ШТАММ ЭНТЕРОВИРУСА КОКСАКИ В6, СЕЛЕКТИВНО ИНФИЦИРУЮЩИЙ И ЛИЗИРУЮЩИЙ ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА in vitro Российский патент 2013 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 A61P35/00 

Изобретение относится к штаммам вируса Коксаки В6, а именно к штамму ЖЭВ-15^L, селективно инфицирующему и лизирующему опухолевые клетки человека in vitro, перспективного для разработки на его основе вирусного онколитического препарата для терапии злокачественных новообразований человека и определения полной нуклеотидной последовательности его генома, и может быть использовано в медицинской вирусологии, биотехнологии и микробиологии.

В современном обществе все более острой становится проблема заболеваемости раком. По данным Всемирной Организации Здравоохранения ежегодно в мире от злокачественных новообразований умирает более пяти миллионов людей. Несмотря на достигнутые существенные успехи в диагностике и лечении онкологических заболеваний, злокачественные новообразования занимают второе место в развитых странах среди причин летальных исходов, вслед за сердечно-сосудистыми заболеваниями. В настоящее время хирургические методы, химио- и радиационная терапия - это основные способы лечения рака. Многие формы опухолей являются неоперабельными, устойчивыми к химио- и радиотерапии. Кроме того, существенным минусом химио- и радиотерапии является их низкий терапевтический индекс. Поэтому увеличение дозы или комбинация терапий для преодоления устойчивости или усиления разрушения раковых клеток ограничены токсичностью по отношению к нормальным тканям.

Вышеуказанное доказывает необходимость разработки новых эффективных и безопасных средств терапии онкологических заболеваний, это является одной из основных задач современной мировой науки. В последние десятилетия имеет место бурное развитие исследований, направленных на разработку опухолево-специфичных терапевтических средств на основе различных вирусов.

Родительский для заявляемого штамма штамм ЖЭВ-15 наряду с другими энтеровирусными штаммами серии ЖЭВ (живая энтеровирусная вакцина) был выделен в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР [1] при массовых обследованиях детей в детских учреждениях. Все энтеровирусные штаммы (10 различных иммунологических типов) серии ЖЭВ были выделены от клинически здоровых детей носителей этих вирусов, которые оставались здоровыми в течение периода присутствия этих энтеровирусов в их пищеварительном тракте и позже при периодических осмотрах в течение трех лет (срок наблюдения). После проведения исследований безопасности и ареактогенности этих штаммов [2, 3, 4] энтеровирусные штаммы ЖЭВ (ЖЭВ-4, ЖЭВ-7, ЖЭВ-8, ЖЭВ-11, ЖЭВ-15 и др.) использовались для пероральной вакцинации детей с целью профилактики и купирования вспышек энтеровирусных инфекций в детских учреждениях. Проведенные широкомасштабные исследования показали высокую интерферирующую активность живых энтеровирусных вакцин и обусловленную этим эффективность вакцинации в отношении энтеровирусных инфекций, а также в отношении вспышек гриппа и острых респираторных вирусных инфекций среди детей и взрослых [5, 6, 7].

К настоящему времени описано несколько не модифицированных методами генетической инженерии штаммов энтеровирусов, обладающих избирательной онколитической активностью.

Известен вирусный препарат Rigvir, представляющий собой энтеровирус ECHO7 (аналог), зарегистрированный в Латвийском Государственном Агентстве лекарств 28.04.2004. Рег. № 04-0229 и рекомендованный для системного и локального применения больным меланомой в сочетании с химио- и оперативной терапией. Онкотропизм вируса Rigvir в отношении клеток меланомы обусловлен адаптацией исходного штамма ECHO7 к репликации в культурах клеток меланомы человека in vitro. Недавно показано, что вирус ECHO1 имеет высокий тропизм к неопластическим клеткам яичника человека [10].

Однако вышеприведенные аналоги, в том числе штамм-прототип, обеспечивают лизис узкого спектра чувствительных опухолевых клеток человека и имеют недостаточную способность к избирательному инфицированию клеток.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание такого непатогенного штамма вируса, который способен избирательно инфицировать и лизировать более широкий спектр неопластических клеток человека различной тканевой принадлежности и обеспечивать возможность создания на его основе онколитического вирусного препарата для терапии злокачественных новообразований человека.

