Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к способам размножения растений, и может быть использовано в виноградарстве для ускоренного размножения и оздоровления перспективных сортов винограда.
Уровень техники
Виноград - это одна из самых древних культур растений, возделываемая человеком, по разным оценкам от 6 до 8 тысяч лет. Первый описанный сорт винограда «Гуэ Блан» датирован 1283 г. Род Виноград (лат. Vitis sp) семейства Виноградовые (лат.Vitaceae) состоит из 60 видов, культивируемых и произрастающих почти исключительно в Северном полушарии. Вид Vitis vinifera L. - единственный вид рода, обитающий в Евразии, и предположительно появившийся около 65 миллионов лет назад, став основой виноделия [This et al., 2006; Myles et al., 2011]. В ходе селекции и отбора человечеству удалось получить около 12000 сортов винограда, которые выращиваются для производства вина (около 60% сортов), употребляются в свежем виде (34% столовых и универсальных сортов), высушиваются с получением изюма (0,7% сортов) и выращивается для подвоев (8,2% сортов) [McGovern, 2003; Munir et al., 2015]. Heудивительно, что виноград стал одной из экономически важных сельскохозяйственных культур: площадь его возделывания составляет более 7,2 млн га, а по общему производству виноград занимает третье место среди плодово-ягодных культур [https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL, дата обращения 07.12.2023]. В настоящее время в России промышленным производством винограда занимаются более 500 специализированных предприятий, из них более 100 организаций являются крупными виноградными хозяйствами с площадью более 150 га. Объем производства винограда в Российской Федерации ежегодно увеличивался в течение последних 10 лет [Усенко Л.Н. и др. 2017].
Ввиду таких биологических особенностей винограда как длительный ювенильный период (5-8 лет), высокая степень гетерозиготности генома и часто встречаемое явление инбредной депрессии, когда гомозиготизация при скрещивании приводит к потере жизнеспособности и производственных характеристик сорта, делают вегетативное размножение основой размножения и промышленного выращивания винограда [Massormet et al., 2020; Töpfer et al., 2022; Laimer, 2009; Pierozzi & Moura, 2016; Migicovsky et al., 2017; Gascuel et al., 2017].
Традиционный метод вегетативного размножения виноградной лозы требует много времени и сил, а также не позволяет очистить черенки от болезней [Ng et al., 1992; Winkler et al., 1974]. Выращивание культуры винограда in vitro имеет много преимуществ по сравнению с традиционными методами: микроклональное размножение может обеспечить массовое производство элитного сорта и/или генотипа, который можно акклиматизировать за короткий период с относительно низкой стоимостью [Rathore et al., 2004]. Микроклональное размножение виноградной лозы осуществляется культивированием микрочеренков, верхушечных меристем побегов, пазушных или адвентивных почек [Thomas et. al., 2000; Heloir et al., 1997; Anupa et al., 2016; Aazami et al., 2010]. Различные виды и сорта винограда по-разному реагируют на условия культивирования [Anupa et al., 2016]. Так, для некоторых сортов показано явление некроза верхушки черенка в культуре in vitro, что связывают с различными факторами, например, для сорта «Arka Neelamani» это явление объясняют избыточностью укоренения и формирования большого количества пазушных почек [Thomas, 2000]. Стабилизировать ситуацию с одним верхушечным некрозом растений in vitro на разных сортах удавалось по-разному: одним сортам было достаточно более частого пассирования и проветривания, другим нужны были дополнительные источники фосфора, третьим - оптимизация соотношения концентрации кальция, бора и фосфатов [Al-Aisari et al., 2020].
В подавляющем большинстве промышленных виноградников выращивают ограниченный перечень сортов, т.к. они характеризуются уникальным танинным составом, характерной кислотностью и букетом, которые невозможно достичь, выращивая гибридные сорта [http://www.josevouillamoz.com/, дата обращения 05.12.2023]. Основой технического виноградарства и зрелого виноделия во всем мире являются 11 сортов винограда, так называемые «благородные» (noble) сорта: Cabernet Sauvignon, Chasselas, Chardonnay, Grenache, Merlot, Monastrell, Pinot Noir, Riesling, Sauvignon Blanc, Syrah и Ugni Blanc [Cohen et al., 2023].
Большинство публикаций по подбору оптимальных сред для микроклонального размножения описывают работу на локальных сортах и гибридах вне списка, «благородных» сортов. Хотя создание методики микроклонального размножения именно элитных технических сортов представляет наибольший интерес для омоложения и оздоровления виноградников с сохранением генотипов наиболее ценных технических сортов винограда.
Классическим подходом к микроклональному размножению винограда является поочередное культивирование на трех средах в зависимости от стадии развития черенка или почки: инициацию культуры проводят на средах Мурасиге и Скуга (MS) [Murashige, Skoog, 1962] с добавлением 0,5 мг/л цитокинина 6-бензиламинопурина (6-БАП), 4 недели инкубируют в ростовой камере, затем переносят на среду для деления и роста: MS с добавлением 1 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л ауксина индол-3-масляной кислоты (ИМК), выращивают еще 4 недели до подроста от 1 см над базальной почкой и такие черенки переносят на укоренение на среду с добавлением высокой концентрации ауксина индолил-3-уксусной кислоты (ПУК) и выращивают еще 4-6 недель до формирования развитой корневой системы. Суммарно этот процесс занимает 3-3,5 месяца по стандартному протоколу [https://www.plantcelltechnology.com/blogan-effective-technique-to-micropropagation-of-grapes/, дата обращения 05.12.2023].
