Питательная среда для дифференциации парагемолитических вибрионов Российский патент 2022 года по МПК C12Q1/04 

Предполагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно является питательной средой, которая может быть использована в лабораторной практике для определения патогенных свойств вибрионов в тесте Канагава при диагностике пищевых токсикоинфекций, раневых инфекций и септицимий бактериальной природы.

В тесте Канагава используют среду Вагатцума, которая предназначалась только для определения патогенности V. parahaemolyticus. В настоящее время существует более 11 патогенных видов парагемолитических вибрионов (ПГВ), из которых только часть может быть тестирована на среде Вагатцума. В связи с этим возникла необходимость в создании унифицированной питательной среды для всех видов патогенных ПГВ при использовании в тестировании на наличие гемолитического токсина в тесте Канагава.

Известна питательная среда для выделения и идентификации ПГВ (1) следующего состава: пептон, агар микробиологический, сахароза, бромтимоловый синий с добавлением калия карбоната, калия сульфита, желчи КРС, экстракта дрожжевого сухого и смеси алкилсульфатов, а в качестве идентифицирующей добавки используют натрий хлорид.

Недостатком известной среды является невозможность ее использования для дифференциации среды в тесте Канагава

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде для определения патогенности парагемолитических вибрионов в тесте Канагава является среда Вагатцума (2) состоящая из:

Пептон ферментативный 10,0 г Натрия хлорид 70,0 г Маннит 10,0 г Калия гидрофосфат 5,0 г Дрожжевой экстракт 3,0 г Кристаллический фиолетовы 0,001 г Агар микробиологический 15,0 г Эритроциты отмытые 20,0

рН 8,0.

Однако данная среда является импортным препаратом. При этом высокое содержание натрия хлорид - 7% ограничивает прорастание в данной среде ряда патогенных вибрионов -V. mimicus,V. damsela,V. hollisae, V. vulnificus, V. harveyi. Наличие в среде маннита в качестве углеводного компонента ухудшает условия культивирования V. damsela, V. hollisae, V. vulnificus, V. harveyi.

Таким образом, среда Вагатцума не может быть в полной мере использована для идентификации патогенных свойств всей группы ПГВ. В связи с необходимостью стандартизации и унификации бактериологических исследований материала на наличие инфекционных патогенов, повышения эффективности среды и использования отечественных препаратов появилась потребность в новой питательной среде.

Недостатком среды является ее высокая себестоимость, невозможность использования для всех видов патогенных ПГВ - V. parahaemolyticus, V. alginolyticus и в первую очередь - V. damsela, V. vulnificus, V. harveyi, V. hollisae.

Технической задачей предполагаемого изобретения является создание новой дифференциальной питательной среды СГВ для определения патогенности ПГВ путем усиления гемолитической активности в тесте Канагава.

Поставленная задача достигается тем, что в известной питательной среде для дифференциации парагемолитических вибрионов, включающей питательную основу из пептона, агара микробиологического, натрия хлорид, маннит, калий гидрофосфат, эритроциты, отличие заключается в том, что среда дополнительно включает стимулятор роста гемофильных микробов, глюкозу, натрия карбонат, метиленовый фиолетовый, а питательная основа представляет собой ферментативный перевар мяса при следующих количественных соотношениях компонентов, г/л:

Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 20,0±2,0

Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 5,0±0,5

Агар микробиологический - 15,0±2,0

Глюкоза 5,0±1,0 Маннит 5,0±1,0 Натрия хлорид 50,0±2,0 Натрия карбонат 1,5±0,2 Калия гидрофосфат 5,0±0,5 Метиленовый фиолетовый 0,002±0,0005 Эритроциты отмытые 50±1,0

при рН 8,0.

Способ приготовления питательной среды осуществляют по следующей технологии.

Питательная среда компануется из реагентов отечественного производства: ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - производитель ООО НИЦФ г. Санкт-Петербург;

стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - СРГМ ФБУН ГНЦ ПМБ П. Оболенск, Московская обл. и т.д.