Указанный технический результат достигается проведением серии адаптационных пассажей родительского штамма вируса Коксаки В6 на высокочувствительной к данному вирусу культуре клеток НЕК293 и неопластической клеточной линии С33А (HPV-негативная карцинома шейки матки человека), с получением нового штамма ЖЭВ-15^L вируса Коксаки В6, селективно инфицирующего и лизирующего опухолевые клетки человека in vitro для создания на его основе противоопухолевого препарата, имеющего фрагмент геномной нуклеотидной и аминокислотной последовательности, представленной на фиг.2, являющийся его маркерными признаками, и депонированного в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») под регистрационным номером V-576.

Основными отличиями предлагаемого штамма ЖЭВ-15^L от вышеприведенных энтеровирусных штаммов являются его способность к избирательному инфицированию и лизису более широкого спектра чувствительных опухолевых клеток человека и то, что родительский для заявляемого штамм ЖЭВ-15 (наряду с другими штаммами серии ЖЭВ) использовался в качестве живого вакцинного препарата.

Характеристика заявляемого штамма. Штамм ЖЭВ-15^L является типичным представителем энтеровирусов - семейство Picornaviridae, род Enterovirus, вид Human enterovirus B, серотип Coxsackievirus B6. Заявляемый штамм ЖЭВ-15^L получен посредством серийного пассирования родительского штамма ЖЭВ-15 вируса Коксаки В6 на трансформированной и опухолевой клеточных линиях человека, НЕК293 и С33А, соответственно. Штамм ЖЭВ-15 наряду с другими вирусными штаммами серии ЖЭВ эффективно размножался в культурах почечных клеток зеленых мартышек и макак резусов, вызывая типичные проявления цитопатического эффекта [1]. С целью адаптации родительского штамма ЖЭВ-15 к репликации в опухолевой культуре клеток человека была использована методология, подробно изложенная в следующих работах [11, 12]; для аккумуляции генетически различающихся вариантов проведено три последовательных пассажа на культуре клеток НЕК293, после чего пять адаптационных пассажей на опухолевой культуре клеток С33А, с постепенно снижающейся множественностью инфицирования. После проведения клонирования вирусной популяции методом предельных разведений [11] и культивирования на клеточной культуре НЕК293, с целью получения препаративных количеств вирусного материала, полученный энтеровирусный вариант был наименован шт. ЖЭВ-15^L.

Таблица 1.

Сравнительное исследование литической активности штаммов ЖЭВ-15^L и ЖЭВ-15 в отношении культур клеток VERO, НЕК293 и С33А

Штамм Титр на культуре VERO (ТЦПД₅₀/мл) Титр на культуре НЕК293 (ТЦПД₅₀/мл) Титр на культуре С33А (ТЦПД₅₀/мл) ЖЭВ-15 5×10⁸ 5×10⁶ 5×10⁵ ЖЭВ-15^L 10⁹ 2×10⁹ 2×10⁹

Была проведена первичная характеризация инфекционных (литических) свойств штамма ЖЭВ-15^L в сравнении с родительским ЖЭВ-15 на культурах клеток VERO, HEK293 и C33A (Таблица 1).

Как следует из представленных результатов, штамм ЖЭВ-15^L обладает существенно большей литической активностью в отношении клеток HEK293 и C33A по сравнению с родительским штаммом, при том, что оба штамма с практически одинаковой эффективностью инфицируют и лизируют культуру клеток VERO (перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки).

