НЕПАТОГЕННЫЙ ШТАММ LEV82 ЭНТЕРОВИРУСА ЧЕЛОВЕКА А, СЕРОТИП КОКСАКИ А7, ДЛЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 A61P35/00 

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается нового непатогенный штамма LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, для неспецифической профилактики вирусных инфекций, в частности для экстренной неспецифической профилактики вирусных инфекций, и лечения онкологических заболеваний.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Онкологические заболевания и вирусные инфекции являются одними из самых распространенных заболеваний во всем мире.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения ежегодно в мире от злокачественных новообразований умирает более пяти миллионов людей.

Несмотря на ведущиеся во всем мире разработки вакцин, в частности ставшей уже широко распространенной вакцины против вируса гриппа, Всемирная Организация Здравоохранения ежегодно регистрирует высокую смертность от вирусных инфекций, в частности от гриппа.

Возникновение и быстрое распространение пандемии коронавируса привели к гибели миллионов людей и поставили под угрозу здоровье людей и экономику в глобальном масштабе. Заболевание, вызываемое вирусом, было названо Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) коронавирусной болезнью 2019 (COVID-19). Возбудителем COVID-19 является вирус SARS-CoV-2.

Вышеуказанное доказывает необходимость разработки новых эффективных и безопасных средств лечения онкологических заболеваний и вирусных инфекций, это является одной из основных задач современной мировой науки. В последние десятилетия имеет место бурное развитие исследований, направленных на разработку опухолево-специфичных терапевтических средств на основе различных вирусов. Разработка противовирусных терапевтических средств на основе различных вирусов ведется уже десятилетиями, в последние годы острой проблемой является получение терапевтических средств на основе различных вирусов против коронавирусной инфекции.

Энтеровирусы представляют собой род небольших вирусов с одноцепочечным РНК геномом положительной полярности, которые размножаются преимущественно в лимфоидных клетках Пейеровых бляшек. По антигенной структуре, на основании нейтрализации инфекционности антителами, выявляется около 70 серотипов энтеровирусов человека, хотя некоторые штаммы могут также кросс-нейтрализоваться антителами полученными к вирусам других серотипов. Энтеровирусы способны вызывать ряд заболеваний человека, которые характеризуются значительным полиморфизмом клинического течения. Однако энтеровирусы часто выделяются из стула здоровых людей, особенно детей в возрасте до 5 лет. Эти вирусные штаммы являются апатогенными и не вызывают каких-либо заболеваний. На основе вызываемых заболеваний энтеровирусы первоначально были разделены на четыре группы: полиовирусы, вирусы Коксаки A (CA), вирусы Коксаки B (CB) и эховирусы. Современная классификация основывается на способности энтеровирусов рекомбинировать друг с другом в пределах одного вида, и делит их на несколько видов (Энтеровирусы A, B, C, D), однако прежняя классификация по прежнему используется, с добавлением принадлежности штамма к тому или иному вида, например, EV-B Коксаки В5, EV-B Эхо 12, EV-C Коксаки А21, EV-A Коксаки А7 и EV-D Коксаки А10. Энтеровирусы склонны к быстрой эволюции, как за счет приобретения точечных мутаций, так и путем рекомбинации друг с другом. Поэтому в пределах каждого серотипа существует множество вариантов, характеризующих отдельные энтеровирусные штаммы. Эти штаммы могут значительно отличаться по патогенности. Хотя большинство штаммов, в пределах одного серотипа, является апатогенными, среди них обнаруживаются и патогенные варианты, которые, однако, обладают выраженными различиями на уровне нуклеотидных последовательностей, преимущественно за счет использования альтернативных синонимических кодонов.

Апатогенный фенотип энтеровирусных штаммов характеризуется высокой стабильностью, что позволило использовать ряд штаммов, выделенных от здоровых детей, в качестве профилактических и терапевтических средств.

Из RU 2496873 C1 известен штамм энтеровируса Коксаки В6, селективно инфицирующий и лизирующий опухолевые клетки человека in vitro, депонированный в ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" под регистрационным номером V-576. Штамм получен посредством проведения серии адаптационных пассажей родительского штамма вируса ЖЭВ-15 Коксаки В6 на высокочувствительной к данному вирусу культуре клеток НЕК293 и неопластической клеточной линии С33А. Согласно RU 2496873 C1 на основе указанного штамма может быть разработан вирусный онколитический препарат для лечения злокачественных новообразований человека.