В патенте РФ №2041609 «Способ микроклонального размножения винограда ''ин витро''», раскрыт способ, включающий микрочеренкование пробирочных растений с 8 10 междоузлиями на фрагменты длиной 10-12 мм с узлом и листом, посадку их на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга и культивирование из них растений, отличающийся тем, что в питательную среду добавляют тонкоразмолотые семена винограда в концентрации 0,1-0,5% от объема среды. В указанном способе оптимизацию микроклонального размножения осуществляют за счет питательной среды, в составе которой предлагают стимуляторы роста естественного прохождения, а именно семена винограда, в виде тонкоразмолотого порошка. В этом способе используются стимуляторы естественного происхождения, при этом невозможно контролировать концентрацию действующих веществ.
В статье Медведевой с соавторами [Медведева и др., 2008] раскрыт способ, заключающийся в том, что:
- от растений отделяют меристематическую верхушку побега (апекс) размером 0,3-0,5 мм, стерилизуют 0,1%-ным раствором йодида ртути HgJ2 4 минуты и 5-кратно отмывают в стерильной воде по 5 минут;
- экспланты помещают на твердую питательную среду ГМ1, представляющую собой среду Мурасиге и Скуга (MS) с измененным содержанием макросолей, и инкубируют в течение до 30 дней:
- индуцированные побеги переносят на твердую питательную среду MS с добавлением 0,1-0,4 мг/л 6-БАП, без или с добавлением 0,1-0,2 мг/мл гиббереллиновой кислоты и инкубируют в течение 4 недель;
- полученные в конце пассажа экспланты представляющие собой конгломераты из почек и микропобегов, разделяют на черенки и пересаживают на свежую питательную среду;
- полученные в конце пассажа регенеранты переносят на обедненную жидкую питательную среду Мурасиге и Скуга, содержащую половинное количество макро- и микроэлементов, полный набор витаминов и 0,2 мг/л одного из двух вариантов ауксина: ПУК либо α-нафтилуксусной кислоты (НУК);
при этом на всех этапах развития растений-регенерантов в питательную среду добавляют антибиотик цефотаксин в концентрации 10 мг/л. Экспланты культивируют в пробирках размером 210×140 мм на светоустановках в условиях светозала при 24°С и освещении 6 тыс. люкс в течение 16 часов в сутки;
- полученные пробирочные растения закаливают, для этого их выдерживают в открытых пробирках в условиях светозала при 24°С на стеллажах без освещения в течение 24, 48 или 72 часов;
- полученные растения высаживают в стерилизованный субстрат, представляющий собой лесную землю+торф+песок в соотношении 1:1:1 либо лесную землю+почвенный субстрат «Дубрава»+песок в соотношении 2:1:1.
Известен способ микроклонального размножения винограда [Kinfe et al., 2017], заключающийся в том, что:
- от растений отделяют экспланты: черенки с узлами длиной 2-3 см, тщательно промывают экспланты водопроводной водой, содержащей Твин 20, поверхность эксплантов стерилизуют в 1% гипохлорите натрия (NaOCl) в течение 7 минут;
- экспланты помещают на твердую питательную среду MS с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП и инкубируют в камере роста при температуре 27°С в течение 4 недель;
- индуцированные побеги переносят на твердую питательную среду MS с добавлением 1 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л ИМК и инкубируют в камере роста при температуре 27°С в течение 4 недель;
- побеги длиной один сантиметр и более погружают на 2 мм в твердую питательную среду MS с добавлением 4 мг/л ПУК и инкубируют в камере роста при температуре 27°С в течение 4-6 недель;
- развившиеся корни переносят в небольшие горшочки, содержащие стерильную почву, компост и песок в соотношении 2:1:1, накрывают растения полиэтиленовыми пакетами и помещают на 1 неделю в теплице.
В патенте РФ №2636030 раскрыта питательная среда для ввода и регенерации меристем винограда в условиях in vitro, содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, 6-бензиламинопурин, сахарозу, агар, воду при следующем соотношении компонентов, мг/л:
В работе Дорошенко с соавторами [Doroshenko et al., 2021] раскрыт способ микроклонального размножения, в котором ткани растений стерилизовали 0,8% раствором AgNO3, после чего из почек активно растущих побегов виноградной лозы выделяли меристемы без листовых зачатков с размером эксплантов 0,1 0,2 мм и переводили их в твердую питательную стерильную среду Мурасиге и Скуга следующего состава:
Этап внедрения для повышения выживаемости меристем был разделен на два подэтапа. Культивацию проводили сначала на твердой питательной среде. Затем, через 3-4 недели, когда меристемы увеличивались до 2-3 мм, их пересаживали в жидкую питательную среду на перемычки фильтровальной бумаги, а пробирки помещали на вращающийся аппарат роликового типа так, чтобы экспланты все время промывались питательной средой.
На втором этапе культивирование проводили в колбах Эрленмейера в тонком слое (2-4 мм) жидкой питательной среды Мурасиге и Скуга следующего состава:
Добавление в питательную среду в первом пассаже 1,0 мг/л цитокинина 6-БАП, а со второго пассажа 2,0 мг/л 6-БАП индуцирует развитие многочисленных пазушных побегов. Пересадки проводили каждые 14 дней, каждый раз деля эксплант на 5-7 частей.
На следующем этапе для укоренения побегов, полученных после пролиферации, использовали питательную среду следующего состава:
Способ осуществляли на классических сортах винограда, на донских аборигенных сортах, на подвойных сортах.
Автор также апробировал протоколы культивирования и микроклонального размножения технических сортов винограда, найденные по разнообразным литературным источникам [Bouquet et al., 2006; Nishitani et al., 2016; Malnoy et al., 2016; Osakabe et al., 2018; Ren et al., 2021 и др.]. К сожалению, ни одна опубликованная методика не подошла для размножения элитных технических сортов.
