно вводили нефротоксическую сыворотку, полученную путем иммунизации морской свинки суспензией почечного антигена беспородной белой крысы, по схеме: двухкратно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией 24 часа, из расчета 100 мкл нефротоксической сыворотки на 100 г массы животного.

Перед началом эксперимента у экспериментального животного проводили анализ разовой порции мочи на белок, используя качественную реакцию с 20% сульфосалициловой кислотой. Анализ разовой порции мочи на белок, используя качественную реакцию с 20% сульфосалициловой кислотой, проводили перед началом эксперимента последующего эксперимента в динамике.

По окончании опыта животное вывели из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забрали для проведения гистологического исследования.

При исследовании в проходящем свете образцов почечной ткани клубочки увеличены в размерах, вследствие выраженной пролиферация мезангиальных клеток. Объем мочевого пространства был значительно уменьшен. В нескольких клубочках имелись спайки капиллярных петель с капсулой Боумена. Во всех клубочках отмечалось утолщение капсулы и стенок отдельных капилляров, выявляемое при окрашивании препаратов нитратом серебра по Футу, полнокровие и тромбоз капиллярных петель.

В проксимальных и дистальных канальцах отмечалась резко выраженная гидропическая дистрофия и атрофия эпителия.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования хронического нефротоксического гломерулонефрита в эксперименте. Для этого от беспородной белой крысы получают суспензию почечного антигена. Затем проводят иммунизацию морской свинки полученной суспензией почечного антигена с полным адъювантом Фрейнда. Получают нефротоксическую сыворотку. После чего нефротоксическую сыворотку внутрибрюшинно вводят беспородной белой крысе. При этом введение осуществляют по схеме: двухкратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 24 часа из расчета 100 мкл нефротоксической сыворотки на 100 г массы животного. Заявленный способ позволяет упростить моделирование хронического нефротоксического нефрита, удешевить методику, создать воспроизводимую модель хронического нефротоксического нефрита.

Способ моделирования хронического нефротоксического гломерулонефрита в эксперименте путем внутрибрюшинного введения нефротоксической сыворотки лабораторному животному, отличающийся тем, что нефротоксическую сыворотку получают путем иммунизации морской свинки суспензией почечного антигена, полученного от беспородной белой крысы, с полным адъювантом Фрейнда, и вводят беспородной белой крысе по схеме: 2-кратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 24 ч, из расчета 100 мкл нефротоксической сыворотки на 100 г массы животного.