Из RU 2565811 C1 известен штамм энтеровируса А71 субгенотипа C4, депонированный в Коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-670, используемый для диагностики, изучения эффективности и создания лечебно-профилактических и вакцинных препаратов. Указанный штамм обладает высокой репродуктивной активностью, эффективно реплицируется в клеточной культуре 293А с развитием выраженного цитопатического действия. Штамм предназначен для изучения эффективности и усовершенствования методов диагностики, создания лечебных и профилактических химиотерапевтических и вакцинных препаратов против энтеровирусной инфекции.

Из CN 103160475 A известен штамм энтеровируса А71 типа, относящийся с субгенотипу С4. Штамм депонирован в Китайской коллекции микроорганизмов (Chinese Culture Collection Management Committee General Microbiology Center (CGMCC)) под №5539. Наработка штамма идет на культуре диплоидных клеток Vero. На основе указанного штамма создан вакцинный препарат с добавлением адъюванта гидроокиси алюминия, который использован для профилактики энтеровирусной инфекции.

Из CN 107739731 A известен штамм вируса Коксаки А10 TA151R-1 с высоким титром и стабильностью к пассажам. Указанный штамм может инфицировать различные клетки, включая клетки RD, клетки HEK 293, Verocells, клетки MRC-5, клетки Hep-2, клетки WI-38 и т.п., а также может быть использован для приготовления моновалентной вакцины или поливалентной вакцины для защиты от поражения вирусом Коксаки, а также полностью предотвратить атаки других гетерологичных вирусов.

Из CN 107746832 B известен штамм вируса Коксаки А10 с высоким титром, который депонирован в Центре общей микробиологии Китайского комитета по управлению коллекциями микробных культур под номером сохранения CGMCC №13394 и классифицируется как вирус Коксаки (штамм вируса Коксаки А10, вирус штамм № ТА151Р-1). Указанный штамм получен путем пассажей вируса TA151R в монослойные клетки RD (ATCC, CCL-136) и пригоден для профилактики или лечения заболевания, вызванного вирусом Коксаки.

Из CN 102533671 A известен штамм вируса Коксаки А16 с депозитным номером CGMCC №5372 для применения при приготовлении лекарственных средств или вакцин и диагностических реагентов для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, вызванных вирусом Коксаки.

В документе ЖЕЛТУХИН А.О. и др. «Энтеровирусы человека проявляют избирательную онколитическую активность на модели ксенотрансплантатов мультиформной глиобластомы человека в иммунодефицитных мышах», ВЕСТНИК РГМУ 2018, т. 2, с. 45-51, DOI: 10.24075/vrgmu.2018.026, раскрыто определение чувствительности к непатогенным энтеровирусам клеток мультиформной глиобластомы человека, поддерживаемых in vitro и в модели мышиных ксенотрансплантатов. Культуры опухолевых клеток глиобластом испытывали на чувствительность к вирусу Коксаки A7 (штамм ЖЭВ8), Коксаки A9 (штамм ЖЭВ9) и Коксаки B5 (Штамм ЖЭВ12). Полученные результаты показали, что ряд штаммов непатогенных энтеровирусов представляется перспективным при разработке терапевтических средств для безрецидивного лечения глиобластом.

В документе Сидоренко А.С. и др. «ПЕРСИСТИРОВАНИЕ ОНКОЛИТИЧЕСКОГО ЭНТЕРОВИРУСА КОКСАКИ А7 В ПОДКОЖНЫХ МЫШИНЫХ КСЕНОТРАНСПЛАНТАТАХ ГЛИОБЛАСТОМ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ», ВЕСТНИК РГМУ 3, 2018, с. 42-48, раскрыта доставка в клетки опухоли штамма ЖЭВ8 энтеровируса Коксаки А7 с помощью лейкоцитов периферической крови человека, инфицированных in vitro. Однократное введение 2×10⁴ зараженных вирусом лейкоцитов приводило к постепенной регрессии опухолей при постоянно определяющемся присутствии вируса в крови мыши.

В документе ANDTBACKA R. H. I. et al. «Clinical Responses of Oncolytic Coxsackievirus A21 (V937) in Patients With Unresectable Melanoma», Journal of Clinical Oncology, 2021, v. 39, no. 34, p. 3829-3838, раскрыты клинические исследования по активности внутриопухолевого вируса Коксаки А21 (V937) у 57 пациентов с неоперабельной меланомой IIIC или IV стадии. Отмечено, что V937 хорошо переносился и требует дальнейшего изучения возможности лечения пациентов с неоперабельной меланомой.