Основными недостатками существующих способов микроклонального размножения являются многоэтапность, необходимость использования разных питательных сред на разных этапах размножения культуры, необходимость частых переносов эксплантов на свежую среду, большая длительность процесса получения готового к акклиматизации растения, от 3-5 месяцев. Кроме того, эффективность многих способов показана на рядовых сортах винограда, в то время как для элитных «благородных» сортов они не подходят.
Сущность изобретения
Одной из технических задач, на решение которых направлено настоящее изобретение, было создание простого и эффективного способа микроклонального размножения винограда, пригодного для выращивания и размножения винограда элитных «благородных» сортов.
Техническим результатом настоящего изобретения можно считать быстрое укоренение и рост черенка винограда элитных сортов, получение готового к акклиматизации здорового растения винограда элитных сортов через 1-2 месяца ведения культуры in vitro, использование питательной среды одного состава на всех этапах размножения культуры, получение готового к акклиматизации растения в одной питательной среде без пассажей.
В настоящей группе изобретений предлагается искусственная питательная среда для микроклонального размножения винограда следующего состава:
В частном случае реализации изобретения предлагается искусственная питательная среда для микроклонального размножения винограда следующего состава:
В другом варианте осуществления группы изобретений предлагается способ микроклонального размножения винограда, включающий посадку изолированного экспланта на искусственную питательную среду по настоящему изобретению с последующим культивированием до появления дополнительных почек и корней.
В одном из вариантов осуществления изобретения эксплант дополнительно переносят в свежую питательную среду.
В другом варианте осуществления изобретения после появления дополнительных почек эксплант черенкуют и для каждого черенка повторяют способ по настоящему изобретению.
Заявленный способ микроклонального размножения отличается от всех известных из уровня техники способов тем, что он не требует частых пассажей и смены состава питательной среды на разных этапах, может быть осуществлен от начала и до конца в одной питательной среде без переносов. Использование способа по настоящему изобретению позволило получить готовые к акклиматизации растения и таким образом ввести в культуру технические сорта винограда Мальбек, Мерло, Шардоне, Рислинг из коллекции «Всероссийского национального научно-исследовательского института виноградарства и виноделия «Магарач». При осуществлении заявленного способа растения активно развиваются в питательной среде и требуют переноса на свежую среду только при высыхании среды или исчерпании свободного объема банки.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:
На Фиг. 1 представлены выращенные in vitro растения элитных сортов винограда Мальбек, Шардоне, Мерло и Рислинг через 1 месяц после черенкования на искусственной питательной среде по настоящему изобретению без промежуточных переносов на другие или свежие питательные среды. А - Рислинг, Б - Мальбек, В - Шардоне, Г - Мерло.
На Фиг. 2 представлены результаты апробации питательных сред 1m-4m для микроклонального размножения винограда двух элитных сортов Мерло и Шардоне. В подписи к фотографии первым числом отмечено, сколько времени прошло с момента пересадки на свежую среду: день черенкования, 2 или 3 недели с момента черенкования.
На Фиг. 3 показано образование корней и листьев у черенков винограда сортов Шардоне и Мерло при выращивании на искусственной питательной среде по настоящему изобретению уже через 2 недели после культивирования (выросшие корни и листья отмечены стрелками).
На Фиг. 4А демонстрируются черенки винограда сорта Мальбек через 1,5 месяца после высадки в искусственную питательную среду по настоящему изобретению (черная среда) и в питательную среду 4 т (белая среда); на Фиг. 4Б подросшее растение еще через 2 недели роста в искусственной питательной среде по настоящему изобретению.
На Фиг. 5 представлены растения в начале акклиматизации к ex vitro условиям культивирования.
Детальное описание изобретения
Если не указано иначе, предполагается, что все термины, обозначения и другие научные термины, используемые в данной заявке, имеют значения, которые обычно понимают специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. В некоторых случаях определения терминов с общепринятыми значениями приведены в данной заявке для ясности и/или для быстрой справки и понимания, и включение таких определений в настоящее описание не должно истолковываться как наличие существенного отличия значения термина от обычно подразумеваемого в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы сельскохозяйственной биотехнологии, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области.
Изобретение раскрывает новую искусственную питательную среду для микроклонального размножения винограда следующего состава:
Термин «питательная среда» обозначает многокомпонентную жидкость или плотный гель, созданные специально для культивирования растений.
Термин «искусственная питательная среда» обозначает питательную среду, в которую входят только определенные химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях и растворенные в дистиллированной или деионизованной воде с подведенным до оптимального показателя рН.
Термин «микроклональное размножение» обозначает получение in vitro, неполовым путем растений, генетически идентичных исходному.
Термин «эксплант» обозначает фрагмент ткани или органа растения, инкубируемый в питательной среде самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса, например, меристема, черенок, листовая почка, гипокотиль и пр.
Для создания питательной среды по настоящему изобретению за основу была взята среда для укоренения растений PRM, описанная в статье Перла с соавторами [Perl et al., 2004]. Эта питательная среда используется не для размножения in vitro, а для укоренения трансгенных трансфектантов. Изобретение основано на неожиданном результате, полученном при использовании среды PRM, которую автор модифицировал, удалив для целей настоящего изобретения из среды PRM антибиотики клафоран и паромомицин и добавив 100 мг/л аскорбиновой кислоты и 0,6% агара. С использованием искусственной питательной среды по настоящему изобретению удалось получить здоровые растения ex vitro из листовых почек винограда сортов Мальбек, Шардоне, Рислинг и Мерло. При использовании питательной среды по настоящему изобретению и способа микроклонального размножения по настоящему изобретению удалось размножить коллекцию из 4 элитных сортов от 4 до 200-300 растений за 5 месяцев.
