ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12R1/63 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологической промышленности, медицине и касается оптимизации питательной среды для глубинного культивирования холерного вибриона с целью производства медицинских иммунобиологических препаратов. Использование изобретения позволяет утилизировать отходы производства антирабического иммуноглобулина и обеспечивает экономический эффект применения питательной среды, расширяет спектр питательных сред, используемых для накопления бактериальной массы.

Традиционно применяемые среды для глубинного культивирования холерного вибриона содержат в основе ферментативный гидролизат казеина или ферментативный гидролизат мяса крупного рогатого скота (КРС) по способу Хоттингера (Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии. / - М.: Медгиз., 1950, с.51-111; Виноградова И.Н. Производственные питательные среды. / Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. - М.: Медгиз, 1962, с.339-384). Основным недостатком этих сред является использование ценного пищевого сырья для приготовления питательной основы. В условиях обостряющегося дефицита пищевых белков актуальным является поиск белоксодержащего сырья и внедрение безотходных технологий.

Известна питательная среда для лабораторного культивирования микроорганизмов, в том числе холерного вибриона, приготовленная из ферментативного гидролизата отходов мясоперерабатывающих предприятий. Содержание аминного азота в среде составляет 0,11-0,17%, натрия хлористого (NaCl) 0,3-0,5% (SU 1586180 A1, C12N 1/20). Недостатком данной питательной среды является использование белковой основы - гидролизата из абортированных плодов КРС, процесс приготовления которого на этапе подготовки сырья является трудоемким, так как перед гидролизом необходимо отделить мышечную ткань от костного скелета плода. Кроме того, на забой не часто попадают животные с большим сроком беременности, что создает трудности с получением сырья.

Известен способ получения гидролизатов и питательная среда для культивирования микроорганизмов (RU 21033345 C1, C12N 1/00), при котором основу для приготовления питательных сред готовят из отходов вакцинно-сывороточного производства (глобулинов, тканей куринных эмбрионов, фибрина, сгустков крови). Добиваясь глубокой степени расщепления белка, гидролиз ведут в две стадии, используя для этого на первом этапе аммиачный раствор, а затем поджелудочную железу КРС. Питательная среда на основе гидролизата, приготовленного с использованием в технологии этапа щелочного гидролиза (рН 10,5-11,5), имеет существенные недостатки, а именно: она является дефицитной по ряду аминокислот, так как происходит разрушение лизина, серина, глицина, цистеина, треонина, и, кроме того, происходит рацемизация большинства аминокислот с изменением на D-форму (Телишевская Л.Я. / Белковые гидролизаты. Получение, состав, применение. - М.: Аграрная наука, 2000, с.64-65). При этом ростовые свойства питательной среды снижаются, т.к. проявляется дефицит аминокислот, а также в процессе метаболизма микроорганизмы затрачивают дополнительную энергию на изомеризацию аминокислот и их перевод в L-форму. Предложенная авторами среда предназначена для культивирования листерий, сальмонелл, пастерелл. Кроме того, отсутствуют сведения о биологических показателях питательной среды, в том числе ее эффективности по выходу биомассы с мл среды.

Известны способ получения О-антигена холерного очищенного (RU 2143280 С1, А61К 39/106) и способ производства вакцины для профилактики холеры (RU 2080121 С1, А61К 39/00) с описанием способа глубинного культивирования холерного вибриона на питательной среде, содержащий ферментативный гидролизат казеина или гидролизат мяса (Хоттингера) и принятой авторами за прототип. Содержание аминного азота в среде составляет 0,2%, натрия гидрофосфата двузамещенного (Na₂HPO₄×12H₂O) - 0,05%, натрия хлористого (NaCl) - 0,5%, рН 8,0-8,1. Указанные среды соответствуют основным требованиям, предъявляемым к составу производственной питательной среды - обеспечение высоких питательных потребностей микроорганизмов, стабильность и полноценность аминокислотного состава, а также достаточная буферная емкость, необходимая для выращивания в условиях глубинного культивирования с подкормкой глюкозой. Однако использование в составе питательных сред гидролизатов, приготовленных из дорогостоящего белкового сырья пищевого назначения, существенно влияет на себестоимость конечных продуктов производства медицинских иммунобиологических препаратов.