Кроме того, было установлено, что пероральное введение апатогенных штаммов энтеровирусов, также как и аттенуированных вакцинных штаммов полиовирусов, не вызывает болезненных проявлений, но сопровождается выработкой интерферонов, способных оказывать профилактическое действие против вирусных инфекций (см. Voroshilova M.K. 1989. Potential use of nonpathogenic enteroviruses for control of human disease. Prog Med Virol. 36, 191-202, и Ворошилова М.К. 1988. Вирусологические и иммунологические аспекты применения ЖЭВ при онкологических заболеваниях. In: Полезные для огранизма непатогенные штаммы энтеровирусов: профилактическое и лечебное их применение Москва, pp. 24-29), в частности, оказывая неспецифическое защитное действие от гриппа и других сезонных респираторных вирусных инфекций, продолжающееся в течение по крайней мере трех недель (см. Чумаков М.П., Ворошилова М.К., Анцупова А.С., Бойко В.М., Блинова М.И., Приймяги Л.С., Родин В.И., Сейбиль В.Б., Синяк К.М., Смородинцев А.А., Степанчук В.А., Терехов С.Н., Трофимова Л.И., Чумаков П.М. 1992. Живые энтеровирусные вакцины для экстренной профилактики массовых респираторных заболеваний во время осенне-зимних эпидемий гриппа и острых респираторных заболеваний. Журнал микробиологии, эпидемиологии и инфекционных заболеваний. 37-40).

Как следует из приведенного выше уровня техники было установлено, что непатогенные энтеровирусы обладают онколитической активностью, избирательно уничтожая опухолевые клетки человека (см. также Kunin C.M. 1964. CellularSusceptibilitytoEnteroviruses. BacteriolRev. 28, 382-390, Чумаков П.М., Морозова В.В., Бабкин И.В., Байков И.К., Нетесов С.В., Тикунова Н.В. 2012. Онколитические энтеровирусы. Молекулярная биология. 46, 712-725 и Демина А.В., Терновой В.А., Святченко В.А., Киселев Н.Н., Локтев В.Б., Нетесов С.В., Чумаков П.М. 2013. Непатогенный энтеровирус Коксаки B6, обладающий потенциальными онколитическими свойствами Сибирский онкологический журнал. Прил 1, 34).

Однако онколитическая активность отдельных энтеровирусных штаммов может значительно варьировать в опухолях пациентов обуславливая индивидуальный характер терапевтического ответа. Поэтому для достижения приемлемого терапевтического результата требуется персонифицированный подбор вирусных препаратов, обладающих различиями в тропизме в отношении индивидуальных опухолей.

Таким образом, сохраняется потребность в новых непатогенных штаммах Энтеровируса человека А для профилактики вирусных инфекций и лечения онкологических заболеваний.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Поставленная задача была решена авторами настоящего изобретения посредством создания нового непатогенного штамма LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7.

Указанный новый непатогенный штамм LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, обладает протективным действием в отношении вирусов и онколитической активностью.

Указанный новый непатогенный штамм LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, предназначен для неспецифической профилактики вирусных инфекций, в частности для экстренной неспецифической профилактики вирусных инфекций, и лечения онкологических заболеваний.

Указанный новый непатогенный штамм LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, был депонирован 1 ноября 2023 г. в Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России) под номером 3028 (инвентарный номер штамма согласно паспорту штамма - ГКВ №3028). Соответствующее удостоверение о депонировании и паспорт штамма LEV82 (ЖЭВ82) поданы вместе с настоящей заявкой.

Новый непатогенный штамм LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, адаптирован к росту на опухолевых клетках человека и обладает, благодаря этому, выраженным онколитическим эффектом против широкого перечня злокачественных новообразований. Новый непатогенный штамм LEV82 также обладает выраженным иммуностимулирующим действием, способностью предотвращать или снижать тяжесть течения респираторных вирусных инфекций.

Новый непатогенный штамм LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, также обладает следующими характеристиками:

- получен в результате 25 последовательных пассажей на 5-ти клеточных культурах (MDA-MB-468, SC-OV-3, LN229, H1299 и RKO),

- демонстрирует высокие инфекционные титры, в частности, более высокие, чем инфекционные титры исходного штамма ЖЭВ8,

- обладает высокой онколитической активностью,

- обладает минимальной токсичностью для организма даже при введении в дозе, в 2000 раз превышающей терапевтически-эффективную,

- проявляет высокое протективное действие в отношении заражения вирусами.

Таким образом, технический результат настоящего изобретения состоит в предоставлении нового непатогенного штамма LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, обладающего онколитической активностью и протективным действием в отношении заражения вирусами, для неспецифической профилактики вирусных инфекций, в частности для экстренной неспецифической профилактики вирусных инфекций, и лечения онкологических заболеваний.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Инфекционный титр препаратов пассируемого энтеровируса, регистрируемый на клетках линии Vero

Фиг. 2. Инфекционный титр препарата энтеровируса перед первым пассажем и после 25-го пассажа, измеренный на клеточных культурах MDA-MB-468, SC-OV-3, LN229, H1299 и RKO

Фиг. 3. Инфекционный титр препарата энтеровируса перед первым пассажем и после 25-го пассажа, измеренный на клеточных культурах Vero и HEK-293.

