ИЗМЕРЕНИЕ АТРИБУТА КАЧЕСТВА ПРОДУКТА Российский патент 2024 года по МПК G01N30/42 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США с регистрационным № 62/904682, поданной 23 сентября 2019 года; полное содержание данной заявки включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к системам и способам измерения атрибута качества продукта для образцов, включая образцы, собранные в системах непрерывного биопроизводства.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Клетки млекопитающих, содержащие нуклеиновую кислоту, которая кодирует рекомбинантный белок, часто применяют для получения белков, важных с терапевтической или коммерческой точки зрения. Интегрированное непрерывное биопроизводство представляет собой важный аспект снижения затрат, ассоциированных с терапевтическими средствами на основе таких белков. Системы мониторинга применяются в биопроизводстве для оценки различных биологических продуктов и условий технологического процесса.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Интегрированное непрерывное биопроизводство субстанций на основе терапевтических белков и других биологических молекул имеет огромный потенциал для получения в будущем жизненно важных лекарственных средств и усиления широкого внедрения видов терапии, которые опираются на доступность таких биологических молекул. Для биопроизводства в промышленном масштабе могут применяться двухколоночные и многоколоночные хроматографические системы, выполненные в ряде конфигураций. В таких системах анализ элюентов из хроматографических систем можно использовать для определения различных атрибутов качества продукта, чтобы контролировать и корректировать широкий спектр условий биопроцесса.

В настоящем изобретении описаны способы и системы для определения одного или нескольких атрибутов качества продукта для аналитов в биологических образцах, включая образцы, собранные в биореакторах, и автономные образцы, введенные в системы последовательно или параллельно. Могут быть измерены различные атрибуты качества продукта, включая без ограничения концентрацию аналита, варианты, отличающиеся зарядом аналита, или его гетерогенность, агрегацию аналита и целостность или чистоту аналита. Системы могут включать анализаторы образцов с различными типами хроматографических колонок, предназначенных для измерения конкретных атрибутов качества продукта. Измеренные атрибуты качества продукта могут использоваться для обеспечения обратной связи и контроля над параметрами и операциями, связанными с процессом биопроизводства.

В одном аспекте настоящее изобретение включает системы для измерения атрибута качества продукта для аналита биологического образца, при этом системы включают первое устройство для регулирования потока, устройство для очистки образцов, сообщающееся по текучей среде с первым устройством для регулирования потока, второе устройство для регулирования потока, сообщающееся по текучей среде с первым устройством для регулирования потока, с устройством для очистки образца и с первым и вторым анализаторами образцов, где первый анализатор образцов включает первую хроматографическую колонку и блок управления, соединенный с первым и вторым устройствами для регулирования потока и сконфигурированный таким образом, чтобы во время работы системы блок управления: (a) корректировал конфигурацию первого устройства для регулирования потока для направления части биологического образца из первого устройства для регулирования потока либо в устройство для очистки образцов, либо во второе устройство для регулирования потока таким образом, чтобы часть биологического образца принималась во втором устройстве для регулирования потока; (b) корректировал конфигурацию второго устройства для регулирования потока для направления части биологического образца в один из первого и второго анализаторов образцов; и (c) определял атрибут качества продукта для аналита биологического образца на основе анализа части биологического образца одним из первого и второго анализаторов образцов.

Варианты осуществления систем могут включать любой один или несколько из следующих признаков.

Первая хроматографическая колонка может представлять собой колонку для катионообменной хроматографии, колонку для эксклюзионной хроматографии или колонку для обращенно-фазовой хроматографии. Устройство для очистки образцов может включать колонку для аффинной хроматографии.

Второй анализатор образцов может включать детектор для количественного определения, выполненный с возможностью генерирования электрического сигнала, характеризующего количество аналита в биологическом образце. Первая хроматографическая колонка может сообщаться по текучей среде с детектором для количественного определения, и детектор для количественного определения может быть выполнен с возможностью генерирования электрического сигнала, характеризующего количество аналита в потоке элюата из первой хроматографической колонки.