Одной из основных задач в производстве медицинских иммунобиологических препаратов является подбор экономически выгодной питательной среды, не уступающей по ростовым свойствам традиционным. Снижения стоимости питательных сред можно достичь при использовании сырья, не имеющего пищевой ценности.

Техническим результатом изобретения является обеспечение рациональной утилизации отходов, образующихся при производстве иммунобиологических препаратов, упрощение технологии приготовления питательной среды для культивирования холерного вибриона, не уступающей по своим ростовым свойствам прототипу. Экономический эффект от использования изобретения заключается в снижении себестоимости конечного продукта - диагностического препарата для индикации возбудителя холеры.

Технический результат достигается использованием в качестве питательной основы ферментативного гидролизата фибрина, приготовленного из отхода производства антирабического иммуноглобулина.

Предлагаемая жидкая питательная среда содержит гидролизат фибрина, полученный ферментативным гидролизом нативной поджелудочной железы КРС в количестве, обеспечивающем содержание аминного азота в среде 0,2%, при следующем соотношении компонентов, об.%:

ферментативный гидролизат фибрина 0,2-0,25 Na₂HPO₄×12H₂O 0,05 NaCl 0,5 вода дистиллированная остальное рН 8,0-8,1

Использование ферментативного гидролизата фибрина в качестве питательной основы является отличительным признаком предлагаемой питательной среды для культивирования холерного вибриона.

Фибрин является высокопитательным субстратом, полноценным по аминокислотному составу, близким к миозину - белку мышечной ткани. Фибрин - побочный продукт при производстве антирабического иммуноглобулина, образуется из иммунной крови лошадей при сепарировании плазмы, по настоящее время не имел промышленного использования и подлежал утилизации. Собранный фибрин замораживают и хранят при температуре (-18±2)°С. В процессе приготовления гидролизата из фибрина не требуется предварительной подготовки сырья, что упрощает технологический процесс приготовления питательной среды.

Ферментативный гидролиз измельченного на мясорубке фибрина, термически обработанного в течение 30 мин при 100°С, проводят фаршем поджелудочной железы КРС при соотношении компонентов в смеси: вода водопроводная, фибрин, поджелудочная железа, соответственно: 1:1:0,25. В смесь добавляют хлороформ до конечной концентрации 2%. Уровень рН регулируют добавлением натрия двууглекислого безводного. Гидролиз осуществляют в реакторе при температуре 37°С и рН 8,0±0,1, при периодическом перемешивании до 7-8 сут. Процесс гидролиза ежедневно контролируют по содержанию аминного азота методом формольного титрования. Достижение аминного азота 0,5-0,7% и прекращение его нарастания свидетельствует об окончании ферментативного процесса. Смесь отстаивают в течение суток, осторожно декантируют с осадка в емкость. В качестве консерванта добавляют хлороформ - до 2%, хранят при температуре (6±2)°C в течение 5-6 месяцев для его созревания.

Физико-химические показатели гидролизата фибрина соответствуют требованиям, предъявляемым к питательным основам МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред». Сравнительные характеристики белковых гидролизатов заявляемой и аналоговой сред представлены в таблице 1.

Биологические показатели оценки пригодности предлагаемой питательной среды определены в соответствии с МУ 3.3.2.2124-06 «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза» при выращивании тест-штаммов холерного вибриона. При тестировании биологических свойств заявляемой питательной среды использованы плотные и жидкие среды с содержанием аминного азота в среде соответственно 0,1% и 0,08%. Среды на основе гидролизата фибрина обеспечивали типичный по морфологии рост холерного вибриона. Сравнительные данные по биологическим свойствам заявляемой и аналоговой питательных сред, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о пригодности сред для культивирования холерного вибриона.