Фиг. 4. Инфекционный титр препарата энтеровируса после 25-го пассажа, после инокуляции клеток линии HEK-293T с нокаутами различных вирусных рецепторов.

Фиг. 5. Нейтрализующий эффект антисывороток к различным серотипам энтеровирусов человека, при добавлении к препарату энтеровируса после 25-го пассажа в разведении 1/100, измеренный при инокуляции монослойных культур клеток линии Vero с MOI=0.1

Фиг. 6. Динамика роста ксенотрансплантов клеток линии U87-MG у мышей линии Balb/c nude.

Фиг. 7. Динамика роста ксенотрансплантов клеток линии U87-MG у мышей линии Balb/c nude, которым было введено 5х10⁵ И.Е. вируса после 25-го пассажа в хвостовую вену в день трансплантации опухолевых клеток.

Фиг. 8. Динамика роста ксенотрансплантов клеток линии U87-MG у мышей линии Balb/c nude, которым было введено 5х10⁵ И.Е. вируса после 25-го пассажа в хвостовую вену через 3 дня после трансплантации опухолевых клеток.

Фиг. 9. Динамика изменения среднего веса в группах мышей линии C57BL/6 после введения в хвостовую вену 1х10⁵, 1х10⁶, 1х10⁷, 1х10⁸ и 1х10⁹ И.Е. вируса после 25-го пассажа.

Фиг. 10. Динамика изменения вирусного титра H1N1/2014 в назофарингеальном лаваже инфицированных сирийских хомячков, получавших в качестве профилактики 1x10⁷ И.Е. LEV82 либо плацебо

Фиг. 11. Динамика изменения среднего веса в группах сирийских хомячков, инфицированных вирусом SARS-CoV-2 штамм ПИК35 (группы «плацебо» и «LEV82»), либо не инфицированных, получавших в качестве профилактики либо плацебо (группа «плацебо»), либо 1x10⁷ И.Е. LEV82 (группа «LEV82»).

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Новый непатогенный штамм LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, создан авторами настоящего изобретения на основе исходного непатогенного природного штамма ЖЭВ8 (см. Ворошилова М.К. 1970. Материалы 13 Всесоюзного съезда эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов (Тбилиси), p. 355). Штамм ЖЭВ8 был выделен из стула здорового ребенка 3 летнего возраста и на его основе была создана живая энтеровирусная вакцина 8 (ЖЭВ8) которая в 1970-е годы проходила испытания в институте полиомиелита и вирусных энцефалитов в качестве средства для неспецифической защиты от ряда вирусных инфекций, а также в качестве онколитического средства для лечения ряда онкологических заболеваний. Однако этот штамм обладал ограниченной способностью репликации на культурах клеток почки африканских зеленых обезьян, а также низким спектром чувствительных опухолевых клеток человека.

Созданный новый непатогенный штамм LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, получен в результате 25 последовательных пассажей на 5-ти клеточных культурах (MDA-MB-468, SC-OV-3, LN229, H1299 и RKO) и адаптирован к росту на опухолевых клетках человека. Новый непатогенный штамм LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, адаптирован к росту на опухолевых клетках человека и обладает благодаря этому выраженным онколитическим эффектом против широкого перечня злокачественных новообразований. Новый непатогенный штамм LEV82 также обладает выраженным иммуностимулирующим действием, способностью предотвращать или снижать тяжесть течения респираторных вирусных инфекций.

Созданный новый непатогенный штамм LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, демонстрирует высокие инфекционные титры, в частности, более высокие, чем инфекционные титры штамма ЖЭВ8, обладает высокой онколитической активностью и минимальной токсичностью для организма даже при введении в дозе, в 2000 раз превышающей терапевтически-эффективную, а также проявляет высокое протективное действие в отношении заражения вирусами.

Созданный новый непатогенный штамм LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, предназначен и может применяться для неспецифической профилактики вирусных инфекций, в частности для экстренной неспецифической профилактики вирусных инфекций, и лечения онкологических заболеваний.

Указанный новый непатогенный штамм LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, был депонирован в Государственной коллекции вирусов под номером 3028.

Получение нового непатогенного штамма LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, его характеристики и свойства проиллюстрированы в приведенных ниже примерах и на приложенных чертежах.