Первый анализатор образцов может включать детектор для количественного определения, сообщающийся по текучей среде с первой хроматографической колонкой и выполненный с возможностью генерирования электрического сигнала, характеризующего количество аналита в потоке элюата из первой хроматографической колонки. Второй анализатор образцов может включать вторую хроматографическую колонку, при этом вторая хроматографическая колонка может отличаться от первой хроматографической колонки и может представлять собой колонку для катионообменной хроматографии, колонку для эксклюзионной хроматографии, колонку для обращенно-фазовой хроматографии и колонку для хроматографии гидрофильных взаимодействий.

Второе устройство для регулирования потока может сообщаться по текучей среде с третьим анализатором образцов, который включает третью хроматографическую колонку, при этом третья хроматографическая колонка может отличаться от первой и второй хроматографических колонок и может представлять собой колонку для катионообменной хроматографии, колонку для эксклюзионной хроматографии, колонку для обращенно-фазовой хроматографии и колонку для хроматографии гидрофильных взаимодействий.

Второе устройство для регулирования потока может сообщаться по текучей среде с четырьмя дополнительными анализаторами образцов, при этом каждый из четырех дополнительных анализаторов образцов включает хроматографическую колонку, отличную от первой хроматографической колонки и от хроматографических колонок остальных четырех дополнительных анализаторов образцов.

Атрибут качества продукта для аналита может представлять собой концентрацию аналита в биологическом образце, меру агрегации аналита в биологическом образце, меру вариантов, отличающихся зарядом, или гетерогенности аналита в биологическом образце или меру чистоты или целостности аналита в биологическом образце.

Колонка для аффинной хроматографии может представлять собой одну из следующих: колонку для хроматографии с белком A, колонку для хроматографии с белком G и колонку для связывания рецепторов. Аналит может включать белок (например, антитело) в биологическом образце.

Системы могут включать модуль управления колонками, сообщающийся по текучей среде с первым и вторым анализаторами образцов и со вторым устройством для регулирования потока и соединенный с блоком управления, где блок управления выполнен с возможностью корректирования конфигурации модуля управления колонками для направления части биологического образца в один из первого и второго анализаторов образцов.

Системы могут включать модуль управления колонками, сообщающийся по текучей среде с первым, вторым и третьим анализаторами образцов и со вторым устройством для регулирования потока и соединенный с блоком управления, где блок управления может быть выполнен с возможностью корректирования конфигурации модуля управления колонками для направления части биологического образца в один из первого, второго, третьего и четвертого анализаторов образцов.

Часть биологического образца может представлять собой первую часть, а атрибут качества продукта представлять собой первый атрибут качества продукта, и блок управления может быть выполнен так, чтобы во время работы системы блок управления: (d) корректировал конфигурацию первого устройства для регулирования потока для направления второй части биологического образца из первого устройства для регулирования потока либо в устройство для очистки образцов, либо во второе устройство для регулирования потока таким образом, чтобы вторая часть биологического образца принималась во втором устройстве для регулирования потока; (e) корректировал конфигурацию второго устройства для регулирования потока для направления второй части биологического образца в один из первого и второго анализаторов образцов, которые не получили первую часть биологического образца; и (f) определял второй атрибут качества продукта для аналита биологического образца на основе анализа второй части биологического образца одним из первого и второго анализаторов образцов, которые получили вторую часть биологического образца. Первый и второй атрибуты качества продукта могут быть разными, и каждый из первого и второго атрибутов качества продукта может быть выбран из группы, состоящей из концентрации аналита в биологическом образце, меры агрегации аналита в биологическом образце, меры отличающихся зарядом вариантов или гетерогенности аналита в биологическом образце и меры чистоты или целостности аналита в биологическом образце.

Часть биологического образца может представлять собой первую часть, и атрибут качества продукта может представлять собой первый атрибут качества продукта, и устройство управления может быть выполнено с возможностью повторения стадий (a)-(c) с другой частью биологического образца для определения двух различных атрибутов качества продукта для аналита биологического образца.

Часть биологического образца может представлять собой первую часть, и атрибут качества продукта может представлять собой первый атрибут качества продукта, и устройство управления может быть выполнено с возможностью повторения стадий (a)-(c) с двумя другими частями биологического образца для определения трех различных атрибутов качества продукта для аналита биологического образца.

