Питательная среда для накопления парагемолитических вибрионов при постановке теста Канагава Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/04 

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно, является питательной средой, которая может быть использована в лабораторной практике для культивирования (накопления) парагемолитических вибрионов (ПГВ) с целью последующего определения вирулентных свойств вибрионов в тесте Канагава при диагностике пищевых токсикоинфекций, раневых инфекций и септицимий бактериальной природы. Питательная среда содержит питательную основу, состоящую из ферментативного перевара мяса, маннита, натрия хлорида, натрия карбоната и дистиллированной воды при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет стандартизовать подготовку штаммов ПГВ к постановке теста Канагава, что в свою очередь способствует повышению эффективности данного теста по определению вирулентности ПГВ в ходе лабораторной диагностики вызываемых ими заболеваний.

При постановке теста Канагава предусматривается использование для подращивания культуры парагемолитических вибрионов (ПГВ) мясопептонного бульона (МПБ) с 1,5% натрия хлорида. Однако данная среда предназначена для накопления широкого круга энтеробактерий, включая сальмонеллы, шигеллы, вибрионы и т.д. Качественные характеристики этой среды стандартизованы по МУК 3.3.2.2124-06 «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза» и МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» и не предусматривают определение показателей, влияющих на эффективностьданной среды при постановке теста Канагава. При этом известно, что состав среды подращивания вибрионов оказывает существенное влияние на синтез гемолизина ПГВ на агаре Вагатцума. Оптимальным является идентичный или близкий по содержанию состав питательной основы среды накопления и агара Вагатцума, что обеспечивает оптимальный метаболизм вибрионов при постановке теста. В настоящее время такие условия не обеспечиваются. В связи с данными обстоятельствами актуальным является создание унифицированной питательной среды культивирования парагемолитических вибрионов, близкой по составу запатентованной авторами ранее питательной среды для определения гемолитической активности парагемолитических вибрионов - ПГВ. Создание среды накопления, идентичной составу агару Вагатцума, ограничено специфичностью импортных составляющих.

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и является накопительной питательной средой, которая может быть использована в лабораторной практике для диагностики вибриозов, вызванных ПГВ.

Известна питательная среда для дифференциации ПГВ следующего состава: ферментативный перевар мяса, агар микробиологический, стимулятор роста гемофильных микробов, глюкоза, манит, натрия хлорид,натрия карбонат, калия гидрофосфат, метиловый фиолетовый, эритроциты отмытые [1].

Недостатком известной среды является невозможность ее использования для накопления культуры и последующей постановки теста Канагава вследствие агаризованного исполнения.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является мясопептонный бульон с 1,5% натрия хлорида, рекомендованный МУК [2] для накопления вибрионов при постановке теста Канагава(прототип) [3], и состоящий из (г/л):

Мясная вода 1000,0 Пептон ферментативный 20,0 Натрия хлорид 15,0 рН 8,0±0,2

Недостатком прототипа является использование нестандартного жидкого компонента лабораторного приготовления - мясной воды, различия в составе прототипа и сред для постановки теста Канагава (среда Вагатцума - агар для теста Канагава, среда СГВ - питательная среда для определения гемолитической активности парагемолитических вибрионов), что приводит к необходимости перестройки метаболизма испытуемых штаммов при переходе с жидкой накопительной среды на плотную.

При этом данная среда является средой культивирования для различных видов микроорганизмов бактериальной природы. Ее качественная оценка по существующим ныне требованиям не предусматривает оценку возможности ее применения для характеристики ПГВ с различной гемолитической активностью. Притом, что ряд штаммов этого вида отличаются низким уровнем ростовых свойств и не обеспечивают должной концентрации бакмассы ПГВ через 12 ч культивирования [4, 5]. Доказано также, что состав среды накопления оказывает значительное влияние на синтез гемолизина [6].

Таким образом, MПБ (мясопептонный бульон) не может быть в полной мере использован для подращивания ПГВ в тесте Канагава. В связи с необходимостью стандартизации и унификации бактериологических исследований на наличие ПГВ, повышения эффективности теста Канагава и использования препаратов отечественного производства можно считать несомненной потребность в новой питательной среде накопления [7].