Примеры

Пример 1. Получение энтеровируса штамма LEV82

Непатогенный энтеровирус штамма LEV8 подгруппы А был культивирован на клеточных культурах злокачественных новообразований человека. Для этого, клетки линий MDA-MB-468 (трижды-негативный рак молочной железы), SC-OV-3 (рак яичника), LN229 (мультиформная глиобластома), H1299 (немелкоклетоный рак легкого) и RKO (рак толстой кишки) высаживали на культуральные флаконы Т175 в плотности, соответствующей 80% монослоя. На следующий день, культуры инокулировали препаратом вируса LEV8 с множественностью инфекции (MOI = 0.01). Для этого производили замену среды на свежую, не содержащую сыворотку среду DMEM/F12 в количестве 10 мл с добавлением препарата вируса. Через 1 час после инокуляции, вирус-содержащую среду удаляли и добавляли 55 мл среды DMEM/F12, содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки. Клетки продолжали культивировать в обычных условиях (37С, в атмосфере 5% CO2) с периодическим мониторингом состояния клеточного монослоя на предмет развития цитопатического действия вируса. После того, как более 50% монослоя было лизировано вирусом, производили сбор вирус-содержащих супернатантов. Супернатанты подвергали центрифугированию при 4400 об/мин в течение 10 минут для удаления крупных фрагментов лизированных клеток, с последующей фильтрацией через шприцевые фильтры с порой 0.45 мкм. Затем полученные вирусные препараты объединяли и проводили определение инфекционного титра смеси.

Для определения инфекционного титра, клетки линии Vero (почечный эпителий африканской зеленой мартышки) высеивали на лунки 96-луночного планшета в количестве 15000 клеток на лунку. На следующий день готовили серийные разведения вирусного препарата - два последовательных стократных, затем 10-кратное и 10 2-кратных. Последние 11 разведений использовали для инокуляции лунок 96-луночного планшета в трех повторностях. Для инокуляции использовали по 100 мкл вирус-содержащей среды. На 4-й день после инфицирования проводили подсчет лунок в каждом ряду планшета, в которых наблюдалось выраженное цитопатическое действие, и определяли инфекционный титр при помощи метода Спермана-Карбера.

После определения инфекционного титра, пассированный препарат вируса вновь использовался для инокуляции монослоев клеточных культур MDA-MB-468, SC-OV-3, LN229, H1299 и RKO таким же образом, как описано выше. Всего было проведено 25 последовательных пассажей. В ходе пассирования вируса наблюдался ступенчатый рост инфекционного титра препаратов, измеренный на культуре клеток Vero (фиг. 1). В то время как исходный препарат LEV8 обладал инфекционным титром в 1х10⁷ И.Е. на мл, после 25-го пассажа регистрируемый инфекционный титр увеличился до ~3x10⁸ И.Е. на мл.

После 25-го пассажа, для инфицирования клеточных культур MDA-MB-468, SC-OV-3, LN229, H1299 и RKO был использован супернатант, собранный из одной из лунок 96-луночного планшета с инокулированными клетками Vero, соответствующей максимальному разведению вирусного препарата, где было зафиксировано цитопатическое действие, для повышения клональности итогового вирусного препарата. Для последующей инокуляции, культуры MDA-MB-468, SC-OV-3, LN229, H1299 и RKO были высеяны на 96-луночные планшеты по 15000 клеток на лунку, после чего они были инокулированы разведениями вирусного препарата способом, аналогичным использовавшемуся для определения инфекционного вирусного титра на клеточной культуре Vero. Параллельно с вирусом, прошедшим 25 пассажей была использована аликвота исходного вирусного препарата. Инфекционные титры, зафиксированные для каждой клеточной культуры при инокуляции исходным образцом вируса и пассированным вирусом, приведены на фиг. 2.

В результате последовательного пассирования, созданный новый штамм вируса, названный LEV82, приобрел способность к более эффективной репликации на всех пяти клеточных культурах, использовавшихся для пассирования. Далее была оценена способность нового штамма вируса реплицироваться в клеточной культуре трансформированного почечного эпителия человека HEK-293. Культура клеток была рассеяна на 96 луночные планшеты и использована для определения инфекционного титра исходного и нового вариантов вирусных препаратов способом, аналогичным описанному выше. Как видно из результатов опыта (фиг. 3), оба вирусных препарата обладали способностью реплицироваться в этой клеточной культуре с большей эффективностью, чем в культуре клеток Vero, при этом новый штамм вируса LEV82 демонстрировал более высокие инфекционные титры, чем исходный (4.47х10⁸ И.Е. на мл у нового штамма, и 2.3х10⁷ у исходного).

