СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2010 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии, патологической физиологии и экспериментальной медицине. Может быть использовано для изучения патогенеза хронического гломерулонефрита и доклинического исследования эффективности новых лекарственных препаратов при данной патологии.

На сегодняшний день известно несколько моделей хронического гломерулонефрита у экспериментальных животных, воспроизводимого путем введения экспериментальному животному нефротоксической сыворотки.

Наиболее близким аналогом является способ воспроизведения модели хронического гломерулонефрита у белых нелинейных крыс-самцов путем двукратного внутрибрюшинного введения экспериментальному животному кроличьей нефротоксической сыворотки с титром противопочечных антител в реакции связывания комплемента не ниже 1:1024 (Ю.Е.Роговый, Л.Г.Архипова, М.В.Дикал, Л.О.Филипова, Е.Н.Миль, Роль CD64, белков Р53, Р21 в патогенезе тубулоинтерстициального синдрома при хроническом нефрите Мазуги // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007, Т 144, № 10, с 391-394).

Недостатками известного способа является сложность, длительность проводимого эксперимента и дороговизна исследования. Для приготовления нефротоксической сыворотки используются кролики, работа с которыми является трудоемкой и дорогостоящей. Кроме того, в воспроизведенной модели отсутствует подробное описание морфологических изменений, характерных для хронического нефротоксического нефрита. Авторами не указана процентная воспроизводимость данного эксперимента.

Технический результат: упрощение способа моделирования хронического гломерулонефрита, сокращение длительности эксперимента, создание абсолютно воспроизводимой модели, удешевление методики.

Указанные задачи достигаются путем иммунизации белых беспородных крыс нефротоксической сывороткой, получаемой в результате предшествующей иммунизации родителей суспензией почечного антигена беспородной белой крысы, по схеме: 2-кратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 24 часа, из расчета 0,8 мл нефротоксической сыворотки на 100 грамм массы животного.

Способ осуществляют следующим образом.

Эксперимент выполнен на 21 животном - самцах и самках беспородных белых крыс четырехмесячного возраста, содержащихся в стандартных условиях вивария. Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.

Животные были разделены на экспериментальные группы:

I группа - контрольная (интактные животные), n=7;

II группа - животные одного помета, иммунизированные суспензией почечного антигена, полученного из материнской почки, n=7;

III группа - потомство животных II группы, иммунизированное нефротоксической сывороткой, полученной от родителей (II группы), n=7.

Для получения нефротоксической сыворотки берут самку белой беспородной крысы массой 250 г. Животное содержат в стандартных условиях вивария: стандартное содержание в пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой, стандартный рацион вивария. Сразу после декапитации животного, проведенной под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии, почки перфузируют in situ стерильной охлажденной средой 199 до получения равномерного серо-коричневого цвета. После этого их отсекают от почечной ножки и переносят на стерильный лоток. Все последующие манипуляции выполняются при температуре +4°C. Отделив от капсулы, почку разрезают сагитально, выделяют корковый слой (масса коркового слоя 402 мг). Корковый слой суспендируют в стерильной ступке, дополнительно измельчают в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т, в режиме 44 мГц, в течение 10 минут, затем переносят суспензию в центрифужный стаканчик, добавляя охлажденный физиологический раствор до 10 мл и мертиолят 1 мг в качестве антисептика. Полученную суспензию центрифугируют на холоде 3-кратно по 3 минуты 2000 оборотов в минуту, каждый раз удаляя супернатант и доводя суспензию до 10 мл охлажденным физиологическим раствором. После этого суспензию центрифугируют при 5000 оборотов в минуту в течение 10 минут. Осадок переносят на стерильную фольгу и взвешивают на торсионных весах. Масса суспензионного осадка составила 370 мг.

Для приготовления антигена берут 200 мг осадка из расчета 1,0 мл полного адъюванта Фрейнда на 20 мг осадка. Полученную взвешенную антигенную суспензию коркового слоя почки крысы хранят при температуре 0°C +4°C.