Технической задачей предполагаемого изобретения является создание новой накопительной питательной среды (СПВ) для подращивания ПГВ при определении их вирулентности в тесте Канагава.

Поставленная задача достигается тем, что из известной питательной среды прототипа исключают жидкую основу - мясную воду и пептон ферментативный, добавляют более стандартный и питательный сухой ферментативный перевар мяса, для активизации гемолитической активности вносят маннит, а для создания оптимальной осмотичности всех видов ПГВ увеличивают навеску натрия хлорида до 30 г/л, при следующих количественных соотношениях компонентов (г/л):

1. Ферментативный перевар мяса, сухой (ГМФ - основа) - 20,0±2,0;

2. Маннит-3,0±0,5;

3. Натрия хлорид - 30,0±2,0;

4. Натрия карбонат - 1,5±0,2 рН8,0±0,2.

Способ приготовления питательной среды осуществляется по следующей технологии. Питательная среда формируется из компонентов отечественного производства: ферментативный перевар мяса (ГМФ-основа, ГМФ-бульон) по ТУ 9385-059-39484474-2009 производства ООО НИЦФ г. Санкт-Петербург, маннит по ГОСТу 8321 -74 производства АО «Биохимик» г. Саранск, натрия хлорид по ГОСТу 4233-77, натрия карбонат по ГОСТу 32802-2014 производства АО «Уралхим» г. Кирово-Чепецк. Данные реактивы заливают 1000,0 мл воды дистиллированной и растворяют при нагревании. Полученный раствор стерилизуют текучим паром. Перед употреблением раствор стерильно разливают по 10,0 мл в стерильные флаконы на 100 мл с коническим скатом, рН готовой среды 8,0±0,2.

Методические указания МУК 4.2.2046.06 предусматривают необходимость получения суточной культуры ПГВ при оценке патогенных парагемолитических вибрионов с различным уровнем гемолитической активности [2].

Чувствительность искомой среды в отношении 5-ти тест-штаммов ПГВ составляла 10^-7, показатель эффективности повышался до 30-70%. Эффективность получения результатов теста Канагава в отношении всехвидов патогенных ПГВ с различным уровнем вирулентности была высокой и стабильной.

Таким образом, состав среды СПВ (г/л):

1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - основа) - 20,0±2,0;

2. Маннит-3,0±0,5;

3. Натрия хлорид - 30,0±2,0;

4. Натрия карбонат - 1,5±0,2 рН8,0±0,2.

Контроль среды проводят в соответствии с Методическими указаниями [8, 9] с использованием тест - штаммов V. parahaemolyticus с различным уровнем вирулентности, по основным биологическим показателям для этой группы питательных сред - чувствительность, показатель эффективности -дифференцирующие свойства (размер зоны гемолиза в тесте Канагава). В качестве среды для определения гемолитической активности использована специально разработанная для этих целей среда СГВ [1].

Ниже представлены результаты сравнительных испытаний различных комбинаций состава среды СПВ как в рамках нормированных показателей, так и за их пределами (примеры 1-5, таблицы 1-5). Также даны результаты проверки дифференцирующих свойств среды СГВ и сред сравнения в отношении представителей всех основных видов патогенных ПГВ.

Пример 1

Для приготовления среды используют нижеперечисленные препараты в следующих максимальных концентрациях (г/л):

1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - основа) - 22,0;

2. Маннит-4,0;

3. Натрия хлорид - 32,0;

4. Натрия карбонат - 1,7 рН8,0±0,2.

Данные реагенты заливают 1000,0 мл дистиллированной воды и доводят до кипения при тщательном перемешивании, стерилизуют текучим паром. Реакция среды 8,2. Готовую среду разливают по 10 мл в стеклянные флаконы на 100 мл с коническим скатом. Для посева используют каплю стандартизованной суточной культуры ПГВ извзвеси 10⁹ м.к./мл объемом 10 мкл (табл.1).

Таким образом, предлагаемая среда обеспечивает более высокую в сравнении с прототипом ростовую активность тест-штаммов при требуемом размере зон гемолиза на СГВ при последующей постановке теста Канагава на агаризованной среде и образование зон лизиса равных или более 3 мм вокруг колоний Канагав-положительных ПГВ и более низких размерах зон лизиса для слабо вирулентных штаммов. Чувствительность среды-прототипа в отношении указанных штаммов была на порядок ниже - 10^-6 вместо 10^-7.