Далее было проведено определение клеточного рецептора, используемого новым штаммом вируса LEV82 для проникновения в клетку. Для этого использовали панель нокаутных клеточных культур, полученных из клеток линии HEK-293T, в которых была избирательно подавлена экспрессия определенного клеточного рецептора при помощи геномного редактирования CRISPR/Cas9. Были использованы клеточные линии с нокаутами рецепторов KRM1, FCGRT, CD55, ITGA2, ICAM1, SCARB2, CXADR и PVR2. Каждая клеточная культура была высеяна на флакон T25 в плотности, соответствующей 80% монослоя и инокулирована адапированным вирусом со множественностью MOI=0.01 аналогично описанному выше. Через 3 дня после заражения, образцы культуральной жидкости с каждой культуры были использованы для определения инфекционного титра вируса на клеточной культуре Vero. Как видно из фиг. 4, инфекционный вирусный титр на культурах с нокаутами KRM1, FCGRT, ITGA2, ICAM1, CXADR и PVR2 в целом соответствовал инфекционному титру, зафиксированному на исходной культуре HEK-293T. На культуре с нокаутом CD55 был зафиксирован в 15 раз меньший инфекционный титр, чем на контрольной культуре, а на культуре с нокаутом SCARB2 инфекционный титр находился на нижней границе детектируемых значений (более чем в 1000 раз ниже чем на контрольной культуре). Исходя из полученных данных можно сделать вывод о том, что новый штамм вируса LEV82 использует для проникновения в клетки преимущественно рецептор SCARB2.

Для определения серотипа нового штамма вируса были использованы поликлональные антисыворотки, полученные путем иммунизации животного (овцы) препаратами энтеровирусов различных серотипов. Были использованы антисыворотки против полиовируса 1 типа, вирусов Эхо1, Эхо12, Коксаки А7, Коксаки А21 и Коксаки В5. Клетки линии Vero рассеивали на лунки 12-луночного планшета, после чего готовили питательную среду без содержания сыворотки с добавлением препарата нового штамма вируса для проведения инокуляции с множественностью MOI=0.1. Затем в каждую аликвоту добавляли одну из антисывороток в конечном разведении 1:100, перемешивали и инкубировали в течение 15 минут. Затем образцы добавляли к клеточной культуре и культивировали в течение 3-х дней. На 3-й день культуры оценивали на предмет наличия и выраженности цитопатического действия. Результаты опыта (фиг. 5) показали, что добавление антисывороток против серотипов ПВ1, Эхо1, Эхо12, Коксаки А21 и Коксаки В5 не приводило к подавлению инфекции и репликации нового штамма вируса, в то время как добавление антисыворотки к серотипу Коксаки А7 полностью подавляло развитие вирусной инфекции на клеточной культуре Vero. Такие результаты эксперимента свидетельствуют о том, что новый штамм вируса обладает серотипом Коксаки А7.

Пример 2. Оценка онколитических свойств нового штамма LEV82

Для оценки онколитических свойств нового штамма вируса LEV82, группам иммунодефицитных мышей линии Balb/c nude трансплантировали по 5х10⁶ клеток линии U87-MG подкожно в область правого бедра. Затем одной группе (n=5) вводили по 5х10⁵ инфекционных единиц вируса инъекцией в хвостовую вену. Другой группе (n=5) такую же дозировку вируса вводили на 3-й день после трансплантации опухолевых клеток, когда размер новообразований составлял 9-39 мм³. Затем проводили измерения объема опухолей в группах с периодичностью в 3 дня до 15-го дня после трансплантации. К этому времени медианный размер опухолей в контрольной группе превысил 3000 мм3 (3118.6 ±1150.4 SD). Как видно из результатов, представленных на фиг. 6-8, у мышей, получивших новый штамм вируса, динамика роста опухолевых ксенотрансплантов значительно отличалась от динамики роста в контрольной группе. У мышей, получивших терапию одновременно с введением опухолевых клеток, размер опухолей не превышал 41 мм3, при этом наблюдалась динамика по регрессии первичных опухолей не позднее 12-го дня после трансплантации. На 15-й день после введения медианный объем опухоли в группе составлял 2.4 мм³, при этом у 4 животных из 5 опухоли полностью отсутствовали . У мышей, получивших терапию спустя три дня после введения опухолевых клеток, также наблюдался существенно замедленный рост новообразований, причем у 4-х из 5 мышей также наблюдалась регрессия опухолей к 15-му дню после трансплантации, а у пятой опухоль прекратила рост. Максимальный зафиксированный объем опухоли составил 229 мм³, а на 15-й день. - 114 мм³ (медианный - 39.6 мм³). Полученные данные свидетельствуют о высокой онколитической активности нового штамма вируса в отношении мультиформной глиобластомы.