При исследовании инфекционных (цитолитических) свойств штамма ЖЕВ-15^L на панели опухолевых и нормальных клеток человека (см. пример 1) показано, что он обладает высокой степенью избирательности литической активности in vitro в отношении использованных опухолевых культур клеток. Штамм ЖЕВ-15^L не инфицирует и не лизирует нормальные диплоидные клетки ФЭЧ-15 и MRC-5 (инфекционный титр ниже 10² ТЦПД₅₀/мл), и в тоже время, эффективно лизирует неопластические культуры клеток. Наиболее высокие величины индексов селективности (ИС) шт. ЖЕВ-15^L - отношение литической активности вируса (инфекционного титра) для использованных в исследовании опухолевых клеток к таковой для нормальных диплоидных клеток человека - отмечены в отношении опухолевых клеток С33А, HepG2 и DU-145 и составляют не менее чем 10⁷, 5×10⁶ и 5×10⁵, соответственно. ИС для культур опухолевых клеток SW480 и A549 не ниже, чем 2×х10³. Используемые в качестве штаммов сравнения шт. ЖЭВ-8 (вирус Коксаки А7) и шт. ЖЭВ-10 (вирус Коксаки В1) не проявили селективной литической активности в отношении опухолевых культур клеток in vitro. Как указывалось выше, штамм вируса Коксаки А21 (прототип), на основе которого разработан онколитический препарат Cavatak^tm, с которым в настоящее время проводится Фаза II клинических испытаний, обладает выраженной селективной литической активностью in vitro в отношении клеток злокачественной меланомы человека. Согласно литературным данным ИС этого штамма для культур клеток Sk-Mel-28 (меланома) и MRC-5 составляет 5×10⁴, для DU-145 (карцинома предстательной железы) и MRC-5 - 10³, а культура клеток легочной аденокарциномы А549 даже менее чувствительна к данному штамму, чем нормальная диплоидная культура легочных клеток MRC-5 [8, 9, 13]. Приведенные данные свидетельствуют о том, что заявляемый штамм ЖЕВ-15^L эффективно инфицирует и лизирует более широкий спектр опухолевых культур клеток человека in vitro и обладает более выраженной степенью избирательной литической активности в отношении клеток карциномы простаты и легочной аденокарциномы по сравнению со штаммом прототипом.

Таким образом, непатогенный энтеровирусный штамм ЖЕВ-15^L обладает выраженной способностью к селективному инфицированию и лизису опухолевых культур клеток различной тканевой принадлежности in vitro, что свидетельствует о перспективности дальнейших исследований онколитической активности данного энтеровирусного штамма с целью разработки на его основе эффективного и безопасного онколитического вирусного препарата для терапии злокачественных новообразований человека.

Для установления генотипа штаммов заявляемого ЖЕВ-15^L и родительского ЖЕВ-15 образцы вирусного материала были исследованы методом ОТ-ПЦР с использованием набора олигонуклеотидных праймеров на 5'UTR для диагностики и генотипирования энтеровирусов человека видов A, B, C, D. По определенной нуклеотидной последовательности 5'UTR генома была установлена принадлежность штаммов ЖЕВ-15^L и ЖЕВ-15 к энтеровирусу Коксаки В6. C использованием вирус-специфических праймеров, рассчитанных на весь геном энтеровируса Коксаки В6, было проведено определение полных нуклеотидных последовательностей геномных РНК штаммов ЖЭВ-15 и ЖЕВ-15^L (см. пример 2). По сравнению с родительским штаммом шт. ЖЕВ-15^L имеет три нуклеотидные замены: С₂₆₇₉→А, A₄₄₀₃→G и A₆₇₉₂→T; две первые из которых приводят к аминокислотным заменам - Thr→Lys (белок VP1) и Ser→Gly (белок 2С) (Фиг.1, Табл.2). Таким образом, идентифицированы структурные отличия генома шт. ЖЕВ-15^L от родительского штамма, приобретенные в процессе адаптации последнего к клеточным культурам НЕК293 и С33А, обеспечивающие репликативные преимущества шт. ЖЕВ-15^L при инфицировании указанных клеток (фиг.1).

Полная нуклеотидная последовательность генома штамма ЖЕВ-15^L депонирована в международной базе GenBank под номером JQ041368 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). При проведении анализа полной нуклеотидной последовательности генома штамма ЖЕВ-15^L в сравнении с опубликованными последовательностями различных энтеровирусов показано, что наиболее близким по нуклеотидной последовательности штаммом к представляемому штамму является штамм Schmitt вируса Коксаки В6 (Coxsackievirus B6 strain Schmitt, GenBank AF105342, AF114384) (Фиг.3), процент гомологии составил 99% для нуклеотидной (14 нуклеотидных отличий) и 99% для аминокислотной последовательностей (8 аминокислотных отличий). В тоже время, с другими генотипами энтеровирусов процент гомологии как по нуклеотидной, так и по аминокислотным последовательностям ниже 91% (Таблица 3).

