Модифицированная питательная среда для павловнии в условиях in vitro Российский патент 2024 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к питательным средам при микроклональном размножении in vitro. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности размножения in vitro павловния на жидкой среде. Результаты данного изобретения могут быть использованы при получении посадочного материала лесных пород деревьев.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Павловния (Paulownia) - это род быстрорастущих деревьев из семейства Paulowniaceae. Павловния - дерево с красивыми крупными листьями (диаметр около 70 см), цветами (до 6 см в диаметре) и красивой кроной. Диаметр ствола достигает 1 метр. Продолжительность жизни до 100 лет. В зависимости от среды произрастания, деревья могут достигать разной высоты, максимум - до 25 метров. К почве неприхотлива, растет на любых, даже на сухих почвах, содержащих до 2% извести, но наилучшего развития достигает на глубокой, умеренно влажной, дренажированной, достаточно плодородной, глинистой почве. Светолюбива, предпочитает открытые хорошо освещенные участки. Павловния растет и набирает массу с поразительной скоростью (до 3-5 метров в год и до 100 тон биомассы на гектар через три года!). Ствол можно срубать несколько раз, при этом дерево продолжит расти опять. Незаменима она при разработке моделей устойчивого и ускоренного повышения продуктивности насаждений, при плантационном лесоводстве для ускоренного получения древесины. В связи с важностью выращивания селекционных форм и сортов существует необходимость получения посадочного материала с высокими наследственными свойствами. В уровне техники не выявлен способ решения поставленной задачи. Предлагаемое изобретение решает задачу создания наиболее эффективного способа размножения павловния - микроклональное размножение in vitro.

В патенте RU 96124340 представлена работа, описывающая состав питательной среды для ускорения размножения растений методом in vitro. Данная среда отличается тем, что она дополнительно содержит гидроксипроизводное бензойной кислоты при следующем соотношении компонентов, мг/л: аммоний азотнокислый - 820-830, калий азотнокислый -940-960, кальций хлористый - 210-230, магний сернокислый - 180-190, калий фосфорнокислый - 80-90, железо сернокислое - 13,4-13,8, этилендиаминотетраацетат натрия - 18,5-18,9, борная кислота - 3,0-3,2, марганец сернокислый -11,0-11,4, цинк сернокислый - 4,1-4,5, калий йодистый

- 0,40-0,44, натрий молибденовокислый - 0,11-0,15, медь сернокислая - 0,011-0,015, кобальт хлористый - 0,011-0,015, миоинозит - 40-60, тиамин - 0,2-0,3, пиридоксин - 0,2-0,3, никотиновая кислота - 0,2-0,3, аскорбиновая кислота -0,4-0,6, индолилмасляная кислота - 0,5-1,5, гидроксипроизводное бензойной кислоты - 0,5-10,0, сахароза - 14000-16000, агар - 6000-8000, вода до 1 л.

В документе RU 2012116232 также предложен состав питательной среды. Питательная среда, включающая макро и микро элементы по Мурасиге-Скугу, отличается тем, что в качестве регуляторов роста питательная среда содержит гиббереллин и дополнительно ретардант - либо хлорхолинхлорид, либо культар, либо пике при следующем соотношении компонентов, мг/л: аммоний азотнокислый-1600-1700, калий азотнокислый - 1850-1950; кальций хлористый - 400-480; магний сернокислый - 340-400; калий фосфорнокислый

- 140-200; железо сернокислое - 27,0-28,6; этилендиаминотетраацетат натрия

- 37,0-37,6; борная кислота - 6,0-6,4; марганец сернокислый - 22,0-22,6; цинк сернокислый - 8,0-9,2; калий йодистый - 0,80-0,86; натрий молибденовокислый - 0,2-0,3; медь сернокислая - 0,02-0,03; кобальт хлористый - 0,2-0,03; мезоинозит - 80-120; никотиновая кислота - 0,4-0,6; пиридоксин - 0,4-0,6; тиамин - 0,4-0,6; агар - 6000-7000; сахароза - 29000-31000; гиббереллин - 0,1-1,0; ретардант: либо хлорхолинхлорид, либо культар, либо пике - 0,1-1,0; вода - до 1 л.

Два состава питательных средств, разработаны ГНУ ВНИИС им. И.В. Мичурина РАСХН. Среда содержит следующие компоненты, мг/л: кальций азотнокислый (Са(NO₃)₂×4H₂O)-416,9; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота - по 0,5; аскорбиновая кислота - 1,5; мезоинозит - 100; сахароза -20000; агар-агар - 8000; индолилмасляная кислота -1,0-1,5; дистиллированная вода - до 1 л. Отличие данных сред состоит в содержании комплексного водорастворимого удобрения Мастер марки 3.11.38+4 (RU 2485766, RU 2486237), и комплексного водорастворимого удобрения Акварин 5 (RU 2485768).