Пример 3. Определение токсической дозы нового штамма LEV82

Для определения токсической дозы, вирус штамма LEV82 нарабатывали на клеточной культуре Vero на роллерных бутылях, после чего предварительно центрифугированные и профильтрованные вируссодержащие супернатанты смешивали с раствором для концентрирования вируса (40% PEG-8000, 1.2 M NaCl) в соотношении 3:1, интенсивно перемешивали и инкубировали во льду в течение 12 часов. Затем препарат центрифугировали при 10000G в течение 30 минут, удаляли надосадочную жидкость а осадок растворяли в 1/50 исходного объема фосфатно-солевого буфера. Полученный концентрированный вирусный препарат дополнительно очищали путем хроматографии на колонках со смешанным сорбентом Capto-Core 700 и определяли инфекционный титр на клеточной культуре Vero. Взрослых разнополых мышей линии C57BL/6 делили на группы (n=3), каждой группе вводили в хвостовую вену дозировки нового штамма вируса LEV82 от 1х10⁵ И.Е. до 1х10⁹ И.Е. с шагом в 10, после чего проводили регистрацию веса каждого животного раз в 3 дня в течение 15 дней. Как видно из результатов опыта (фиг. 9), незначительное снижение веса наблюдалось в группах, получивших 1х10⁸ и 1х10⁹ инфекционных единиц вируса, максимальное падение веса было зафиксировано на 6-й день после введения и составило менее 10%. После 6-го дня в обеих группах наблюдался набор веса, к 15-му дню животные в обеих группах восстановили вес до исходных значений (медианный вес в группе 1х10⁸ И.Е. - 20.46 г. и 20.83 г. на первый и 15-й день, соответственно, в группе 1х10⁹ И.Е. - 20.17 г. и 19.78 г.). Такие результаты указывают на то, что новый штамм вируса LEV82 обладает минимальной токсичностью для организма даже при введении в дозировке, в 2000 раз превышающей терапевтически-эффективную.

Совокупность полученных данных свидетельствуют о том, что новый штамм вируса LEV8 обладает выраженными онколитическими свойствами, низкой токсичностью и способностью более эффективно реплицироваться в опухолевых клетках, чем исходный штамм.

Пример 4. Оценка протективного действия нового штамма LEV82 в отношении заражения вирусом гриппа H1N1/2014

Для оценки протективного действия LEV82 в отношении заражения вирусом гриппа H1N1/2014 проводили серийную оценку вирусного титра в лаваже верхних дыхательных путей у сирийских хомячков.

В экспериментах использовали штамм A/Tokyo/IMS1-1/2014 [pdmH1N1/2014], который культивировался на клетках линии MDCK. Препараты вируса разводили в питательной среде MEM с добавлением 0.3% бычьего сывороточного альбумина; лунки планшета с конфлюэнтным монослоем клеток MDCK троекратно промывали питательной средой, затем инфицировали разведенными препаратами вируса и инкубировали в течение 1 часа при 37С. Затем лунки снова промывали питательной средой и покрывали смесью MEM в двукратной концентрации + 0.6% БСА в соотношении 1:1 с 2% агарозой, содержащей 1 мкг/мл TPCK-трипсина и инкубировали в течение 48 часов, после чего проводился подсчет вирусных бляшек. После определения вирусного титра, препарат вируса гриппа использовали для инфекции групп сирийских хомячков. Каждая группа содержала по 5 животных (самок) возрастом 6-8 недель. За 72 часа до инфекции, животные получали 100 мкл препарата (плацебо, либо 1x10⁷ И.Е. LEV82 при помощи внутрижелудочного введения.

Перед заражением проводили наркотизацию животных препаратами Золетил (20 мг/кг) и Ксила (5 мг/кг). Заражение сирийских хомячков осуществляли путем однократного интраназального введения 100 мкл вирусного препарата в дозе 1х10⁶ И.Е./животное, в объеме 50 мкл в каждый носовой ход. Для оценки содержания вирусных частиц в верхних дыхательных путях, животным ежедневно проводился назофарингеальный лаваж в объеме 100 мкл, вирусный титр определялся вышеописанным способом.

Как видно из результатов измерений, определяемый вирусный титр на слизистых носоглотки животных из группы LEV82 начиная с первого дня после инфекции отличался примерно в 10 раз в меньшую сторону от вирусного титра в группе плацебо, а после 4-го дня ни у одного из животных не определялось наличие инфекционных вирусных единиц в назофарингеальном лаваже. В группе плацебо снижение вирусного титра наблюдалось лишь на 5-й день, и определялось вплоть до 6-го дня наблюдений.