Маркерные генетические признаки. Штамм ЖЕВ-15^L имеет три нуклеотидные замены по отношению к родительскому штамму ЖЕВ-15: С₂₆₇₉→А, A₄₄₀₃→G и A₆₇₉₂→T; две первые из которых приводят к аминокислотным заменам - Thr→Lys (белок VP1) и Ser→Gly (белок 2С). Маркерные признаки заявляемого штамма содержат фрагмент геномной нуклеотидной и аминокислотной последовательности, представленный на фиг.2.

Культуральные свойства. Штамм ЖЕВ-15^L культивируется на монослое культуры клеток НЕК293 (клетки почки эмбриона человека, трансформированные генами E1A и E1B аденовируса 5-го серотипа), которая одобрена ГИСК им. Л.А. Тарасевича (протокол №14 от 28.10.03 заседания Ученого Совета ГИСК им. Л.А. Тарасевича; протокол №9 от 20.11.03 Комитета МИБП) к использованию в качестве субстрата для производства противоопухолевого вирусного препарата «Канцеролизин» (мутантный вариант аденовируса человека 5-го серотипа, дефектный по гену белка Е1В55К). При инфицировании клеточного монослоя штамм ЖЕВ-15^L вызывает типичное для энтеровирусов цитопатическое действие (ЦПД) через 16-48 часов в зависимости от множественности инфицирования (температура культивирования 37°С, в атмосфере с 5% CO₂). Инфекционный титр вируса составляет 10⁸ - 10⁹ ТЦПД₅₀/мл (50% тканевая цитопатогенная доза).

Культуру клеток НЕК293 выращивают как монослойную на среде DMEM (Gibco BRL, Germany), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Gibco BRL, Germany) c 80 мкг/мл гентамицина сульфата. Субконфлюентный монослой клеток НЕК293 инфицируют шт. ЖЕВ-15^L с оптимальной множественностью 0.1 - 0.01 ТЦПД₅₀/кл, после проведения адсорбции в течение 1 ч при 37°С, инфицированный клеточный монослой инкубируют в поддерживающей среде DMEM, содержащей 2% ЭТС до наступления 75-90% ЦПД. После чего культуральную среду вместе с клетками отбирают и вируссодержащую суспензию осветляют посредством низкоскоростного центрифугирования (5000 об/мин, 10 мин). Получение препаративных количеств очищенного шт. ЖЕВ-15^L осуществляют согласно следующей методологии: проводят концентрирование полиэтиленгликолем (ПЭГ) 6000 (7%, 4⁰С, 12 ч) после чего суспензию центрифугируют 2000g, 4⁰С, 2 ч. Супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в PBS, суспензию гомогенезируют ультразвуком. После чего проводят очистку в градиенте плотности сахарозы либо хлористого цезия. В случае применения градиента плотности сахарозы обычно используют 15-45% линейный градиент объемом 30 мл в пробирках объемом 35 - 40 мл (например, от ротора SW28, Beckman). К очищаемому образцу добавляют 1/10 объема 10% NP-40, объем образца не должен превышать 6 мл на пробирку, и осторожно наслаивают на ранее полученный градиент. Пробирки центрифугируют при 80000g, 4⁰С, 4 ч (например, в роторе SW28 на центрифуге L8, Beckman при 25000 об/мин). Градиент фракционируют, инфекционный вирус должен давать пик на расстоянии 2/3 длины пробирки от мениска. При необходимости получения более высокой степени очистки проводят дополнительное центрифугирование в преформированном градиенте плотности хлористого цезия.