Питательную среду для глубинного культивирования холерного вибриона на основе гидролизата фибрина готовят в реакторе. Необходимое количество гидролизата, обеспечивающее содержание аминного азота в среде 0,2%, воду дистиллированную и уголь кипятят в течение 10 мин. Осветленный углем гидролизат фильтруют через рамный фильтр из 15 пластин с тканевым бельтингом под давлением 0,02 МПа при температуре (75±5)°C. Фильтрат собирают в реактор, добавляют до необходимого объема питательной среды воду дистиллированную и нагревают до температуры (90±5)°C. Добавляют натрий хлористый до конечной концентрации 0,5% и натрий фосфорнокислый двузамещенный - до конечной концентрации 0,05%. Устанавливают значение pH до 8,0-8,1, используя 20% раствор натрия гидроокиси. Смесь кипятят в течение 20 мин при автоматическом перемешивании. Готовый бульон фильтруют в емкость из нержавеющей стали при температуре (75±5)°C через бельтинг, под давлением 0,02 МПа. Питательную среду стерилизуют в реакторе-ферментере при режиме (120±1)°C в течение 30 мин, после чего ее используют для выращивания производственных штаммов холерного вибриона.

Возможность практического использования изобретения подтверждена примерами выращивания производственных штаммов холерного вибриона: Vibrio cholerae не O1 105 и V. cholerae O1 М-41.

Пример 1.

Для приготовления 125 л питательной среды с содержанием аминного азота 0,2% из гидролизата фибрина с содержанием аминного азота в основе 0,7% использовали 36,4 л осветленного углем гидролизата и 88,6 л воды дистиллированной с растворенными солевыми добавками: натрий хлористый - 0,625 кг до конечной концентрации 0,5% и натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,063 кг до конечной концентрации 0,05%. Смесь грели в реакторе до температуры (90±5)°C, устанавливали в среде pH 8,0, для чего использовали 20% раствор натрия гидроокиси - 0,4 л. Кипятили в течение 20 мин при автоматическом перемешивании. Готовый бульон фильтровали в емкость из нержавеющей стали при температуре (75±5)°C через бельтинг, под давлением 0,02 МПа. Питательную среду стерилизовали в реакторе-ферментере при режиме (120±1)°C в течение 30 мин, после чего ее использовали для выращивания производственного штамма V. cholerae не O1 105, который используется в качестве адсорбента для повышения специфичности холерных агглютинирующих сывороток и флуоресцирующих иммуноглобулинов.

При культивировании V. cholerae не O1 105 в ферментере объемом 0,250 м³ с использованием среды из гидролизата фибрина показатель эффективности составил 40×10⁹ м.к./мл среды, на традиционной среде по Хоттингеру - 18×10⁹ м.к./мл, при одинаковых условиях культивирования: 37°C, в течение (24±0,5) ч. По эффективности адсорбции штамм V. cholerae не O1 105, выращенный на среде из гидролизата фибрина был аналогичен адсорбенту, выращенному на среде по Хоттингеру.

Пример 2.

Приготовление питательной среды осуществляется по примеру 1, в объеме 250 л из гидролизата фибрина с содержанием аминного азота в основе 0,55%, поэтому использовали 100 л осветленного углем гидролизата и 150 л воды дистиллированной с растворенными солевыми добавками: натрий хлористый - 1,25 кг до конечной концентрации 0,5% и натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,125 кг до конечной концентрации 0,05%. В среду дополнительно вводили пептон ферментативный 2,5 кг (до 1%), по аналогии с прописью, использованной для контроля - питательной среды на основе гидролизата казеина. Для установления pH 8,0 добавляли 20% раствор натрия гидроокиси - 0,8 л.

Питательную среду стерилизовали в реакторе-ферментере при режиме (120±1)°C в течение 30 мин, после чего ее использовали для выращивания производственного штамма V. cholerae O1 М-41.