Часть биологического образца может представлять собой первую часть, и атрибут качества продукта может представлять собой первый атрибут качества продукта, и устройство управления может быть выполнено с возможностью повторения стадий (a)-(c) с тремя другими частями биологического образца для определения четырех различных атрибутов качества продукта для аналита биологического образца.

Каждый атрибут качества продукта может быть выбран из группы, состоящей из концентрации аналита в биологическом образце, меры агрегации аналита в биологическом образце, меры отличающихся зарядом вариантов или гетерогенности аналита в биологическом образце и меры чистоты или целостности аналита в биологическом образце.

Системы могут включать устройство для отбора образцов, соединенное с блоком управления и выполненное с возможностью принятия биологического образца и доставки части биологического образца в первое устройство для регулирования жидкости. Устройство для отбора образцов может включать интерфейс контейнера, выполненный с возможностью принятия биологического образца в контейнер. Устройство для отбора образцов может включать жидкостный канал, выполненный с возможностью принятия биологического образца, и блок управления может быть выполнен таким образом, чтобы во время работы системы блок управления передавал сигнал на устройство для отбора образцов, чтобы привести к тому, чтобы устройство для отбора образцов выпускало часть биологического образца из жидкостного канала в первое устройство для регулирования потока.

Системы могут включать насос, сообщающийся по текучей среде со вторым устройством для регулирования потока, с первым и вторым анализаторами образцов и с первым и вторым буферными резервуарами, связанными соответственно с первым и вторым анализаторами образцов, где блок управления и насос выполнены таким образом, чтобы во время работы системы насос доставлял буферный раствор в один из первого или второго анализаторов образцов из соответствующего ассоциированного буферного резервуара, когда часть биологического образца направляется в один из первого или второго анализаторов образцов.

Системы могут включать насос, сообщающийся по текучей среде со вторым устройством для регулирования потока, с первым, вторым и третьим анализаторами образцов и с первым, вторым и третьим буферными резервуарами, связанными соответственно с первым, вторым и третьим анализаторами образцов, где блок управления и насос выполнены таким образом, чтобы во время работы системы насос доставлял буферный раствор в один из первого, второго и третьего анализаторов образцов из соответствующего связанного буферного резервуара, когда часть биологического образца направляется в один из первого, второго и третьего анализаторов образцов.

Системы могут включать насос, сообщающийся по текучей среде со вторым устройством для регулирования потока, первым анализатором образцов и с буферным резервуаром, связанным с первым анализатором образцов, где первая хроматографическая колонка представляет собой колонку для катионообменной хроматографии, и где блок управления и насос выполнены таким образом, чтобы во время работы системы насос доставлял ацетатный буфер в первую хроматографическую колонку для распространения части биологического образца по первой хроматографической колонке. Ацетатный буфер может характеризоваться значением рН 4,0 или меньше.

Биологический образец может представлять собой среду для сбора материала, извлеченную из биореактора. Биологический образец может представлять собой промежуточный продукт или раствор продукта биопроизводственной системы. Биологический образец может представлять собой часть клеточной культуры.

Детектор для количественного определения может включать детектор с диодной матрицей, спектрометрический детектор, выполненный с возможностью измерения информации о коэффициенте поглощения части биологического образца, флуоресцентный детектор и/или масс-спектрометрический детектор.

Варианты осуществления систем также могут иметь любые другие признаки, описанные в данном документе, в том числе любые комбинации признаков, которые раскрыты отдельно в разных вариантах осуществления, если явно не указано иное.