Условия консервации и хранения штамма. Подобно другим энтеровирусам штамм ЖЕВ-15^L отличается достаточно высокой устойчивостью к внешней среде, хранение в замороженном виде при -70⁰С (осветленная от клеточного дебриса вируссодержащая культуральная среда или очищенный вирус в PBS) в течение года не приводит к достоверной потере инфекционности. Выраженным стабилизирующим эффектом в отношении сохранности инфекционности энтеровирусов обладает MgCl₂ (1М). Для долговременного хранения штамм рекомендуется лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение неопределенного времени при хранении на -20°С.

Для крупномасштабной наработки и очистки штамма ЖЕВ-15^L возможно использование методологии роллерного монослойного культивирования и культивирования на микроносителях в условиях биореактора, очистки зональным проточным центрифугированием либо ультрафильтрацией и хроматографией.

Патогенность для человека. Подобно другим энтеровирусным штаммам серии ЖЭВ родительский шт. ЖЭВ-15 и заявляемый штамм ЖЕВ-15^L являются непатогенными для человека [2, 3, 4].

Патогенность для лабораторных животных. Штамм ЖЕВ-15^L не патогенен для мышей сосунков при интрацеребральном введении. Интрацеребральное инфицирование новорожденных мышей (двухдневные сосунки) дозой 2х10⁷ ТЦПД₅₀ шт. ЖЕВ-15^L не вызывает признаков нейровирулентности, миопатических и иных патологических проявлений на протяжении всего срока наблюдения (3 месяца). В связи с этим следует отметить, что штамм вируса Коксаки А21 (прототип), на основе которого разработан онколитический препарат Cavatak^tm, вызывает у мышей летальный миозит с паралитическими проявлениями [14].

Штамм ЖЕВ-15^L депонирован в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») под регистрационным номером V-576 (справка о депонировании прилагается).

Заявка содержит следующие графические материалы.

На фиг.1 представлены нуклеотидные и аминокислотные отличия между штаммами ЖЕВ-15 (прототип) и ЖЕВ-15^L. На фиг.2 и в приложении приведен фрагмент нуклеотидной и аминокислотной последовательности заявляемого штамма ЖЕВ-15^L, обладающий маркерными признаками, отличающими его от штамма-прототипа ЖЕВ-15. На фиг.3 представлено филогенетическое дерево энтеровирусных штаммов, построенное по нуклеотидным последовательностям полноразмерных геномных РНК (Метод Neighbor Joining).

Пример 1. Определение и сравнительный анализ полной нуклеотидной последовательности генома штамма ЖЕВ-15 ^L .

Для установления генотипа штаммов ЖЕВ-15^L и родительского ЖЕВ-15 образцы вирусного материала после пассирования на культуре клеток HEK293 были исследованы методом ОТ-ПЦР с использованием набора олигонуклеотидных праймеров на 5'UTR для диагностики и генотипирования энтеровирусов человека видов A, B, C, D. Полученные фрагменты ДНК секвенировали. По определенной нуклеотидной последовательности 5'UTR генома была установлена принадлежность штаммов ЖЕВ-15^L и ЖЕВ-15 к энтеровирусу Коксаки В6. После установления генотипа штаммов были рассчитаны праймеры на весь геном энтеровируса Коксаки В6 и проведено определение полной нуклеотидной последовательности геномной РНК штаммов ЖЕВ-15^L и ЖЕВ-15. После проведения ПЦР с использованием вирус-специфических праймеров образцы очищали с использованием набора Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System производства «Promega» (США) и секвенировали по прямой и обратной цепи ДНК. Определение нуклеотидных последовательностей проводилось на автоматическом секвенаторе ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) (США). Все последовательности были определены дважды в независимых экспериментах. Полная нуклеотидная последовательность генома штамма ЖЕВ-15^L депонирована в международной базе GenBank под номером JQ041368 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

При проведении анализа полных нуклеотидных последовательностей геномов штаммы ЖЕВ-15^L и ЖЭВ-15 типированы как энтеровирус Коксаки В6. Определенная нуклеотидная последовательность штаммов ЖЕВ-15^L и ЖЭВ-15 вируса Коксаки В6 составила 7340 нуклеотидов. По сравнению с родительским штаммом шт. ЖЕВ-15^L имеет три нуклеотидные замены: С₂₆₇₉→А, A₄₄₀₃→G и A₆₇₉₂→T; две первые из которых приводят к аминокислотным заменам - Thr→Lys (белок VP1) и Ser→Gly (белок 2С) (Таблица 2). В данной таблице также представлены выявленные отличия геномных последовательностей шт. ЖЕВ-15^L и ЖЭВ-15 от штамма Schmitt вируса Коксаки В6 (GenBank AF105342). Таким образом, идентифицированы структурные отличия генома шт. ЖЕВ-15^L от родительского штамма, приобретенные в процессе адаптации последнего к клеточным культурам НЕК293 и С33А.