При выращивании V. cholerae O1 М-41 в ферментере объемом 0,5 м в условиях аэрации и подкормки раствором глюкозы - на среде из гидролизата фибрина (37°C, в течение 10 ч) получено биомассы 158×10⁹ м.к./мл питательной среды, соответственно на среде из гидролизата казеина - 111,4×10⁹ м.к./мл. При определении количества О-антигена в центрифугате формалинизированной культуры V. cholerae O1 М-41, выращенной на предлагаемой среде с основой из гидролизата фибрина и в центрифугате культуры, полученной с контрольной среды, регистрировали положительную реакцию агглютинации с холерной сывороткой O1 в разведении, соответственно 1/16 и 1/8.

Об эффективности применения питательных сред, приготовленных на основе гидролизата фибрина, свидетельствуют приведенные в таблице 3 данные масштабированного выращивания производственных штаммов холерного вибриона. Показатель эффективности сред, полученных на основе гидролизата фибрина, в 1,5-2 раза выше по сравнению со средами, полученными на основе гидролиза мяса и казеина. Увеличение выхода биомассы микроорганизмов обусловлено наличием в питательной среде сбалансированного и полноценного состава аминокислот, пептидов, углеводов и минеральных солей.

Таким образом, фибрин, образующийся в качестве отхода при производстве антирабического иммуноглобулина, является полноценной альтернативой мясному и казеиновому сырью в приготовлении питательной основы для культивирования микроорганизмов. Замена в питательной среде мясной или казеиновой основы гидролизатом фибрина позволяет существенно сократить себестоимость питательной среды без потери ее эффективности. Применение вторичного сырья позволяет решить ряд проблем по рациональному использованию имеющихся ресурсов. Внедрение в производство безотходных технологических процессов предотвращает загрязнение окружающей среды. Это имеет экологическое значение, а масштабы производства антирабического иммуноглобулина позволяют получать значительное количество такого сырья. Предлагаемая среда может быть использована при производстве медицинских иммунобиологических препаратов для диагностики холеры.

Таблица 1 Питательная среда для глубинного культивирования холерного вибриона Показатель Гидролизат фибрина Гидролизат мяса КРС (по Хоттингеру) Гидролизат казеина Описание Прозрачная жидкость темно-коричневого цвета Прозрачная жидкость темно-коричневого цвета Прозрачная жидкость темно-коричневого цвета Прозрачность Прозрачный Прозрачный Прозрачный Сухой остаток, % 7,06±0,56 8,05±0,99 10,27±0,62 Пептиды, % 1,84±0,12 2,49±0,93 2,51±0,11 Общий азот, % 1,1±0,17 1,16±0,12 1,43±0,11 Аминный азот, % 0,60±0,10 0,72±0,08 0,93±0,11 Расщепление белка, % 56,0±4,02 61,83±3,17 64,13±2,15 Фосфор неорганический, % 0,03±0,01 0,05±0,01 0,045±0,01 Фосфор общий, % 0,05±0,01 0,08±0,02 0,1±0,05 Хлориды, % 0,10±0,01 0,08±0,03 0,10±0,01 Кальций, % 0,0005±0,00 0,0018±0,0006 0,01±0,00 Магний, % 0,0022±0,0002 0,0032±0,0021 0,017±0,02 Железо, мкг 393±12 404±17 438±13 Углеводы, мкг 425±0,20 934±0,25 1300±0,11

Изобретение относится к биотехнологии и касается оптимизации питательной среды для глубинного культивирования холерного вибриона. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат фибрина - отхода производства иммуноглобулина антирабического, получаемый в результате гидролиза препаратом нативной поджелудочной железы КРС, Na₂HPO₄×12H₂O, NaCl и дистиллированную воду. Изобретение позволяет расширить ассортимент питательных сред и снизить загрязнение окружающей среды. 3 табл.

Питательная среда для глубинного культивирования холерного вибриона, содержащая питательную основу, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат фибрина - из отхода производства иммуноглобулина антирабического, полученный в результате гидролиза препаратом нативной поджелудочной железы КРС, взятый в количестве, обеспечивающем содержание аминного азота в среде 0,2%, при следующем соотношении компонентов, об.%:
ферментативный гидролизат фибрина 0,2-0,25 Na₂HPO₄·12H₂O 0,05 NaCl 0,5 вода дистиллированная остальное,