В другом аспекте настоящее изобретение включает системы для измерения атрибутов качества продукта для аналита биологического образца, системы, включающие первое устройство для регулирования потока, устройство для очистки образцов, которое включает колонку для очистительной хроматографии, сообщающуюся по текучей среде с первым устройством для регулирования потока, второе устройство для регулирования потока, сообщающееся по текучей среде с первым устройством для регулирования потока и с устройством для очистки образцов, первый анализатор образцов, который включает первую хроматографическую колонку, сообщающуюся по текучей среде со вторым устройством для регулирования потока, второй анализатор образцов, который включает вторую хроматографическую колонку, сообщающуюся по текучей среде со вторым устройством для регулирования потока, третий анализатор образцов, который включает третью хроматографическую колонку, сообщающуюся по текучей среде со вторым устройством для регулирования потока, четвертый анализатор образцов, который включает детектор для количественного определения, и блок управления, соединенный с первым и вторым устройствами для регулирования потока и выполненный таким образом, чтобы во время работы системы блок управления: (a) корректировал конфигурацию первого устройства для регулирования потока для направления первой части биологического образца из первого устройства для регулирования потока либо в устройство для очистки образцов, либо во второе устройство для регулирования потока таким образом, чтобы часть биологического образца принималась во втором устройстве для регулирования потока; (b) корректировал конфигурацию второго устройства для регулирования потока для направления первой части биологического образца в один из первого, второго, третьего и четвертого анализаторов образцов; (c) определял первый атрибут качества продукта для аналита биологического образца на основе анализа части биологического образца одним из первого, второго, третьего и четвертого анализаторов образцов; и (d) повторял стадии (а)-(с) с тремя дополнительными частями биологического образца с корректировкой конфигурации второго устройства для регулирования потока так, чтобы каждая часть биологического образца направлялась в другой анализатор образцов, с определением в общей сложности четырех атрибутов качества продукта для аналита биологического образца.

Варианты осуществления систем могут включать любой один или несколько из следующих признаков.

Каждый из четырех атрибутов качества продукта может быть отличным от остальных. Каждая из первой, второй и третьей хроматографических колонок может представлять собой колонку отличного типа. Первая хроматографическая колонка может представлять собой колонку для катионообменной хроматографии, вторая хроматографическая колонка может представлять собой колонку для эксклюзионной хроматографии, а третья хроматографическая колонка может представлять собой колонку для обращенно-фазовой хроматографии или колонку для хроматографии гидрофильных взаимодействий.

Первый анализатор образцов может определять информацию о мере отличающихся зарядом вариантов или гетерогенности аналита в биологическом образце, второй анализатор образцов может определять информацию о мере агрегации аналита в биологическом образце, третий анализатор образцов может определять информацию о мере чистоты или целостности аналита в биологическом образце, а четвертый анализатор образцов может определять информацию о концентрации аналита в биологическом образце.

Четыре атрибута качества продукта могут включать меру отличающихся зарядом вариантов или гетерогенности аналита в биологическом образце, меру агрегации аналита в биологическом образце, меру чистоты или целостности аналита в биологическом образце и концентрацию аналита в биологическом образце. Первая хроматографическая колонка может представлять собой колонку для катионообменной хроматографии, вторая хроматографическая колонка может представлять собой колонку для эксклюзионной хроматографии, а третья хроматографическая колонка может представлять собой колонку для обращенно-фазовой хроматографии.

Устройство для очистки образцов может включать колонку для аффинной хроматографии. Аналит может включать белок в биологическом образце. Белок может включать антитело в биологическом образце.

Системы могут включать модуль управления колонками, сообщающийся по текучей среде с первым, вторым и третьим анализаторами образцов и со вторым устройством для регулирования потока и соединенный с блоком управления, где блок управления выполнен с возможностью корректирования конфигурации модуля управления колонками для направления части биологического образца в один из первого, второго и третьего анализаторов образцов. Системы могут включать устройство для отбора образцов, соединенное с блоком управления и выполненное с возможностью принятия биологического образца и доставки части биологического образца в первое устройство для регулирования жидкости.

Детектор для количественного определения может включать одно из следующего: детектор с диодной матрицей, спектрометрический детектор, выполненный с возможностью измерения информации о коэффициенте поглощения части биологического образца, флуоресцентный детектор и масс-спектрометрический детектор.