Этот состав является универсальной основой, подходящей для «благородных» сортов винограда. Концентрации веществ, установленные в общей композиции диапазонами, можно варьировать в пределах соответствующих диапазонов в зависимости от используемого сорта: например, при использовании среды для некоторых «благородных» сортов можно увеличить концентрацию гептагидрата сульфата железа для уменьшения хлорозов, если они стали наблюдаться, или увеличить концентрацию сахарозы вплоть до 10% в случае накопления антоцианов.
В другом варианте осуществления группы изобретений предлагается способ микроклонального размножения винограда, включающий посадку изолированного экспланта на искусственную питательную среду по настоящему изобретению с последующим культивированием до появления дополнительных почек и корней.
Изоляция эксплантов проводится известными из уровня техники способами в соответствии со стандартными требованиями к работе с растительными культурами. Как правило, изоляцию проводят в асептической среде с использованием острых стерильных скальпелей, ножниц и пинцетов, работу осуществляют в ламинарных боксах на стерильных матах или в стерильных чашках Петри. В культуре тканей используются меристемы, верхушечные или боковые почки: изолированные или вместе с черенком длиной 1-2 см. Способы изолирования эксплантов, как и ткани, из которых изолируется эксплант, не влияют на получение технического результата и не являются существенными признаками заявленного способа.
Изолированные экспланты культивируют в асептических условиях в ростовых камерах для растений или, используя флуоресцентные или светодиодные лампы для растений в соответствии с известными из уровня техники способами культивирования in vitro винограда. Как правило, условия культивирования in vitro включают температурный и световой режим, а также интенсивность освещения и могут варьировать в зависимости от выбранного для культивирования сорта винограда. Заявленный способ предполагает, что при осуществлении будут использоваться известные оптимальные условия культивирования, которые не являются существенным признаком изобретения и не ограничивают объема прав настоящего изобретения.
Посадка или пересадка эксплантов осуществляют в асептических условиях стерильными инструментами с очисткой от некротических очагов, если они появились при механическом повреждении экспланта на предыдущем этапе работы.
В примерах осуществления заявленного способа культивирование включало инкубацию растений in vitro с соблюдением асептических условий или ex vitro в условиях ростовых камер или открытого грунта с укрытием в оптимальных для использованных сортов винограда условиях: температуре 23-25°С, освещенность в ростовой камере интенсивностью 60-74 мкмоль-м-2-с-1 (4500-5000 Люкс) в режиме 16 ч света и 8 ч темноты. Эти условия не являются ограничивающими для заявленной группы изобретений. При осуществлении заявленного способа для микроклонального размножения других сортов винограда могут использоваться другие условия культивирования в соответствии с известными из уровня техники оптимальными условиями культивирования выбранного сорта.
В результате осуществления заявленного способа получают растение, готовое к акклиматизации, что означает, что растение может быть переведено из стерильных условий in vitro в нестерильные условия ex vitro или в открытый грунт.
Перевод растений из культуры in vitro в культуру ex vitro проводят в соответствии с известными из уровня техники способами, как правило, пересадкой растений из асептических питательных сред в асептический грунт в условиях климатической камеры или в открытый грунт с поддержанием 70-80% влажности посредством укрытий светопроницаемым материалом на период полной акклиматизации растения и начала роста стебля и появления молодых листьев. Сроки акклиматизации сортоспецифичны: от 2 недель до 1 месяца (Фиг. 5). На рисунке растения в начале акклиматизации к ex vitro условиям культивирования. В результате осуществления заявленного способа получают растение, готовое к акклиматизации, что показано в Примерах осуществления настоящего изобретения, при этом способы перевода растений из культуры in vitro в культуру ex vitro не являются ограничивающими настоящее изобретения, известны из уровня техники и не влияют на технический результат. Предполагается, что специалист в данной области использует оптимальный для выбранного сорта способ перевода растений из культуры in vitro в культуру ex vitro.
В одном из вариантов осуществления изобретения эксплант дополнительно переносят в свежую питательную среду для подращивания растения в большем объеме, и большей высоты культуральной посуде, чтобы получить более зрелое растение для перевода ex vitro или при необходимости наращивания биомассы для дальнейшей работы со стерильными культурами клеток и эксплантами.
В другом варианте осуществления изобретения после появления дополнительных почек эксплант дополнительно черенкуют и для каждого черенка повторяют способ. Это дает возможность дополнительно размножить растение и получить оздоровленные, генетически идентичные клоны растения с сохранением сортовых характеристик исходного «материнского» растения.
При использовании способа по настоящему изобретению удалось культивировать и размножать in vitro виноград таких элитных сортов как Шардоне, Мальбек, Мерло и Рислинг. Способ не требует частых пассажей и переноса на разные среды в зависимости от состояния черенка и допускает культивирование без пассажей вплоть до перевода в нестерильные условия ex vitro без потери интенсивности роста, скорости укоренения, без истощения ресурсов растений и стресса. Растения, выращенные с использованием настоящего изобретения, имеют здоровый вид: яркие большие листья, хорошо развитую корневую систему и легко адаптируются к открытому грунту. При использовании заявленного способа микроклонального размножения с использованием одной искусственной питательной среды по настоящему изобретению растения можно через месяц уже акклиматизировать, корни на черенках формируются с разной интенсивностью уже через 2 недели, поэтому растения растут значительно быстрее.
Изобретение было направлено на создание способа микроклонального размножения элитных технических сортов винограда и искусственной питательной среды для осуществления этого способа, однако, поскольку элитные сорта винограда наиболее прихотливы, способ и питательная среда могут использоваться и при микроклональном размножении других сортов винограда, таких как, например, столовые сорта Кайтаги и Ахтамар (Дагестанской опытной станции ВИР).