Проводят иммунизацию потомства (I поколение) из расчета 100 мкл полученной антигенной суспензии на 100 грамм массы тела животного, по следующей схеме: 3-кратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией 48 часов. Повторная иммунизация проводилась однократно, после 3-х недель от момента первого введения антигенной суспензии.

Спустя 30 дней от начала иммунизации животных I поколения выводят из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Сыворотку забирают из полостей сердца сразу после биологической смерти животного, центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 10 минут до получения прозрачной жидкости. Полученную нефротоксическую сыворотку хранят в течение последующих 2-х дней при температуре +4°C.

Иммунизацию животных II поколения проводят по следующей схеме: 2-кратно внутрибрюшинно с интервалом в 24 часа, из расчета 0,8 мл нефротоксической сыворотки на 100 грамм массы тела животного.

Через 14 дней от начала иммунизации животных выводят из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забирают для проведения гистологического исследования.

Материал фиксируют в нейтральном забуференном формалине, подвергают обезвоживанию в спиртах возрастающей крепости, заливают в парафин. Срезы получают на ротационном микротоме, окрашивают гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, нитратом серебра по Футу. Исследуют микропрепараты в проходящем свете светового микроскопа, объектив 40.

Результаты экспериментов подвергнуты статистической обработке с применением компьютерных программ Microsoft Excel и Biostat.

У животных контрольной группы не было выявлено гистологических признаков развития нефрита. При проведении гистологического исследования в почках четко выявлялась капсула почки, корковое вещество с почечными тельцами и извитыми канальцами, мозговое вещество почки. Прямые канальцы в мозговом веществе и собирательные трубочки без особенностей. Визуализировались сосочки и почечная лоханка, выстланная переходным эпителием. Капсула Боумена не утолщена, сосудистые клубочки нефрона не изменены. Проксимальные и дистальные почечные канальцы находились между почечными тельцами, их структура типична.

При проведении гистологического исследования аутопсийного материала, полученного от иммунизированных нефротоксической сывороткой животных II поколения, в ряде клубочков имелось нарушение типичной структуры вследствие появления спаек капиллярных петель между собой, что обуславливало лопастную форму клубочков. Капсула клубочков была утолщена, выявлялись спайки между капиллярными петлями и капсулой. Клубочки многоклеточные, что свидетельствует о наличии мезангиальной пролиферации. Мочевое пространство резко сужено. В капиллярных петлях клубочков выражено полнокровие, стазы, тромбозы.

В проксимальных и дистальных канальцах отмечалась зернистая, гидропическая дистрофия эпителиоцитов. Помимо дистрофических наблюдались некротические изменения в эпителии канальцев. Клетки канальцев выглядели набухшими, в ряде случаев перекрывали просвет канальцев. Ядра визуализировались нечетко, что свидетельствует о дегенеративных процессах в эпителии канальцев. В просветах проксимальных канальцев выявлялись белковые цилиндры.

В интерстициальной ткани почек определялась слабовыраженная воспалительная инфильтрация. Сосуды интерстиция были полнокровны.

Таким образом, в гистологических препаратах почек иммунизированных животных II поколения наблюдалась морфологическая картина, соответствующая поражению ткани почек, в основе которого лежат тяжелые иммунные нарушения. Подобные изменения в клинике часто сопровождают системные заболевания с поражением почек, аутоиммунное поражение трансплантируемых почек.

Воспроизводимость эксперимента составила 100%, у всех иммунизированных животных отмечалась гистологическая картина хронического гломерулонефрита гломерулонефрита.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Самцу беспородной белой крысы (№ 2) массой 220,0 г вводили нефротоксическую сыворотку по схеме: 2-кратно внутрибрюшинно с интервалом в 24 часа, из расчета 0,8 мл нефротоксической сыворотки на 100 грамм массы тела животного.

Через 14 дней от начала иммунизации животное выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забрали для проведения гистологического исследования.

При исследовании в проходящем свете образцов почечной ткани выявлено выраженное полнокровие сосудов коркового и мозгового слоев. Клубочки многоклеточные вследствие выраженной мезангиальной пролиферации. Объем мочевого пространства значительно уменьшен. Определялись спайки капиллярных петель с капсулой Боумена и между собой, что обуславливало лапчатую форму клубочков. В клубочках выявлялись полнокровие и тромбоз капиллярных петель.