Варианты осуществления систем также могут иметь любые другие признаки, описанные в данном документе, в том числе любые комбинации признаков, которые раскрыты отдельно в разных вариантах осуществления, если явно не указано иное.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение включает способы измерения атрибутов качества продукта для аналита биологического образца, при этом способы включают получение биологического образца путем извлечения биологического образца из функционирующего биореактора или из устройства для очистки, сообщающегося по текучей среде с функционирующим биореактором, направление первой части биологического образца в первый анализатор образцов и получение информации о первом атрибуте качества продукта для аналита биологического образца путем анализа первой части биологического образца в первом анализаторе образцов, направление второй части биологического образца во второй анализатор образцов и получение информации о втором атрибуте качества продукта для аналита биологического образца путем анализа второй части биологического образца во втором анализаторе образцов, где первый и второй атрибуты качества продукта различны, и где по меньшей мере один из первого и второго атрибутов качества продукта включает меру отличающихся зарядом вариантов или гетерогенности аналита в биологическом образце, меру агрегации аналита в биологическом образце, меру чистоты или целостности аналита в биологическом образце и концентрацию аналита в биологическом образце.

Варианты осуществления способов также могут иметь любые другие признаки, описанные в данном документе, в том числе любые комбинации признаков, которые раскрыты отдельно в разных вариантах осуществления, если явно не указано иное.

Определения

Термин "технологическая операция" является термином из области техники и означает функциональную стадию, которую можно осуществлять согласно способу изготовления лекарственного вещества на основе терапевтического белка из жидкой культуральной среды. Например, технологическая операция может представлять собой фильтрацию (например, удаление загрязняющих бактерий, дрожжей, вирусов или микобактерий и/или твердых частиц из текучей среды, содержащей рекомбинантный терапевтический белок), захват, удаление эпитопной метки, очистку, выдерживание или хранение, доочистку, инактивацию вирусов, регуляцию концентрации ионов и/или значения pH текучей среды, содержащей рекомбинантный терапевтический белок, и удаление нежелательных солей.

Термин "цикл хроматографии" или "хроматографический цикл" является термином из области техники и означает все стадии, выполняемые в одном цикле хроматографии с использованием одной хроматографической колонки. Например, цикл хроматографии может включать стадию уравновешивания хроматографической колонки с помощью буфера, стадию пропускания образца, включающего рекомбинантный белок, через хроматографическую колонку, стадию элюирования рекомбинантного белка из хроматографической колонки и промывки хроматографической колонки посредством пропускания денатурирующего буфера через колонку. Дополнительные примеры стадий, выполняемых в цикле хроматографии, описаны в данном документе. Другие примеры стадий, выполняемых в цикле хроматографии, также хорошо известны в данной области техники.

Термин "захват" означает стадию, осуществляемую для частичной очистки или выделения (например, обеспечения по меньшей мере или приблизительно 5%, например, по меньшей мере или приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или по меньшей мере или приблизительно 95% чистоты по весу), концентрирования и стабилизации рекомбинантного терапевтического белка от одного или нескольких других компонентов, присутствующих в жидкой культуральной среде или разбавленной жидкой культуральной среде (например, белков культуральной среды или одного или нескольких других компонентов (например, ДНК, РНК или других белков), присутствующих в клетке млекопитающего или секретируемых ею). Как правило, захват осуществляют с применением смолы, которая связывает рекомбинантный терапевтический белок (например, путем применения аффинной хроматографии). Неограничивающие способы захвата рекомбинантного терапевтического белка из жидкой культуральной среды или разбавленной жидкой культуральной среды описаны в данном документе, а другие известны из уровня техники. Рекомбинантный терапевтический белок можно захватывать из жидкой культуральной среды с применением по меньшей мере одной хроматографической колонки и/или хроматографической мембраны (например, любой из хроматографических колонок и/или хроматографических мембран, описанных в данном документе).

Термин "очистка" означает стадию, осуществляемую для отделения рекомбинантного терапевтического белка от одной или нескольких других примесей (например, объемных примесей) или компонентов, присутствующих в текучей среде, содержащей рекомбинантный терапевтический белок (например, белков жидкой культуральной среды или одного или нескольких других компонентов (например, ДНК, РНК, других белков, эндотоксинов, вирусов и т. д.), присутствующих в клетке млекопитающего или секретируемых ею). Например, очистку можно осуществлять во время или после стадии первичного захвата. Очистку можно осуществлять с применением смолы, мембраны или любой другой твердой подложки, которая связывает либо рекомбинантный терапевтический белок, либо загрязнители (например, путем применения аффинной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий, анионо- или катионообменной хроматографии или хроматографии на молекулярных ситах). Рекомбинантный терапевтический белок можно очищать из текучей среды, содержащей рекомбинантный терапевтический белок, с применением по меньшей мере одной хроматографической колонки и/или хроматографической мембраны (например, любой из хроматографических колонок или хроматографических мембран, описанных в данном документе).