Сущность и промышленная применимость изобретения поясняются следующими примерами, не ограничивающими объем прав настоящего изобретения:
Пример 1. Приготовление искусственной питательной среды
В питательную среду вносили следующие компоненты (в мг), макроэлементы: NH4NO3 370-400; СаСl2-2H2O 89-96; Ca(NO3)2 4H2O 460-171,26; KН2РО4 170-180; K2SO4 900-990; MgSO4 175-180,54; мезоэлементы: FeSO4-7H2O 27,5-32; Na2ЭДТА-2H2O 35-37,5; микроэлементы: CuSO4⋅5H2O 0,2-0,25; H3BO3 5,9-6,2; MnSO4-H2O 20-22,3; Na2MoO4⋅2H2O 0,20-0,25; ZnSO4⋅7H2O 8-8,6; витамины: мио-инозитол 100; никотиновая кислота 0,5; пиридоксина гидрохлорид 0,5; тиамина гидрохлорид 1; аскорбиновая кислота 200 400; сахароза 30000; α-нафтилуксусная кислота 0,2; 6-бензиламинопурин 0,2; глицин 2-3; уголь 2000; агар для твердых сред 6000; остальное бидистиллированная вода до 1000,0.
В начале объем раствора доводили до 0,5 л, титровали среду до рН 5,75 и добавляли 0,5 л воды с агаром, предварительно нагретой до кипения, для полного расплавления и растворения агара. Питательную среду разливали по сосудам и автоклавировали при давлении 0,7-1,0 атм (температура 119-121°С) в течение 20-25 мин. Экспланты высаживали после остывания среды.
Пример 2. Микроклональное размножение без смены питательной среды
Верхушечные или пазушные почки на черенке длиной 1-2 см отрезали острыми стерильными ножницами от растения in vitro в асептических условиях, переносили полученные черенки в свежую питательную среду, полученную, как описано в Примере 1, заглубляя на 0,5-1 см в среду, сохраняя природную полярность черенка. Банки асептически закрывали крышками и ставили культивироваться в ростовую камеру при 23-25°С, в режиме 16 ч света при интенсивности освещенности в ростовой камере 60-74 мкмоль-м-2-с-1 (4500-5000 Люкс) и 8 ч темноты.
При использовании искусственной питательной среды и способа микроклонального размножения по настоящей группе изобретений растения через месяц были готовы к акклиматизации, корни на черенках сформировались с разной интенсивностью уже через 2 недели, поэтому растения росли значительно быстрее, чем описано в уровне техники (Фиг. 1).
Пример 3. Сравнение микроклонального размножения винограда с использованием различных питательных сред
Для сравнения интенсивности роста и развития растений винограда элитных технических сортов на разных средах было проведено черенкование (изолирование) верхушечных почек винограда сортов Мерло и Шардоне и высаживание на следующие питательные среды:
1m) 1/2 MS с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП - рекомендованная среда для посадки первично изолированного экспланта на искусственную питательную среду in vitro по официальным рекомендациям компании Plant Cell Technology - одного из мировых лидеров продукции для микроклонального размножения [https://www.plantcelltechnolo-gy.com/blogan-effective-technique-to-micropropagation-of-grapes/, дата обращения 06.12.2023];
2m) 1/2 MS с добавлением 1 мг/л 6-БАП и ОД мг/л ИМК - среда, рекомендованная компанией Plant Cell Technology для роста и деления черенков винограда (https://www.plantcelltechnology.com/blogan-effective-technique-to-micropropagation-of-grapes/, дата обращения 06.12.2023);
3m) MS с добавлением 4 мг/л ПУК - среда, рекомендованная компанией Plant Cell Technology для укоренения (https://www.plantcelltechnology.com/blogan-effective-technique-to-micropropagation-of-grapes/, дата обращения 06.12.2023);
4 m) Среда для черенкования по патенту РФ № 2636030; и
5) искусственная питательная среда, приготовленная, как описано в Примере 1.
От растения винограда каждого сорта брали по 2-3 черенка на один тип среды. Черенки с верхушечными почками винограда длиной ~2 см погружали вертикально, сохраняя природную полярность, в одну из вышеуказанных питательных сред в культуральные банки объемом 250 мл, помещали банки с сохранением стерильности внутренней среды в ростовые камеры для растений при 25°С, камеры с подсветкой фитолампами работали в режиме 16 ч света с интенсивностью 70 мкмоль-м-2-с-1 и 8 ч темноты. Оценивали прирост листьев, корней через 2-3 недели культивирования, а также оценивали накопление антоциановых пигментов и хлорозов, свидетельствующее о стрессе растения, и образование каллусной ткани - дедифференцированных тотипотентных клеток растений (Фиг. 2). Экспланты, культивированные на средах сравнения, накапливали антоцианы, у них наблюдалось отмирание почек и хлороз, что свидетельствуют о неблагоприятном изменении физиологии и метаболизма растений из-за переживаемого стресса [Cui et al., 2017; Meggio et al., 2010].
Как видно на фотографиях на примере двух элитных технических сортов винограда уже через две недели развития на стандартных средах черенки накопили антоцианы, на некоторых листьях появился хлороз и отмирание верхней части побегов, при этом только на одной питательной среде (2 m) появился каллус на погруженной в питательную среду части побега, на остальных питательных средах ни каллуса, ни листьев, ни корней не образовывалось.
В то же время культивирование на искусственной питательной среде по настоящему изобретению дает превосходный по сравнению с другими питательными средами фенотип растений уже через 2 недели развития черенков (Фиг. 3).