Результаты эксперимента свидетельствуют о наличии протективного действия LEV82 в отношении заражения вирусом гриппа H1N1/2014.

Пример 5. Оценка протективного действия нового штамма LEV82 в отношении заражения вирусом SARS-CoV-2

Для оценки протективного действия LEV82 в отношении заражения SARS-CoV-2 проводили оценку динамики изменения веса у сирийских хомячков.

В экспериментах использовали штамм ПИК35 вируса SARS-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_428852), который был выделен на культуре клеток Vero из назофарингеального мазка больного COVID-19. Штамм прошел четыре последовательных пассажа в культуре клеток Vero. Штамм оказывал цитопатический эффект (ЦПЭ) на клетки Vero. Вирус выращивали в клетках Vero, аликвоты вируса были заморожены и хранились при температуре -80°С.

Титр вируса определяли в культуре клеток Vero по способности вызывать признаки ЦПЭ. Для этого 3-дневные конфлюэнтные монослои клеток Vero, посаженных на 96-луночные планшеты, заражали 10-кратными разведениями вируссодержащей суспензии в 8 повторностях. ЦПЭ учитывали на 5 сутки после заражения в световом микроскопе. Титр рассчитывали по формуле Кербера. Средний титр рассчитывали по результатам трёх независимых экспериментов.

Каждая экспериментальная группа состояла из 5 животных (самок) возрастом 6-8 недель. Группы плацебо и LEV82 за 3 дня до начала опыта получали 100 мкл препарата (плацебо, либо 1x10⁷ И.Е. LEV82 при помощи внутрижелудочного введения.

Перед заражением проводили наркотизацию животных препаратами Золетил (20 мг/кг) и Ксила (5 мг/кг). Заражение сирийских хомячков осуществляли путем однократного интраназального введения суспензии клеток, заражённых вирусом SARS-CoV-2 шт. ПИК35, в дозе 1х10⁵ И.Е./животное, в объеме 25 мкл в каждый носовой ход (суммарно 50 мкл на одно животное).

Животных наблюдали ежедневно, отмечались любые отклонения в общем состоянии у каждого животного. Массу тела животных измеряли ежедневно. У всех заражённых животных со 2 суток после заражения наблюдали снижение массы тела. Результаты измерения вирусных титров в группах животных представлены на фиг. 11.

У интактных хомяков на протяжении всего наблюдения не было отмечено симптомов интоксикации. При осмотре в клетке - активность и реакция на раздражители была стандартная, без признаков угнетения или возбуждения, отношение к другим животным без признаков агрессии. Тонус мышц был умеренный, шерсть блестящая, опрятного вида, без очагов облысения. Кожные покровы и видимые слизистые поверхности не имели признаков раздражения и воспаления, петехий, экхимоз и гематом не зарегистрировано. Целостность покровов и оболочек не была нарушена, видимые слизистые поверхности были блестящие. Деформации или отека конечностей не отмечено. Экзофтальма, нарушения целостности, слезотечения, патологических выделений из глаз не отмечали. Нос у всех животных был умеренно влажный, без патологических выделений. Нарушений слюноотделения не наблюдали. Двигательная активность у интактных животных находилась в пределах нормы. Нарушений походки и координации не отмечено. У всех животных отмечали нормальное дыхание. Патологических выделений при уринации и дефекации не регистрировали.

У хомяков группы плацебо на 2-5 сутки после заражения отмечались симптомы интоксикации; при осмотре в клетке - активность и реакция на раздражители умеренно угнетена. На 6-7 сутки состояние контрольных животных улучшилось, и показатели возвращались к норме по мере набора веса.

У хомяков группы LEV82 в течение всего эксперимента не наблюдалось симптомов интоксикации либо иных признаков развития вирусной инфекции, двигательная активность сохранялась в пределах нормы. На 1-й день после инфекции наблюдалось статистически незначительное, относительно контрольной группы, замедление набора веса.

Результаты эксперимента свидетельствуют о наличии протективного действия LEV82 в отношении заражения коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новому непатогенному штамму LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, депонированному в Государственной коллекции вирусов под номером 3028. Изобретение применяется для неспецифической профилактики вирусных инфекций, в частности экстренной неспецифической профилактики вирусных инфекций и лечения онкологических заболеваний. 11 ил., 5 пр.

Непатогенный штамм LEV82 Энтеровируса человека А, серотип Коксаки А7, для неспецифической профилактики вирусных инфекций и лечения онкологических заболеваний, депонированный в Государственной коллекции вирусов под номером 3028.