Термин "доочистка" является термином из области техники и означает стадию, осуществляемую для удаления оставшихся следовых или небольших количеств загрязнителей или примесей из текучей среды, содержащей рекомбинантный терапевтический белок, т. е. приближающую ее к окончательной необходимой чистоте. Например, доочистку можно осуществлять пропусканием текучей среды, содержащей рекомбинантный терапевтический белок, через хроматографическую(-ие) колонку(-и) или мембранный(-ые) поглотитель(-и), которые селективно связываются либо с целевым рекомбинантным терапевтическим белком, либо с небольшими количествами загрязнителей или примесей, присутствующих в текучей среде, содержащей рекомбинантный терапевтический белок. В таком примере элюат/фильтрат хроматографической(-их) колонки(-ок) или мембранного(-ых) поглотителя(-ей) содержит рекомбинантный терапевтический белок.

Термин "фильтрация" означает удаление по меньшей мере части (например, по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) нежелательных биологических загрязнителей (например, клеток млекопитающих, бактерий, дрожжевых клеток, вирусов или микобактерий) и/или твердых частиц (например, осажденных белков) из жидкости (например, жидкой культуральной среды или текучей среды, находящихся в любой из систем или процессов, описанных в данном документе).

Термин "элюат/фильтрат" является термином из области техники и означает текучую среду, выходящую из хроматографической колонки или хроматографической мембраны, которая содержит выявляемое количество рекомбинантного терапевтического белка.

Термин "выделять" или "выделение" в определенных контекстах означает по меньшей мере частичную очистку или очистку (например, по меньшей мере или приблизительно 5%, например по меньшей мере или приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или по меньшей мере или приблизительно 95% чистоты по массе) рекомбинантного белка от одного или нескольких других компонентов, присутствующих в фильтрате (например, фильтрате, полученном с использованием описанных в данном документе способов), например от одного или нескольких компонентов ДНК, РНК и/или других белков, присутствующих в фильтрате. Неограничивающие способы выделения белка из фильтрата описаны в данном документе, а остальные известны из уровня техники.

Термин "интегрированный способ" означает способ, который осуществляют с применением структурных элементов, которые функционируют совместно для обеспечения конкретного результата (например, получения лекарственного вещества на основе терапевтического белка из жидкой культуральной среды).

Термин "непрерывный способ" означает способ, при котором текучая среда непрерывно транспортируется через по меньшей мере часть системы. Например, в любой из иллюстративных систем непрерывного биологического производства, описанных в данном документе, жидкая культуральная среда, содержащая рекомбинантный терапевтический белок, непрерывно подается в систему во время ее работы, и из системы выводится лекарственное вещество на основе терапевтического белка. В другом примере непрерывный способ представляет собой способ, при котором жидкую культуральную среду, содержащую рекомбинантный терапевтический белок, непрерывно подают из биореактора через первую MCCS. Другим примером непрерывного способа является способ, при котором жидкую культуральную среду, содержащую рекомбинантный терапевтический белок, непрерывно подают из биореактора через первую и вторую MCCS. Дополнительные примеры включают способ, при котором жидкую культуральную среду, содержащую рекомбинантный терапевтический белок, непрерывно подают через первую MCCS, способ, при котором жидкую культуральную среду, содержащую рекомбинантный терапевтический белок, непрерывно подают через первую и вторую MCCS, или способ, при котором жидкую культуральную среду, содержащую рекомбинантный терапевтический белок, непрерывно подают через вторую MCCS.

Термин "система биологического производства" или "биопроизводственная система" относится к системе для получения биологического лекарственного средства.