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности размножения павловния на жидкой среде с одновременным сокращением продолжительности культивирования и сохранением качественных характеристик растений.

Поставленная цель достигается за счет использования жидкой среды Мурасиге-Скуга (Murashige Т. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) повышения содержание тиамина с 0,5 мл/л до 0,8 мл/л, аскорбиновой кислоты с 1,0 г/л до 2,0 г/л; 6-Бап с 0,5 мл/л до 1,2 г/л; FeSO4 7H2O с 27,8 мл/л до 55,6 мл/л введения гибберилиновой кислоты до 2,0 мл/л; нитрата кальция Ca(NO3)4H2O до 112 мл/л; выведения хлористого кальция Са CL2 2H2O; никотиновой кислота и пиридоксина.

Первоначально бидистиллированную воду, насыщенную углекислым газом, растворяют сахарозу в химическом стакане или колбе емкостью 1 л. Концентрация сахарозы составляет 20 г/л. Емкость наполняется на 1/2. далее по схеме добавляются расчетные концентрации макро и микросолей, витаминов. Посуда с солями доводится до 1 литра ранее насыщенной CO2 водой. Перед введением фитогормонов кислотность раствора доводится до оптимальных показателей рН, равной 5,6-5,8. Для регуляции кислотности используются стерильные растворы щелочи.

Для получения твердой питательно среды используется агар-агар, который предварительно замачивается для набухания, после чего нагревают на электроплите до полного растворения и сливают с готовой питательной средой.

Питательную среду разливают в пробирки до 1 /3 объема, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве. Стерилизация проводится при 1 атм и 120°С в течение 20 минут. В остывшую среду стерильно вносятся раствор витаминов Мурасиге-Скуга и регулятор роста 6-БАП в концентрации 1,2 г/л.

Данная питательная среда используется на этапе мультипликации микрорастений павловния, которые были получены на стандартных средах, используемых на этапе ввода эксплантов в культуру in vitro.

Культивирование микрорастений проводится в течение 28 дней при фотопериоде 16/8 и освещенности 1000 люкс. На всем этапе мультипликации состав питательной среды и процесс ее приготовления остается первоначальным.

Предлагаемая универсальная модифицированная питательная среда, представленная в Таблице 1, для использования в условиях in-vitro на этапе мультипликации павловния позволила повысить коэффициент размножения на 30.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для мультипликации павловнии in vitro, содержащую следующие исходные компоненты: NH₄NO₃ - 1650 мг/л, KNO₃ - 1900 мг/л, MgSO₄⋅7H₂O - 370 мг/л, KH₂PO₄ - 170 мг/л, Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л, MnSO₄⋅4H₂O - 22,3 мг/л; ZnSO₄⋅7H₂O - 8,6 мг/л, KJ - 0,83 мг/л, Na₂MO₄⋅2H₂O - 0,25 мг/л; CuSO₄⋅5H₂O - 0,25 мг/л, CoCl₂⋅5H₂O - 0,025 мг/л, FeSO₄⋅7H₂O - 55,6 мг/л, Na₂-ЭDTA - 37,3 мг/л, Са(NO₃)⋅4H₂O - 112 г/л; сахароза - 20 г/л, агар - 7000 мг/л, тиамин - 0,8 мг/л, аскорбиновая кислота - 2,0 мг/л, глицин - 2,0 мг/л, 6-БАП - 1,2 г/л, мезо-инозит - 100 мг/л, гибберилиновая кислота - 2,0 мг/л. Изобретение позволяет повысить коэффициент размножения павлонии на 30% по сравнению с прототипом. 2 табл.

Питательная среда для мультипликации павловнии in vitro, содержащая следующие исходные компоненты:

NH₄NO₃ - 1650 мг/л,

KNO₃ - 1900 мг/л,

MgSO₄⋅7H₂O - 370 мг/л,

KH₂PO₄ - 170 мг/л,

Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л,

MnSO₄⋅4H₂O - 22,3 мг/л,

ZnSO₄⋅7H₂O - 8,6 мг/л,

KJ - 0,83 мг/л,

Na₂MO₄⋅2H₂O - 0,25 мг/л,

CuSO₄⋅5H₂O - 0,25 мг/л,

CoCL₂⋅5H₂O - 0,025 мг/л,

FeSO₄⋅7H₂O - 55,6 мг/л,

Na₂-ЭDTA - 37,3 мг/л,

Са(NO₃)⋅4H₂O - 112 г/л,

сахароза - 20 г/л,

агар - 7000 мг/л,

тиамин - 0,8 мг/л,

аскорбиновая кислота - 2,0 мг/л,

глицин - 2,0 мг/л,

6-БАП - 1,2 г/л,

мезо-инозит - 100 мг/л,

гибберилиновая кислота - 2,0 мг/л.