Штамм перевиваемых клеток @ -2- @ ,используемый для вирусологических исследований Советский патент 1984 года по МПК C12N5/00 

N9 1C

Од ;О ОО

1

Изобретение относится к медицине кой вирусологии и представляет собой клоповый вариант кдеток эпидермоидной карциномы гортани человека.

Известен штамм перевиваеьаск клеток Нер-2, происходящий от клеток эпидермоидной карциномы гортани человека l .

Однако этот штамм в силу того, что его культивировали в различных лабораториях при различных реткимах и в различных по составу питательных средахj стал нестабильным по культуральной, мор4юлогической и цитогенетической характеристикам и чувствительности к вирусам.

Целью изобретения является штамм перевиваемых клеток Нер-2 обладающий стабильностью своих культуральных, морфологических и цитогенетических характеристик и определенным спектром чувствительности к вирусам.

Эта цепь достигается с использованием штамма НЕр-2-КД, представлякицего собой клоновый вариант клеток эпидермоидной карциномы гортани человека.

Штамм НЕр-2-КД получен путем многократного клонирования линии клеток эпидермоидной карциномы гортани человека по Паку и последующего двукратного клонирования по У Миню в модификации Угрюмова, хранится в коллекции клеточных культур Свердловского НИИБИ под № 5983.

Морфологические признаки. Культура клеток НЕр--2-КД представлена крупными полигональньми клетками с округлым ядром, содержащим 2-А ядрьпвка. Популяция характеризуется однородностью своих составлякипрх: число клеток с ядрами неправильной формы не превышает 8-tO% и не более 10% клеток имеют аномальные формы митотическоГо аппарата. Кариотипическая характеристика клеток НЕр-2-КД вьфажается в вариациях числа хромосом в клетках в пределах 54-68, при этом более 45% клеток составляют модальный класс с 61-65 хромосомами.

Физиологические признаки. Клетки НЕр-2-КД снимают со стекла 0,02%-ным раствором Версена щадящим способом, без центрифугирования, ресуспензируют и рассеивают в матрасы в дозе 30-50 тыс./мл или в пробирки в дозе 100-120 тыс./мл. Пересевы

226932

осуществляют через 6-7 сут роста.

Среда роста состоит из смеси равных объемов среды 199 и среды Игла с добавлением 10% нативной, отконтролированной в отношении микоплазм сыворотки крупного рогатого скота. В среду роста добавляют антибиотики: пенициллин ТОО ед/мл, стрептомицин 50 ед/мп, рН среда роста в пределах 10 7.2-7,4.

Клоновая линия НЕр-2-Щ характеризуется выраженной стабильной чурствительностью к вирусам: аденовирусы до 6,5 ед Т1Щ50/ д, респираторно-синцитиальный (штамм Long) до 6,0 If Т1Щ5а/МА ECHO до 5,0 Ig ТВДедМ, полиовирусы (1,2, 3 типы) до 7,5 Ig

ТВД50|«АИ р И м е р 1. Использование

клоновой линии перевиваемых клеток НЕр-2-1ОД как производственной культуры в работе с знтеровирусами.

В процессе разработки эритроцктарного группоследафического диагностИкума Коксаки В был испытан ряд раэличных клеточных культур, в частности НЕр-2-КД, RH, Vero, ПЗМ и MK-2j с целью выбора оптимальной для дальнейшего ее использования в качестве производственной культуры.

Опыты показали, что в отличие от культур ПЗМ, МК-2 и Vero (почки обезьян) клеточные культуры НЕр-2-КД и RH позволяют получать вирусные

антигены с высокой не только инфекционной, но и сенсибилизирукэдей активностью. Однако в отличие от культуры RH клоновая линия НЕр-2-КД имеет преимущества: стабильность

культуральных и морфологических признаков в длительного времени, неприхотливость к используемш4 питательным средам и вследствие этого- большую доступность для использования, а также более вщ аженную чувствительность к вирусам Коксаки В.

В табл. 1 дана характеристика инфекционной и сенсибилизирующей активности антигенов вирусов Коксаки В,

полученных в культуре НЕр-2-КД по данным многократных (до 14 повторностей) опытов.