Термин "биологическое лекарственное средство" означает любое терапевтическое вещество, произведенное или полученное из живого организма или его продуктов, которое применяют в предупреждении, диагностике или лечении патологии. Таким образом, биологическое лекарственное средство или биологический фармацевтический препарат представляет собой лекарственное средство для медицинского применения, полученное с применением биотехнологии, например белок (например, рекомбинантный терапевтический белок) или нуклеиновую кислоту (ДНК, РНК или антисмысловые олигонуклеотиды), применяемые для терапевтических или диагностических целей in vivo.

Термин "система для многоколоночной хроматографии" или "MCCS" означает систему из суммарно двух или больше взаимосвязанных или переключающихся хроматографических колонок и/или хроматографических мембран. Неограничивающим примером системы для многоколоночной хроматографии является система для периодической противоточной хроматографии (PCC), содержащая суммарно две или больше взаимосвязанных или переключающихся хроматографических колонок и/или хроматографических мембран. Дополнительные примеры систем для многоколоночной хроматографии описаны в данном документе и известны из уровня техники.

Термин "клетка млекопитающего" означает любую клетку любого млекопитающего или любую клетку, полученную из любого млекопитающего (например, человека, хомяка, мыши, зеленой мартышки, крысы, свиньи, коровы или кролика). В некоторых вариантах осуществления клетка млекопитающего может представлять собой, например, иммортализованную клетку, дифференцированную клетку или недифференцированную клетку.

Термин "клеточная культура" означает множество клеток млекопитающих (например, любых клеток млекопитающих, описанных в данном документе), суспендированных в жидкой культуральной среде (например, в любой из описанных в данном документе жидких культуральных сред). Клеточная культура может характеризоваться плотностью клеток более чем приблизительно 0,1×10⁶ клеток/мл (например, более чем приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 15×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 20×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 25×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 30×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 35×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 40×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 45×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 50×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 55×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 60×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 65×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 70×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 75×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 80×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 85×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 90×10⁶ клеток/мл, более чем приблизительно 95×10⁶ клеток/мл или более чем приблизительно 100×10⁶ клеток/мл).

Термин "культивирование" или "культивирование клетки" означает поддержание или выращивание клетки млекопитающего в жидкой культуральной среде при совокупности контролируемых физических условий.

Термин "жидкая культуральная среда" означает текучую среду, которая содержит достаточно питательных веществ для обеспечения роста клетки млекопитающего в среде in vitro. Например, жидкая культуральная среда может содержать одно или несколько из аминокислот (например, 20 аминокислот), пурина (например, гипоксантина), пиримидина (например, тимидина), холина, инозитола, тиамина, фолиевой кислоты, биотина, кальция, никотинамида, пиридоксина, рибофлавина, тимидина, цианокобаламина, пирувата, липоевой кислоты, магния, глюкозы, натрия, калия, железа, меди, цинка, селена и других необходимых микроэлементов и бикарбоната натрия. Жидкая культуральная среда может содержать сыворотку крови млекопитающего. В некоторых случаях жидкая культуральная среда не содержит сыворотку крови или другой продукт, извлеченный из организма млекопитающего (жидкая культуральная среда с определенным составом). Жидкая культуральная среда может содержать следовые количества металлов, гормон роста млекопитающих и/или фактор роста млекопитающих. В данном документе описаны неограничивающие примеры жидкой культуральной среды, и дополнительные примеры известны в данной области техники и коммерчески доступны.

Термин "иммуноглобулин" означает полипептид, содержащий аминокислотную последовательность из по меньшей мере 15 аминокислот (например, по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 аминокислот) белка-иммуноглобулина (например, последовательность вариабельного домена, последовательность каркаса или последовательность константного домена). Иммуноглобулин может включать, например, по меньшей мере 15 аминокислот из легкой цепи иммуноглобулина, например, по меньшей мере 15 аминокислот из тяжелой цепи иммуноглобулина. Иммуноглобулин может представлять собой выделенное антитело (например, IgG, IgE, IgD, IgA или IgM). Иммуноглобулин может относиться к подклассу IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). Иммуноглобулин может представлять собой фрагмент антитела, например, Fab-фрагмент, F(ab′)2-фрагмент или scFv-фрагмент. Иммуноглобулин также может представлять собой биспецифическое антитело или триспецифическое антитело, или димерное, тримерное или мультимерное антитело, или диатело, Affibody®, или Nanobody®. Иммуноглобулин также может представлять собой сконструированный белок, содержащий по меньшей мере один домен иммуноглобулина (например, слитый белок). Неограничивающие примеры иммуноглобулинов описаны в данном документе, а дополнительные примеры иммуноглобулинов известны из уровня техники.