Вышеуказанные реагенты заливают 950 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, расплавляют при тщательном перемешивании, стерилизуют, охлаждают до 45-50°С, вносят эритроциты. Реакция среды 8,0. Готовую среду разливают в чашки Петри.

Методические указания МУК 4.2.2046.06 предусматривают необходимость анализа всех видов патогенных парагемолитических вибрионов -V. parahaemolyticus, V. mimicus, V. hollisae, V. damsela, V. vulnificus, V. harveyi, V.metscnicovii, V. cincinnatiensis, V. fluvialis, V. furnissii, V. alginolyticus (3).

Решение задачи достигают тем, что к известной прописи среды - прототипа содержащий агар, маннит, калия гидрофосфат, добавляют более питательный ферментативный перевар мяса, для активизации гемолитической активности - стимулятор роста гемофильных микробов, глюкозу и менее токсичный ингибитор метиловый фиолетовый, а так же для оптимизации роста всех видов ПГВ - снижают навеску натрия хлорида до 50 г/л. После варки, стерилизации среды, охлаждения до 45-50% вносят 5% отмытых эритроцитов крови человека.

Чувствительность искомой среды в отношении 4 тест-штаммов ПГВ составляла 10^-7, показатель прорастания повышался до 30-70%. При этом показатель прорастания этой среды для всех видов патогенных ПГВ составляли от 35 до 80%. Эффективность получения результатов теста Канагава в отношении всех видов патогенных ПГВ бала высокой и стабильной.

Таким образом, состав среды СГВ:

1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 20,0±2,0,

2. Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 5,0±0,5,

3. Агар микробиологический - 15,0±2,0,

4. Глюкоза - 5,0±1,0,

5. Маннит - 5,0±1,0,

6. Натрия хлорид - 50,0±2,0,

7. Натрия карбонат - 1,5±0,2,

8. Калия гидрофосфат - 5,0±0,5,

9. Метиловый фиолетовый - 0,002±0,0005,

10. Эритроциты отмытые - 50±1,

при рН 8,0.

Контроль среды проводят в соответствии с Методическими указаниями (3, 4) с использованием тест-штаммов: V. parahaemolyticus, а так же V. mimicus,V. damsel,V. vulnificus по основным биологическим показателям для этой группы питательных сред - чувствительность, показатель прорастания, дифференцирующие свойства - размер зоны гемолиза в тесте Канагава.

Питательная среда состоит из сухих компонентов и после регистрации будет выпускаться в виде сухого препарата-изделия медицинского назначения с последующим освоением производства.

Ниже представлены результаты сравнительных испытаний различных комбинаций состава предлагаемой среды (СГВ) как в рамках нормированных показателей, так и за их пределами (примеры 1-5, таблицы 1-5). Также даны результаты проверки дифференцирующих свойств среды СГВ и сред сравнения в отношении представителей всех основных видов патогенных ПГВ.

Пример 1

Для приготовления среды используют вышеуказанные препараты в следующих максимальных концентрациях (г):

1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 22,0,

2. Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 5,5,

3. Агар микробиологический - 17,0,

4. Глюкоза - 6,0,

5. Маннит - 6,0,

6. Натрия хлорид - 52,0,

7. Натрия карбонат - 1,7,

8. Калия гидрофосфат - 5,5,

9. Метиловый фиолетовый - 0,0025,

10. Эритроциты отмытые – 51,

пПри рН 8,2

Данные реагенты заливают 950 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, расплавляют при тщательном перемешивании, стерилизуют, охлаждают до (45-50)°С вносят эритроциты. Реакция среды 8,2. Готовую среду разливают в чашки Петри.

Таким образом, предлагаемая среда обеспечивает более высокую в сравнении с прототипом ростовую активность тест-штаммов при требуемом уровне дифференцирующих свойств вибрионов (обязательное наличие роста на чашках при посеве всех тест-штаммов ПГВ - из 10 м.к. и не менее 30% при посеве 100 м.к., образование зон лизиса вокруг колоний Канагава - положительных ПГВ и отсутствие зон лизиса вокруг Канагава - отрицательного штамма).