В настоящее время клоновая ттния перевиваемых клеток НЕр-2-КД используется для получения экспериментально-производственных серий эритроцитарного группоспецифического диагностикума Коксаки В. Учитьшая доступность и высокую чувствительность клеток НЕр-2-КД к вирусам энтеральной группы, в час ности к вирусам полиомиелита 1,2 и 3 типов и к вирусам Коксаки труппы В, эта культура является незаменимой при получении антигенов для иммунизаи от кроликов и крыс с целью получения спедаф1ческих иммунных сывороток. В течение 1982-83 гг. было использовано более 6ОО голов лабораторных жиротных, что позволило подучить несколько литров иммуиной сывр.ротки, используемой для раз личные экспериментальных целей. Кро ме того, эта культура постоянно используется для индикащся и идентификаций вирусов, выделенных из материалов от больных вирусньпда заболеваниями. П р им ер 2. Использование кленовой линии перевиваемых клеток НЕр-2-КД для диагностики вйрусньи инфекций. В практическом здравоохранении при постановке клинического диагноза полиомиелит, полио елитоподобное заболевание, энтеровирусная инфекция, спннальная форма, спинальный парез неясной этиологии и других, возни сает необходимость проведения-вирусологического обследования больных в сопоставдешш с данными серологического обследования . С использованием Клеток НБр-2-КД в лаборатории энтеровирусных инфекций СШШВИ было обследовано более 1100 больных с указанньдфн диаг1мозами. Серологический диагноз полирвирусной инфекции был подтверж ден у 8,5-26% по разньм группам обследования. Выделяемость знтеровирусов по зтим группам составляла 3,2-26%. Использование кленовой линии клеток НЕр-2-КД при обследовании здоровых детей позволяет определять уровень напряженности иммунитета у привитых. П р я м е р 3. Культура Нер-2 устойчива к длительному анабиотичес кому состоянию при субоптимальных температурах в процессе транспортировки на дальнее расстояние. В качестве примера приведена карта оцен ки культуры НЕр-2-КД, отправленной в монослое в герметично закрытых флаконах из СНИИВИ в Калининградску облСЭС. Длительность транспортировки 7 дн, температура внешней среды в момент отправления клеток в г. Свердловске - 7 С, при получении в г. Калининграде 1 С, после транспортировки в биологически активном состоянии на стекле сохранилось 43,7% клеток. При посеве в первом пассаже 2 млн. клеток в 50 мл среды монослой был сформирован на 6-й день, на третьем пассаже клетки более активно делились я монослой сформировался на. третьи сутки. После третьего пассажа клетки были использованы в плановой работе, на них были воделены вирусы полио 1, 2, 3, Коксаки ВЗ, В5, ECHO, А, 6, 9. При длительности транспортировки до 5 сут при температуре воздуха не ниже -10 С на стекле сохраняется до 80-90% клеток и они используются в работе с 2-3 пассажа. На клетках НЕр-2-КД была выявлена более широкая вццеляемость энтеровирусов в сравнении с первичной тканью фибробластов эмбрионов человека. В табл. 2 представлены сравнительные данные по вьщеляемости энтерови-- русов на двух клеточных культурах. Пример 4. Использование клоновой линии перевиваемых клеток НЕр-2-КД для приготовления эритроцитарного диагностикума PC-вируса. Для культивирования PC-вирусов ненеобходимо использовать такую клеточную культуру, которая была бы чувствительной, обеспечивала накопление вируса в инфекционном титре не ниже 4-6 Ig ТЦД5д1 дИ отличалась стабильностью своих культурайьных и opфcлoгичecкиx свойств. В опытах бьти использованы перевиваемые клеточные культуры НЕр-2, HeLa, Д-6 и первично-трипсинизированные ФЭЧ и ПЭЧ человеческого происхозкдения, а также перевиваемые клетки животного происхождения ПМС, СПЭВ и ПЭБ. Вирус адаптировали к каждому клеточному штамму в ряду последовательных пассажей и определяли его инфекционную активность. Наиболее чувствительной к изучаемому штамму вируса оказалась перевиваемая культура НЕр-2-КД, титр вируса на которой достигает 6 ед. с образованием характерных симпластов.

Штамм перевивае вдс клеток НЕр-21Щ № 5983 (коллекция клеточных культур Свердловского научно-исследовательского института вирусных инфекций), используемый для вирусо.логических исследований..