В проксимальных и дистальных почечных канальцах отмечалась резко выраженная гидропическая и зернистая дистрофия эпителия, отдельные клетки безъядерные. В просветах канальцев белковые цилиндры.

В интерстициальной ткани почек умеренно выраженная лимфолейкоцитарная инфильтрация.

Пример 2. Самке беспородной белой крысы (№ 5) массой 190,0 г вводили нефротоксическую сыворотку по схеме: 2-кратно внутрибрюшинно с интервалом в 24 часа, из расчета 0,8 мл нефротоксической сыворотки на 100 грамм массы тела животного.

Через 14 дней от начала иммунизации животное выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забрали для проведения гистологического исследования.

В ткани почек в клубочках имелось нарушение типичной структуры вследствие появления спаек капиллярных петель между собой, что обуславливало лопастную форму клубочков. Капсула клубочков была утолщена, выявлялись спайки между капиллярными петлями и капсулой. Большинство клубочков многоклеточные вследствие мезангиальной пролиферации. Мочевое пространство резко сужено. В капиллярных петлях клубочков выражено полнокровие, стазы, тромбозы.

В проксимальных и дистальных канальцах отмечалась зернистая, гидропическая дистрофия эпителиоцитов. Помимо дистрофических наблюдались некротические изменения в эпителии канальцев. Клетки канальцев выглядели набухшими, в ряде случаев перекрывали просвет канальцев. Ядра визуализировались нечетко, что свидетельствует о дегенеративных процессах в эпителии канальцев. В просветах проксимальных канальцев выявлялись белковые цилиндры.

В интерстициальной ткани почек определялась слабовыраженная воспалительная инфильтрация. Сосуды интерстиция были полнокровны.

Пример 3. Самцу беспородной белой крысы (№ 7), массой 230,0 г вводили нефротоксическую сыворотку по схеме: 2-кратно внутрибрюшинно с интервалом в 24 часа, из расчета 0,8 мл нефротоксической сыворотки на 100 грамм массы тела животного.

Через 14 дней от начала иммунизации животное выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забрали для проведения гистологического исследования.

При проведении гистологического исследования в ткани почек дифференцируется корковое и мозговое вещество, сосуды почек полнокровны. Клубочки многоклеточные, с утолщенной капсулой, в них выявляются спайки между капиллярными петлями, что обуславливало лопастную форму клубочков и спайки капиллярных петель с капсулой. В капиллярных петлях клубочков обнаруживалось полнокровие и тромбоз.

В проксимальных и дистальных канальцах отмечалась зернистая и гидропическая дистрофия эпителиоцитов, некроз. Клетки канальцев в ряде случаев полностью перекрывали их просвет. Также в просвете проксимальных канальцев визуализировались белковые цилиндры.

В интерстициальной ткани почек выявлялись полнокровие сосудов и инфильтрация.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования хронического гломерулонефрита в эксперименте. Для этого получают нефротоксическую сыворотку в результате предшествующей иммунизации родителей белых беспородных крыс суспензией почечного антигена. Затем внутрибрюшинно вводят нефротоксическую сыворотку белой беспородной крысе. Введение осуществляют по схеме: 2-кратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 24 часа, из расчета 0,8 мл нефротоксической сыворотки на 100 грамм массы животного. Заявленный способ позволяет упростить моделирование хронического гломерулонефрита, сократить длительность эксперимента, удешевить методику.

Способ моделирования хронического гломерулонефрита в эксперименте путем внутрибрюшинного введения нефротоксической сыворотки лабораторному животному - белой беспородной крысе, отличающийся тем, что нефротоксическую сыворотку получают в результате предшествующей иммунизации родителей белых беспородных крыс суспензией почечного антигена белой беспородной крысы по схеме: 2-кратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 24 ч, из расчета 0,8 мл нефротоксической сыворотки на 100 г массы животного.