При сравнении последовательности шт. ЖЕВ-15^L с полной нуклеотидной последовательностью геномной РНК штамма Schmitt вируса Коксаки В6 (Канада, 1999г., GenBank AF105342) процент гомологии составил 99% для нуклеотидной (14 нуклеотидных отличий) и 99% для аминокислотной последовательностей (8 аминокислотных отличий) (Таблица 3). Штамм ЖЕВ-15^L по сравнению со штаммом Schmitt имеет аминокислотные отличия по белку VP1: Thr₆₅₄→Lys, Ile₆₉₉→Val и Ala₇₂₇→Thr находятся в rhv-like регионе. Кроме того, в VP1 присутствует отличие Glu₅₉₄→Val. В тоже время, с другими генотипами энтеровирусов процент гомологии как по нуклеотидной, так и по аминокислотным последовательностям ниже 91% (Таблица 3).

Таблица 2

Выявленные структурные отличия геномных РНК штаммов ЖЕВ-15^L, ЖЭВ-15 и Schmitt вируса Коксаки В6

Ген Позиция
(нт.) Shmitt ЖЕВ-15 ЖЕВ-15^L нт. а.к. нт. а.к. нт. а.к. 5' UTR 218 C - T - T - VP4 777 A Gln G Arg G Arg   818 A Lys C Gln C Gln VP2 1369 A Ala G Ala G Ala VP1 2499 A Glu T Val T Val   2679 C Thr C Thr A Lys   2813 A Ile G Val G Val   2897 G Ala A Thr A Thr   3024 C Ser T Leu T Leu 2B 3757 T Tyr C Tyr C Tyr 2C 4403 A Ser A Ser G Gly 3D 6605 C Phe T Phe T Phe   6792 C Thr A Thr T Thr   6905 T Ile C Ile C Ile

Филогенетический анализ энтеровирусных штаммов по нуклеотидной последовательности полных геномов (Метод Neighbor Joining [16]) показал, что наиболее близким по нуклеотидной последовательности штаммом к представляемому штамму энтеровируса ЖЕВ-15^L является штамм Schmitt вируса Коксаки В6 (Coxsackievirus B6 strain Schmitt, GenBank AF105342, AF114384) (Фиг.3). Заявляемый штамм ЖЭВ-15^L соотвествует английской транслитерации как LEV-15^L (live enterovirus vaccine-15^L). Полноразмерная геномная последовательность штамма ЖЭВ-15^L депонирована в GenBank под наименованием LEV-15^L (JQ041368).

Таблица 3

Процент гомологии штамма ЖЕВ-15^L с другими штаммами энтеровирусов

Вирус Место выделения Год выделения % гомологии
нуклеотидов % гомологии
аминокислот Coxsackievirus B6 strain Schmitt Канада 1999 99 99 Human echovirus 27 strain Bacon США 2003 84 91 Human echovirus 11 Турция 2007 82 89 Human coxsackievirus B4 strain Tuscany Италия 2007 80 88 Human echovirus 26 strain Coronel США 2003 79 88 Human coxsackievirus B5 isolate 2000/CSF/KOR Корея 2000 79 88 Human echovirus 13 strain Del Carmen США 2003 79 88 Human echovirus 25 strain JV-4 США 2003 79 88 Echovirus type 12 strain Travis Германия 1994 79 88 Human coxsackievirus B3 strain 28 США 1994 79 88 Coxsackievirus B2 strain Ohio-1 Швеция 1999 78 88 Human echovirus 6 strain D'Amori США 2003 78 88 Human echovirus 4 strain AUS250G Австралия 2007 77 88 Human echovirus 14 strain Tow США 2003 77 88

Пример 2. Исследование литической активности штамма ЖЕВ-15 ^L вируса Коксаки В6 на панели нормальных (нетуморогенных) диплоидных и опухолевых культур клеток человека.