Пример 2

Для приготовления среды используют вышеуказанные препараты в концентрациях превышающих максимальные (г/л):

1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - основа) - 24,0;

2. Маннит-6,2;

3. Натрия хлорид - 34,0;

4. Натрия карбонат - 1,8;

рН 8,0±0,2.

Данные реагенты заливают 1000,0 мл дистиллированной воды и доводят до кипения при тщательном перемешивании, стерилизуют текучим паром. Реакция среды 8,2. Готовую среду разливают по 10 мл в стеклянные флаконы на 100 мл с коническим скатом (табл.2).

Вывод: предлагаемая среда в данной рецептуре не обеспечивает требуемые показатели качества - по чувствительности в отношении ряда штаммов и снижении активности при последующей постановки теста Канагава.

Пример 3

Для приготовления среды используют вышеуказанные препараты в следующих минимальных концентрациях (г/л):

1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - основа) - 18,0;

2. Маннит-2,5;

3. Натрия хлорид - 28,0;

4. Натрия карбонат - 1,3;

рН 8,0±0,2.

Данные реагенты заливают 1000,0 мл дистиллированной воды и доводят до кипения при тщательном перемешивании, стерилизуют текучим паром. Реакция среды 8,2. Готовую среду разливают по 10 мл в стеклянные флаконы на 100 мл с коническим скатом (табл.3).

Следовательно, предлагаемая среда обеспечивает более высокую в сравнении с прототипом ростовую активность штаммов ПГВ при требуемом размере зон гемолиза вокруг колоний ПГВ при последующей постановке теста Канагава и обязательном наличии роста на чашках при высеве всех контрольных штаммов ПГВ из 100 м.к. (10^-7), образование зон лизиса равных или более 3 мм вокруг колоний Канагава-положительных ПГВ при более низких зонах лизиса для слабо вирулентных штаммов. Чувствительность среды-прототипа в отношении указанных штаммов была на порядок ниже.

Пример 4

Для приготовления среды используют нижеперечисленные препараты в следующих концентрациях, ниже минимальных (г/л):

1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - основа) - 17,0;

2. Маннит-2,0;

3. Натрия хлорид - 26,0;

4. Натрия карбонат - 1,2;

рН 8,0±0,2.

Данные реагенты заливают 1000,0 мл дистиллированной воды и доводят до кипения при тщательном перемешивании, стерилизуют текучим паром. Реакция среды 8,2. Готовую среду разливают по 10 мл в стеклянные флаконы на 100 мл с коническим скатом (табл.4).

Таким образом, предлагаемая среда в данной рецептуре не обеспечивает требуемые показатели качества - по чувствительности в отношении ряда штаммов и снижении активности в тесте Канагава.

Пример 5

Для приготовления среды используют нижеперечисленные препараты в следующих средних концентрациях (г/л):

1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - основа) - 20, 0;

2. Маннит-3,0;

3. Натрия хлорид - 30,0;

4. Натрия карбонат-1,5;

рН 8,0±0,2.

Данные реагенты заливают 1000,0 мл дистиллированной воды и доводят до кипения при тщательном перемешивании, стерилизуют текучим паром. Реакция среды 8,2. Готовую среду разливают по 10 мл в стеклянные флаконы на 100 мл с коническим скатом. Для посева используют каплю стандартизованной суточной культуры ПГВ из взвеси 10⁹м.к./мл объемом 10 мкл (табл.5).

Таким образом, предлагаемая среда обеспечивает более высокую в сравнении с прототипом ростовую активность контрольных штаммов при требуемом размере зон гемолиза вокруг колоний Канагава-положительных штаммов ПГВ и отсутствие зоны лизиса вокруг Канагава-отрицательного штамма. Исходя из представленных материалов авторы констатируют, что по результатам сравнительных испытаний искомая среда СПВ превышает среду-прототип - мясо-пептонный бульон с 1,5% натрия хлорида по ростовым показателям и обеспечивает выход биомассы штаммов ПГВ, адаптированной для последующей постановки теста Канагава.