Пример 2

Для приготовления среды используют вышеуказанные препараты в средних концентрациях (г):

1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 20,0,

2. Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 5,0,

3. Агар микробиологический - 15,0,

4. Глюкоза - 5,0,

5. Маннит - 5,0,

6. Натрия хлорид - 50,0,

7. Натрия карбонат - 1,5,

8. Калия гидрофосфат - 5,0,

9. Метиловый фиолетовый - 0,002,

10. Эритроциты отмытые – 50,

при рН 8,2.

Данные реагенты заливают 950 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, расплавляют при тщательном перемешивании, стерилизуют, охлаждают до 45-50°С вносят эритроциты. Реакция среды 8,2. Готовую среду разливают в чашки Петри.

Вывод: предлагаемая среда обеспечивает более высокую в сравнении с прототипом ростовую активность тест-штаммов при требуемом уровне дифференцирующих свойств вибрионов (обязательное наличие роста на чашках при посеве всех тест-штаммов ПГВ - из 10 м.к. и не менее 30% при посеве 100 м.к., образование зон лизиса вокруг колоний Канагава - положительных ПГВ и отсутствие зон лизиса вокруг Канагава - отрицательного штамма). Пример 3

Для приготовления среды используют вышеуказанные препараты в минимальных концентрациях (г):

1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 18,0,

2. Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 4,5,

3. Агар микробиологический - 13,0,

4. Глюкоза - 4,0,

5. Маннит - 4,0,

6. Натрия хлорид - 48,0,

7. Натрия карбонат - 1,3,

8. Калия гидрофосфат - 4,5,

9. Метиловый фиолетовый - 0,0015,

10. Эритроциты отмытые - 49,

при рН 8,0.

Данные реагенты заливают 950 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, расплавляют при тщательном перемешивании, стерилизуют, охлаждают до 45-50°С вносят эритроциты. Реакция среды 8,0. Готовую среду разливают в чашки Петри.

Следовательно, предлагаемая среда обеспечивает более высокую в сравнении с прототипом ростовую активность тест-штаммов при требуемом уровне дифференцирующих свойств вибрионов (обязательное наличие роста на чашках при посеве всех тест-штаммов ПГВ - из 10 м.к. и не менее 30% при посеве 100 м.к., образование зон лизиса вокруг колоний Канагава - положительных ПГВ и отсутствие зон лизиса вокруг Канагава - отрицательного штамма).

Пример 4

Для приготовления среды используют вышеуказанные препараты ниже минимальной концентрации (г):

1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 15,0,

2. Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 4,0,

3. Агар микробиологический - 12,0,

4. Глюкоза - 3,0,

5. Маннит - 3,0,

6. Натрия хлорид - 45,0,

7. Натрия карбонат - 1,2,

8. Калия гидрофосфат - 4,0,

9. Метиловый фиолетовый - 0,001,

10. Эритроциты отмытые – 45,

при рН 8,0.

Данные реагенты заливают 950 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, расплавляют при тщательном перемешивании, стерилизуют, охлаждают до 45-50°С вносят эритроциты. Реакция среды 8,0. Готовую среду разливают в чашки Петри.

Пример 5

Для приготовления среды используют вышеуказанные препараты выше максимальной концентрации (г):

1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 25,0,

2. Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 6,0,

3. Агар микробиологический - 18,0,

4. Глюкоза - 7,0,

5. Маннит - 7,0,

6. Натрия хлорид - 60,0,

7. Натрия карбонат - 2,0,

8. Калия гидрофосфат - 6,0,

9. Метиловый фиолетовый - 0,003,

10. Эритроциты отмытые – 52,

при рН 8,0

Данные реагенты заливают 950 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, расплавляют при тщательном перемешивании, стерилизуют, охлаждают до 45-50°С вносят эритроциты. Реакция среды 8,0. Готовую среду разливают в чашки Петри.

Таким образом, представленные данные указывают на высокую эффективность среды СГВ в рамках нормированного показателя состава. Ее чувствительность и показатель прорастания полностью соответствует существующим нормативным требованиям и в отличие от среды сравнения, обеспечивает высокие ростовые свойства и гемолитическую активность всех испытанных тест-штаммов.