Корни и листья появляются через 1-3 недели инкубации, сроки появления которых и интенсивность прироста сортоспецифичны: в описанных сортах быстрее всего развивается и укореняется Мерло: через неделю после посадки черенка наблюдается укоренение и подрост 1-4 новых листьев, медленнее других укореняется и развивается Шардоне. Сравнительная динамика развития растений на черенках, в качестве эксплантов элитных сортов винограда, приведена в таблице 1:
После укоренения растения на искусственной питательной среде по настоящему изобретению начинают интенсивно расти и легко акклиматизируются к условиям ex vitro (Фиг. 4, 5). Растения в искусственной питательной среде по настоящему изобретению активно развиваются и требуют переноса на свежую среду только при высыхании среды или исчерпании свободного объема банки. В лаборатории на искусственной питательной среде по настоящему изобретению проводилось микроклональное размножение верхушечных и пазушных почек винограда. Также в заявленной среде каллусные клетки дифференцируются и развиваются в целые растения.
Полученные результаты можно обобщить в таблице 2.
Явное превосходство искусственной питательной среды по настоящему изобретению для микроклонального размножения по сравнению с остальными питательными средами наблюдалось на четырех апробированных сортах: Мерло, Шардоне, Мальбек и Рислинг Элют. Использование заявленной группы изобретений привело к достижению технического результата: быстрому укоренению и росту черенков винограда 4 элитных сортов, готовые к акклиматизации здоровые растения винограда элитных сортов были получены через 1 месяц ведения культуры in vitro в одной питательной среде без пассажей.
Список литературы
1. Медведева Н.И., Поливара Н.В., Трошин Л.П. Особенности микроклонального размножения интродуцентов и клонов винограда // Научный журнал КубГАУ. - 2008. - №40. - С. 1-18.
2. Усенко Л.Н., Удалова З.В. Возрождение виноградарско-винодельческой отрасли как одно из перспективных направлений развития АПК России // Учет и статистика. - Т. 2017, №3. - С. 47.
3. Aazami М.А. Effect of some growth regulators on «in vitro» culture of two Vitis vinifera L. cultivars // Rom. Biotechnol. Letters. 2010. Vol. 15. - P. 55181-83111.
4. Al-Aizari A.A., Al-Obeed R., Mohamed M.A.H. Improving micropropagation of some grape cultivars via boron, calcium and phosphate // Electronic Journal of Biotechnology. - 2020. Vol. 48. P. 95-100. doi:10.1016/j.ejbt.2020.10.001
5. Anupa Т., Sahijram Т., Samarth L. et al. In vitro shoot induction ofthree grape (Vitis vinifera L.) varieties using nodal and axillary explants // The BioScan. - 2016. - Vol. 11, no. 1. - P. 201-204.
6. Bouquet A., Torregrosa L., Iocco P. et al. Grapevine (Vitis vinifera L.) // In: Agrobacterium Protocols Volume 2. Methods in Molecular Biology Ed. K. Wang. - Humana Press, Totowa, NJ, 2006. - Vol. 344, pp. 273-285. - doi: 10.1385/1-59745-131-2:273
7. Cohen P., Bacilieri R., Ramos-Madrigal J. et al. Ancient DNA from a lost Negev Highlands desert grape reveals a Late Antiquity wine lineage // Proc Natl Acad Sci USA. - 2023. - Vol. 120, no. 17. - e2213563120. - doi:10.1073/pnas.2213563120
8. Cui Z.H., Bi W.L., Hao X.Y. et al. Drought Stress Enhances Up-Regulation of Anthocyanin Biosynthesis in Grapevine leafroll-associated virus 3-Infected in vitro Grapevine (Vitis vinifera) Leaves // Plant Dis. - 2017. - Vol. 101, no. 9. - P. 1606-1615. - doi: 10.1094/PDIS-01-17-0104-RE
9. Doroshenko N., Puzirnova V., Troshin L. Optimization of grapevine clonal micropropagation // IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science. - 2021. - Vol. 937. - P. 022109. - doi: 10.1088/1755-1315/937/2/022109
10. Gascuel Q., Diretto G., Monforte A.J. et al. Use of Natural Diversity and Biotechnology to Increase the Quality and Nutritional Content of Tomato and Grape // Front Plant Sci. - 2017. - Vol. 8. - P. 652. - doi:10.3389/fpls.2017.00652
11. Heloir M.C., Fournioux J.C., Oziol L. et al. An improved procedure for the propagation in vitro of grapevine (Vitis vinifera cv. Pinot noir) using axillary bud microcuttings // Plant Cell, Tissue and Org Cult. 1997. Vol. 49. P. 223-225. doi.: 10.1023/A: 1005867908942
12. Kinfe В., Feyssa Т., Bedada G. In vitro micropropagation of grapevine (Vitis vinifera L.) from nodal culture // African Journal of Biotechnology. - 2017. - Vol. 16, no. 43. - P. 2083-2091.
13. Laimer M., Lemaire O.O., Herrbach E. et al. Resistance to viruses, phytoplasmas and their vectors in the grapevine in Europe: A review // Journal of Plant Pathology. - 2009. - Vol. 91, no. 1. - P. 7-23.
14. Malnoy M., Viola R., Jung M.H. et al. DNA-Free Genetically Edited Grapevine and Apple Protoplast Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins // Front. Plant Sci. 2016. - Vol. 7. - P. 1904: 1-1904: 9. - doi: 10.3389/fpls.2016.01904
15. Massonnet M., Cochetel N., Minio A. et al. The genetic basis of sex determination in grapes // Nat Commun. - 2020. - Vol. 11, no. 1. - 2902. - doi: 10.1038/s41467-020-16700-z
16. McGovern P.E. Ancient Wine: The Search for the Origins of Viniculture // Princeton University Press, 2003. - doi: 10.2307/j.ctvfjd0bk
17. Meggio F.F., Zarco-Tejada P.J., Nunez L.C. et al. Grape quality assessment in vineyards affected by iron deficiency chlorosis using narrow-band physiological remote sensing indices // Remote Sens Environ. - 2010. - Vol. 114, no. 9. - P. 1968-1986.