Было проведено исследование инфекционных (цитолитических) свойств непатогенных энтеровирусных штаммов ЖЕВ-15^L, ЖЭВ-8 (вирус Коксаки А7) и ЖЭВ-10 (вирус Коксаки В1) на панели опухолевых и нормальных клеток человека. Инфекционную (литическую) активность энтеровирусных штаммов определяли in vitro на культурах опухолевых клеток человека различной тканевой принадлежности: А549 (эпителиальная аденокарцинома легких человека), SW480 (аденокарцинома толстой кишки человека), С33А (HPV-негативная карцинома шейки матки), DU-145 (карцинома предстательной железы), HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома) и на нормальных диплоидных культурах клеток человека: ФЭЧ-15 (диплоидная культура кожно-мышечной ткани эмбриона человека), MRC-5 (диплоидная культура легких эмбриона человека). Литическую активность исследуемых штаммов для соответствующих типов клеток определяли микрометодом согласно Chanas et al. [15] на 96-луночных культуральных планшетах (Costar) и выражали через ТЦПД₅₀ (50% тканевая цитопатогенная доза). Результаты исследования представлены в Табл.4. Показано, что штамм ЖЕВ-15^L практически не инфицирует использованные нормальные диплоидные клетки человека (инфекционный титр менее 10² ТЦПД₅₀/мл) и эффективно лизирует опухолевые культуры SW480, А549, С33А, DU-145 и HepG2. Индекс селективности - отношение литической активности вируса (инфекционного титра) для использованных в исследовании опухолевых клеток к таковой для нормальных диплоидных клеток человека - варьирует от 2×10³ (для пар культур клеток А549/диплоидные) до более чем 10⁷ (для пар культур клеток С33А/диплоидные). Таким образом, энтеровирусный штамм ЖЕВ-15^L обладает выраженной способностью к селективному инфицированию и лизису опухолевых культур клеток различной тканевой принадлежности in vitro. Другие исследованные энтеровирусные штаммы ЖЭВ-8 (вирус Коксаки А7) и ЖЭВ-10 (вирус Коксаки В1) проявляют сходную инфекционную активность как в отношении диплоидных клеток, так и опухолевых культур клеток человека.

Таблица 4

Инфекционные титры штаммов энтеровирусов для различных нормальных и опухолевых культ клеток человека

Штамм Титр на культуре ФЕЧ-15 (ТЦПД₅₀/мл) Титр на культуре MRC-5 (ТЦПД₅₀/мл) Титр на культуре SW480 (ТЦПД₅₀/мл) Титр на культуреА549 (ТЦПД₅₀)/мл) Титр на культуре C-33A (ТЦПД₅₀/мл) Титр на культуре DU-145 (ТЦПД₅₀/мл) Титр на культуре HepG2 (ТЦПД₅₀/мл) ЖЭВ-8
(Коксаки А7) 2×10⁶ 5×10⁸ 4×10⁶ 10⁶ 10⁹ 4×10⁶ н.и. ЖЭВ-10 (Коксаки В1) 2×10⁴ 10⁵ 4×10⁵ 2×10⁵ 10⁷ 10⁶ н.и. ЖЕВ-15^L <10² <10² 5×10⁵ 2×10⁵ 10⁹ 5×10⁷ 5×10⁸

Примечание: н.и. - не исследовали.

Источники информации

1. Ворошилова М.К. Живые энтеровирусные вакцины. Материалы 13 Всесоюзного съезда эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов. Тбилиси. 1970, с.355.

2. Винтовкина И.С., Алиев А.А., Мильнер Б.И. и др. Опыт использования феномена интерференции для сонации кишечника детей от патогенных энтеровирусов. - Энтеровирусные инфекции. МБ ИПВЭ АМН СССР. 1970, с.54-58.

3. Галко Н.В. Итоги изучения живой энтеровирусной вакцины ЖЭВ-4 в опытах иммунизации детей. - Энтеровирусные инфекции. Л., 1971, с. 194-202.