Полученные данные позволяют характеризовать новый препарат как накопительную среду, соответствующую современным требованиям к средам данного назначения. Особым преимуществом данного препарата можно считать ее эффективность при определении гемолитической активности в отношении ПГВ с пониженным уровнем вирулентности, что позволяет использовать ее при диагностике различных вибриозов, вызываемых ПГВ. Дополнительным преимуществом можно считать возможность ее изготовления из отечественных компонентов, и за счет этого низкую себестоимость (250-300 руб/л).

Источники информации

1. Патент на изобретения №2711914 от 23.01.2020. «Питательная среда для дифференциации парагемолитических вибрионов».

2. Методы выявления и определения парагемолитических вибрионов в рыбе, не рыбных объектах промысла, продуктах вырабатываемых из них, в воде поверхностных водоемов и других объектах. МУК 4.2.2046-06, М., - 2006.

3. ГОСТ 10444.1-84 Межгосударственный стандарт. КОНСЕРВЫ. Приготовление растворов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе. М. Стандартинформ. -2010.-С. 210-228

4. Honda, Т. Purification and Characterization of a Hemolysin Produced by a Clinical Isolate of Kanagawa Phenomenon - Negative Vibrio parahaemolyticus and Related to the Thermostable Direct Hemolysin / T. Honda, Y. Ni, T. Miwatani // Infect. Immun. - 1988. - Vol. 56, №4. - P. 961 -965.

5. Nakaguchi, Y. The urease gene cluster of Vibrio parahaemolyticus does not influence the expression of the Thermostable Direct Hemolysin Gene / Y. Nakaguchi, J. Okuda, T. Iida, M. Nishibuchi et al. // Micribiol. Immunol. - 2003. - Vol. 47, №3. - P. 233 - 239.

6. Полеева, MB. Совершенствование методических подходов для идентификации штаммов Vibrioparahaemolyticus / М.В. Полеева Лвторефдиссерт.иасоиск. уч. степ.канд. биол. наук // г. Ростов-на-Дону. 2021.

7. Приказ Министерства здравоохранения РФ от 18 мая 2021 г. N 464п "Об утверждении Правил проведения лабораторных исследований" (с изменениями и дополнениями).

8. Методы контроля бактериологических питательных сред МУК 4.2.2316-08, М.,- 2008.

9. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза МУ 3.3.2.2124-06. М., - 2007.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Изобретение представляет собой питательную среду, которая может быть использована для накопления парагемолитических вибрионов (ПГВ) с целью последующего определения вирулентных свойств вибрионов в тесте Канагава. Из известной питательной среды прототипа исключается жидкая основа, добавляют более питательный сухой ферментативный перевар мяса, маннит, увеличивают навеску натрия хлорида до 30 г/л, при следующих количественных соотношениях компонентов: гидролизат говяжьего мяса ферментированный (ГМФ) - 20,0±2,0 г/л, маннит - 3,0±0,5 г/л, натрия хлорид - 30,0±2,0 г/л, натрия карбонат - 1,5±0,2 г/л, при рН 8,0±0,2 с последующим растворением в 1000,0 мл дистиллированной воды. Изобретение обеспечивает более высокую в сравнении с прототипом ростовую активность контрольных штаммов при требуемом размере зон гемолиза вокруг колоний Канагава-положительных штаммов ПГВ и отсутствие зоны лизиса вокруг Канагава-отрицательного штамма. 5 табл., 5 пр.

Питательная среда для накопления парагемолитических вибрионов (ПГВ), адаптированная для эффективной постановки теста Канагава, отличающаяся тем, что с целью повышения выхода биомассы ПГВ содержит ферментативный гидролизат мяса, маннит, натрия хлорид и натрия карбонат в следующих количественных соотношениях компонентов, г/л воды:

1. Гидролизат говяжьего мяса ферментированный (ГМФ) - 20±0,2;

2. Маннит - 3,0±0,5;

3. Натрия хлорид - 30,0±2,0;

4. Натрия карбонат - 1,5±0,2,

при рН 8,0±0,2 с последующим растворением в 1000,0 мл дистиллированной воды.