Пример 6

Оптимальный вариант искомой среды СГВ прошел испытания в отношении тест-штаммов основных видов патогенных ПГВ. Приготовление и контроль среды проводили с методическими подходами, использованными в вышеописанных примерах. Культуры контрольных штаммов вибрионов готовили по методике идентичной при подготовке тест-штаммов.

Результаты проведенного испытания представлены таблице 6.

Исходя из представленных материалов и по результатам сравнительных испытаний предложенная композиция СГВ соответствует среде прототип Вагацума по ростовым и дифференцирующим показателям в отношении V. parahaemolyticus, и значительно превосходит в отношении других видов ПГВ. Полученные данные позволяют характеризовать новый препарат как дифференциальную среду, соответствующую современным требованиям к средам данного назначения. Особым преимуществом данного препарата можно считать ее эффективность при определении ее гемолитической активности в отношении всех групп ПГВ, что позволяет использовать ее при диагностике различных заболеваний, вызываемых ПГВ. Дополнительным преимуществом можно считать возможность ее изготовления из отечественных компонентов, и за счет этого низкую себестоимость (300-350 руб/л).

Государственная регистрация среды включена в сетевой график внедрения результатов НИР ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора.

Источники информации

1. Патент на изобретения №2711914 от 23.01.2020. «Питательная среда для выделения и идентификации парагемолитических вибрионов».

2. Патент на изобретения №2711914 от 23.01.2020. «Питательная среда для выделения и идентификации парагемолитических вибрионов».

3. Методы контроля бактериологических питательных сред МУК 4.2.2316-08, М., - 2008

4. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителя чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза МУ 3.3.2.2124-06, М., - 2007.

5. Методы выявления и определения парагемолитических вибрионов в рыбе, не рыбных объектах промысла, продуктах вырабатываемых из них, в воде поверхностных водоемов и других объектах. МУК 4.2.2046-06, М., - 2006.

6. Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых парагемолитическими и другими патогенными для человека вибрионами. МУК 4.2.1793-03, М., - 2003.

7. Приказ №535 от 22 апреля 1985 г «Об унификации микробиологических методов исследований применяемых в клиниках - диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».

Предполагаемое изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду, которая может быть использована в лабораторной практике для определения патогенных свойств вибрионов в тесте Канагава при диагностике пищевых токсикоинфекций, раневых инфекций и септицимий бактериальной природы. Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что среда дополнительно включает стимулятор роста гемофильных микробов, глюкозу, натрия карбонат, метиленовый фиолетовый, а питательная основа представляет собой ферментативный перевар мяса при следующих количественных соотношениях компонентов, г/л: ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 20,0±2,0, стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 5,0±0,5, агар микробиологический - 15,0±2,0, глюкоза - 5,0±1,0, маннит - 5,0±1,0, натрия хлорид - 50,0±2,0

натрия карбонат - 1,5±0,2, калия гидрофосфат - 5,0±0,5, метиленовый фиолетовый - 0,002±0,0005, эритроциты отмытые - 50±1,0, при рН 8,0. 6 табл., 6 пр.

Питательная среда для дифференциации парагемолитических вибрионов, включающая питательную основу, агар микробиологический, натрия хлорид, маннит, калия гидрофосфат эритроциты, отличающаяся тем, что среда дополнительно включает стимулятор роста гемофильных микробов, глюкозу, натрия карбонат, метиленовый фиолетовый, а питательная основа представляет собой ферментативный перевар мяса при следующих количественных соотношениях компонентов, г/л:

Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 20,0±2,0 Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 5,0±0,5 Агар микробиологический 15,0±2,0 Глюкоза 5,0±1,0 Маннит 5,0±1,0 Натрия хлорид 50,0±2,0 Натрия карбонат 1,5±0,2 Калия гидрофосфат 5,0±0,5 Метиленовый фиолетовый 0,002±0,0005 Эритроциты отмытые 50±1,0

при рН8,0

с последующим растворением в 950 мл дистиллированной воды.