4. Швецкая Б.Д., Носатенко А.И., Грунтовская Л.Г. и др. Иммунологические сдвиги у привитых живой энтеровирусной вакциной ЖЭВ6 и контактировавших с ними детей. - Этеровирусные инфекции. М., 1970, с. 32-35.

5. Ворошилова М.К., Королева Г.А., Тольская Н.А. и др. Основные результаты исследований проведенных в лаборатории энтеровирусов ИПВЭ АМН СССР - Труды ИПВЭ АМН СССР, М., 1973, т.21, вып.2, с.7-18.

6. Чумаков М.П., Ворошилова М.К., Бойко В.М. и др. К итогам широких контролируемых испытаний эпидемиологической эффективности живых энтеровирусных вакцин для экстренной профилактики гриппа и вирусных ОРЗ. Труды ИПВЭ АМН СССР. 1973, т.21, вып.2, с.19-28.

7. Тамм О.М., Куслат Т.Р., Кутсар К.К. Применение живой полиомиелитной вакцины и циркуляции энтеровирусов в Эстонской ССР в 1965-1970 гг. Журн. микробиол., 1973, № 7, с. 76-81.

8. Au G., Lindberg A., Barry R., Shafren D. Oncolysis of vascular malignant human melanoma tumors by Coxsackievirus A21. Int. J. Oncol. 2005, 26, 1471-1476.

9. Shafren D., Au G., Nguyen T., Newcombe N., Haley E., Beaghey L., Barry R. Systemic therapy of malignant human melanoma tumors by a common cold-producing enterovirus, coxsackievirus A21. Clin. Cancer Res., 2004, 10, 53-60.

10. Shafren D., Sylvester D., Johansson E., Campbell J., Barry R. Oncolysis of human ovarian cancers by echovirus type 1, Int. J. Cancer, 2005, 115, 320-328.

11. Pan J., Narayanan B., Shah S., Yoder J., Cifuente J., Hafenstein S., and Bergelson J. Single amino acid changes in the virus capsid permit Coxsackievirus B3 to bind decay-accelerating factor. J.of Virol., 2011, 85 (14), p. 7436-7443.

12. Reagan K. J., Goldberg B., and Crowell R. L. 1984. Altered receptor specificity of coxsackievirus B3 after growth in rhabdomyosarcoma cells.J. Virol. 49:635-640.

13. Berry L., Gough G., Barry R., and Shafren D. Potent oncolytic activity of human enteroviruses against human prostate cancer. The prostate, 2008, 68, 577-587.

14. Kelly E., Hadac E., Greiner S., Russell S. Engineering microRNA responsiveness to decrease virus pathogenicity. Nat Med. 2008; 14:1278-83.

15. Chanas A., Johnson B., Simpson D. et al. Antigenic relationships of alphaviruses by a simple microculture cross-neutralization method. J. of Gen. Virol., 1976, Vol. 32, p.295-300.

16. Saiton N. and Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 1987, 4, 406-425.

Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса Коксаки В6. Описанный штамм получен посредством проведения серии адаптационных пассажей родительского штамма вируса ЖЭВ-15 Коксаки В6 на высокочувствительной к данному вирусу культуре клеток НЕК293 и неопластической клеточной линии С33А (HPV-негативная карцинома шейки матки человека), с получением нового штамма ЖЭВ-15^L вируса Коксаки В6. Штамм селективно инфицирует и лизирует опухолевые клетки человека и имеет фрагмент геномной последовательности, представленной на фиг. 2, являющийся его маркерными признаком. Штамм был депонирован в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») под регистрационным номером V-576. Предлагаемое изобретение обеспечивает возможность перспективной разработки на его основе вирусного онколитического препарата для терапии злокачественных новообразований человека и определения полной нуклеотидной последовательности его генома и может быть использовано в медицинской вирусологии, биотехнологии и микробиологии. 3 ил., 4 табл, 2 пр.

Штамм энтеровируса Коксаки В6, селективно инфицирующий и лизирующий опухолевые клетки человека in vitro и депонированный в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером V-576.