18. Migicovsky Z., Sawler J., Gardner K.M. et al. Patterns of genomic and phenomic diversity in wine and table grapes // Hortic Res. - 2017. - Vol. 4. - P. 17035. - doi: 10.1038/hortres.2017.35
19. Munir N., Safdar I., Naz S. Effect of induced mutation for varietal improvement in some local grapevine cultivars // J. Anim. Plant Sci. - 2015. - Vol.25, no. 1. - P. 234- 242.
20. Murashige Т., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. //Plant Physiology. 1962. T. 15. C. 473-497.
21. Myles S., Boyko A.R., Owens C.L. et al. Genetic structure and domestication history of the grape // Proc Natl Acad Sci USA. - 2011. - Vol. 108, no. 9. - P. 3530-3535. - doi: 10.1073/pnas. 1009363108
22. Ng S.Y.C., Thottappilly G., Rossel H.W. Tissue Culture in disease elimination and micropropagation // In: Biotechnology: Enhancing Research on Tropical Crops in Africa. G. Thottappilly, L.M. Monti, D.R. Mohan Raj, A.W. Moore (eds.). - IITA, Ibadan, Nigeria, 1992. - P. 171-182.
23. Nishitani С., Hirai N., Komori S. et al. Efficient Genome Editing in Apple Using a CRISPR/Cas9 system // Sci. Rep.-2016. Vol. 6. P. 31481:1-31481:8.
24. Osakabe Y., Liang Z., Ren C. et al. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in apple and grapevine // Nat. Protoc. - 2018. - Vol.13, no. 12. - P. 2844-2863. - doi:10.1038/s41596-018-0067-9
25. Perl A., Colova-Tsolova V., Eshdat Y. Agrobacterium-mediated transformation of grape embryogenic calli // In: Curtis, IS. (eds) Transgenic Crops of the World. - Springer, Dordrecht, 2004. - chapter 17. - P, 229-238. - doi: 10.1007/978-1-4020-2333-0
26. Pierozzi N.I., Moura M.F. Karyotype analysis in grapevines // Rev. Bras. Frutic. - 2016. - Vol. 38, no. 1. - P. 213-221. - doi: 10.1590/0100-2945-280/14.
27. Rathore J.S., Rathore V., Shekhawat N.S. et al. Micropropagation of woody plants // In: Plant biotechnology and molecular markers. Srivastava PS, Narula A, Srivastava S, editors. - Springer, Dordrecht, 2004. - p. 195-205. - doi: 10.1007/1-4020-3213-7 13
28. Ren C., Liu Y., Guo Y. et al. Optimizing the CRISPR/Cas9 system for genome editing in grape by using grape promoters // Hortic. Res. - 2021. - Vol. 8, no. 1. - P. 52:1-52:12. doi: 10.1038/s41438-021-00489-z
29. This P., Lacombe Т., Thomash M.R. Historical Origins and Genetic Diversity of Wine Grapes // Trends in Genetics: journal. - Cell Press, 2006. - Vol. 22, no. 9. - P. 511-519. - doi:10.1016/j.tig.2006.07.008
30. Thomas P. Microcutting leaf area, weight and position on the stock shoot influence root vigour, shoot growth and incidence of shoot tip necrosis in grape plantlets in vitro // Plant Cell Tissue Org Cult. - 2000. - Vol. 61. - P. 189-198. - doi: 10.1023/A: 1006425807853
31. Töpfer R., Trapp O. A cool climate perspective on grapevine breeding: climate change and sustainability are driving forces for changing varieties in a traditional market // Theor Appl Genet. - 2022. - Vol. 135, no. 2. - P. 3947-3960. - doi: 10.1007/s00122-022-04077-0
32. Winkler A.J., Cook J.A., Kliewer W.M. et al. General Viticulture // Barkley, CA: Univ. of California Press, 1974.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТЕНИЙ ВИНОГРАДА В КОЛЛЕКЦИИ IN VITRO | 2020 |
|
RU2760944C1 |
| Питательная среда для микроклонального размножения аралии континентальной Aralia continentalis Kitag | 2020 |
|
RU2751913C1 |
| Способ микроклонального размножения in vitro микрорастений картофеля сорта СОЛНЕЧНЫЙ | 2023 |
|
RU2814473C1 |
| СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ЧЕРЕЗ СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ НА СРЕДЕ АИ ДЛЯ ПЛАНТАЦИОННОГО ЛЕСОВЫРАЩИВАНИЯ | 2010 |
|
RU2456344C2 |
| СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ РАСТЕНИЙ ИЗ ТРУДНОПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЯН | 1995 |
|
RU2113111C1 |
| Способ микроклонального размножения картофеля | 2018 |
|
RU2702765C2 |
| Оптимизированная питательная среда для подвойного материала ВСВ-1, ВСЛ-1 и ВСЛ-2 в условиях in vitro | 2020 |
|
RU2748968C1 |
| СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ КОЛЛЕКЦИИ И ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕПОНИРОВАНИЯ ВИНОГРАДА IN VITRO | 2021 |
|
RU2764104C1 |
| СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO СОРТА ХОЗЯЮШКА | 2022 |
|
RU2789460C1 |
| СПОСОБ ОПТИМИЗАЦИИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА IN VITRO | 2003 |
|
RU2264706C2 |
Изобретения относятся к сельскому хозяйству. Искусственная питательная среда для микроклонального размножения винограда имеет pH 5,75 и содержит растворенные в дистиллированной или деионизованной воде компоненты в указанных концентрациях, мг/л, макроэлементы: NH4NO3 370-400; CaCl2⋅2H2O 89-96; Ca(NO3)2⋅4H2O 460-471,26; KH2PO4 170-180; K2SO4 900-990; MgSO4 175-180,54; мезоэлементы: FeSO4⋅7H2O 27,5-32; Na2ЭДТА⋅2H2O 35-37,5; микроэлементы: CuSO4⋅5H2O 0,2-0,25; H3BO3 5,9-6,2; MnSO4⋅H2O 20-22,3; Na2MoO4⋅2H2O 0,20-0,25; ZnSO4⋅7H2O 8-8,6; витамины: мио-инозитол 100; никотиновая кислота 0,5; пиридоксина гидрохлорид 0,5; тиамина гидрохлорид 1; аскорбиновая кислота 200-400; сахароза 30000; α-нафтилуксусная кислота 0,2; 6-бензиламинопурин 0,2; глицин 2-3; уголь 2000; агар для твёрдых сред 6000. Способ микроклонального размножения винограда включает посадку изолированного экспланта на искусственную питательную среду для микроклонального размножения винограда, имеющую pH 5,75, содержащую растворенные в дистиллированной или деионизованной воде компоненты в указанных концентрациях, мг/л, макроэлементы: NH4NO3 370-400; CaCl2⋅2H2O 89-96; Ca(NO3)2⋅4H2O 460-471,26; KH2PO4 170-180; K2SO4 900-990; MgSO4 175-180,54; мезоэлементы: FeSO4⋅7H2O 27,5-32; Na2ЭДТА⋅2H2O 35-37,5; микроэлементы: CuSO4⋅5H2O 0,2-0,25; H3BO3 5,9-6,2; MnSO4⋅H2O 20-22,3; Na2MoO4⋅2H2O 0,20-0,25; ZnSO4⋅7H2O 8-8,6; витамины: мио-инозитол 100; никотиновая кислота 0,5; пиридоксина гидрохлорид 0,5; тиамина гидрохлорид 1; аскорбиновая кислота 200-400; сахароза 30000; α-нафтилуксусная кислота 0,2; 6-бензиламинопурин 0,2; глицин 2-3; уголь 2000; агар для твёрдых сред 6000 с последующим культивированием до появления дополнительных почек и корней. Изобретения позволяют осуществить быстрое укоренение и рост черенка винограда элитных сортов, получить готовое к акклиматизации здоровое растение винограда элитных сортов через 1-2 месяца ведения культуры in vitro. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 3 пр.
1. Искусственная питательная среда для микроклонального размножения винограда, имеющая pH 5,75, содержащая растворенные в дистиллированной или деионизованной воде компоненты в указанных концентрациях, мг/л, макроэлементы: NH4NO3 370-400; CaCl2⋅2H2O 89-96; Ca(NO3)2⋅4H2O 460-471,26; KH2PO4 170-180; K2SO4 900-990; MgSO4 175-180,54; мезоэлементы: FeSO4⋅7H2O 27,5-32; Na2ЭДТА⋅2H2O 35-37,5; микроэлементы: CuSO4⋅5H2O 0,2-0,25; H3BO3 5,9-6,2; MnSO4⋅H2O 20-22,3; Na2MoO4⋅2H2O 0,20-0,25; ZnSO4⋅7H2O 8-8,6; витамины: мио-инозитол 100; никотиновая кислота 0,5; пиридоксина гидрохлорид 0,5; тиамина гидрохлорид 1; аскорбиновая кислота 200-400; сахароза 30000; α-нафтилуксусная кислота 0,2; 6-бензиламинопурин 0,2; глицин 2-3; уголь 2000; агар для твёрдых сред 6000.
2. Способ микроклонального размножения винограда, включающий посадку изолированного экспланта на искусственную питательную среду для микроклонального размножения винограда, имеющую pH 5,75, содержащую растворенные в дистиллированной или деионизованной воде компоненты в указанных концентрациях, мг/л, макроэлементы: NH4NO3 370-400; CaCl2⋅2H2O 89-96; Ca(NO3)2⋅4H2O 460-471,26; KH2PO4 170-180; K2SO4 900-990; MgSO4 175-180,54; мезоэлементы: FeSO4⋅7H2O 27,5-32; Na2ЭДТА⋅2H2O 35-37,5; микроэлементы: CuSO4⋅5H2O 0,2-0,25; H3BO3 5,9-6,2; MnSO4⋅H2O 20-22,3; Na2MoO4⋅2H2O 0,20-0,25; ZnSO4⋅7H2O 8-8,6; витамины: мио-инозитол 100; никотиновая кислота 0,5; пиридоксина гидрохлорид 0,5; тиамина гидрохлорид 1; аскорбиновая кислота 200-400; сахароза 30000; α-нафтилуксусная кислота 0,2; 6-бензиламинопурин 0,2; глицин 2-3; уголь 2000; агар для твёрдых сред 6000 с последующим культивированием до появления дополнительных почек и корней.
3. Способ микроклонального размножения винограда по п. 2, в котором эксплант дополнительно переносят на свежую питательную среду.
4. Способ микроклонального размножения винограда по п. 2 или 3, в котором после появления дополнительных почек эксплант дополнительно черенкуют.
| ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВВОДА И РЕГЕНЕРАЦИИ МЕРИСТЕМ ВИНОГРАДА В УСЛОВИЯ IN VITRO | 2016 |
|
RU2636030C2 |
| СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ КОЛЛЕКЦИИ И ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕПОНИРОВАНИЯ ВИНОГРАДА IN VITRO | 2021 |
|
RU2764104C1 |
| Телескопическая бурильная штанга | 1983 |
|
SU1180481A1 |
| CN 101426372 A, 06.05.2009. | |||