Термины "рекомбинантный терапевтический белок" или "рекомбинантный белок" относятся к любому терапевтическому белку, полученному посредством технологии с применением рекомбинантной ДНК. В контексте данного документа "рекомбинантный терапевтический белок" включает, например, антитело или фрагмент антитела, фермент, сконструированный белок или иммуногенный белок или фрагмент белка.

Термин "фрагмент белка" или "фрагмент полипептида" означает часть полипептидной последовательности длиной по меньшей мере или приблизительно 4 аминокислоты, по меньшей мере или приблизительно 5 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 6 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 7 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 8 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 9 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 10 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 11 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 12 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 13 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 14 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 15 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 16 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 17 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 18 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 19 аминокислот или по меньшей мере или приблизительно 20 аминокислот, или длиной более 20 аминокислот. Фрагмент рекомбинантного белка можно получать с применением любого из способов, описанных в данном документе.

Термин "сконструированный белок" означает полипептид, который в естественных условиях не кодируется эндогенной нуклеиновой кислотой, находящейся в организме (например, млекопитающего). Примеры сконструированных белков включают ферменты (например, с одной или несколькими аминокислотными заменами, делециями, вставками или добавлениями, которые приводят к повышенной стабильности и/или каталитической активности сконструированного фермента), слитые белки, антитела (например, бивалентные антитела, тривалентные антитела или диатело) и антигенсвязывающие белки, которые содержат по меньшей мере одну рекомбинантную последовательность остова.

Термин "секретируемый белок" или "секретируемый рекомбинантный белок" означает белок (например, рекомбинантный белок), который изначально содержал по меньшей мере одну сигнальную последовательность секреции при его трансляции внутри клетки млекопитающего, и в результате по меньшей мере частичного ферментативного отщепления данной сигнальной последовательности секреции в клетке млекопитающего он секретируется, по меньшей мере частично, во внеклеточное пространство (например, жидкую культуральную среду). "Секретируемый" белок не должен быть полностью отделен от клетки, чтобы считаться секретируемым белком.

Термин "перфузионный биореактор" означает биореактор, содержащий множество клеток (например, клеток млекопитающих) в первой жидкой культуральной среде, где культивирование клеток, находящихся в биореакторе, включает периодическое или непрерывное удаление первой жидкой культуральной среды и, одновременно или вскоре после удаления, добавление в биореактор практически такого же объема второй жидкой культуральной среды. В некоторых примерах постепенно изменяют (например, увеличивают или уменьшают) объем первой жидкой культуральной среды, удаляемой и добавляемой в течение дискретных периодов (например, периода, составляющего приблизительно 24 часов, периода, составляющего от приблизительно 1 минуты до приблизительно 24 часов, или периода, составляющего более 24 часов), в ходе периода культивирования (например, скорость ежедневной подпитки культуральной средой). Доля среды, удаляемой и заменяемой каждый день, может меняться в зависимости от конкретных клеток, подлежащих культивированию, исходной плотности посева и плотности клеток в конкретный момент времени. "RV" или "объем реактора" означает объем культуральной среды, имеющийся в начале процесса культивирования (например, общий объем культуральной среды, имеющийся после посева).

Термин "биореактор периодического действия с подпиткой" является термином из области техники и означает биореактор, содержащий множество клеток (например, клеток млекопитающих) в первой жидкой культуральной среде, где культивирование клеток, присутствующих в биореакторе, включает периодическое или непрерывное добавление второй жидкой культуральной среды в первую жидкую культуральную среду без существенного или значительного удаления первой жидкой культуральной среды или второй жидкой культуральной среды из культуры клеток. Вторая жидкая культуральная среда может быть такой же, как и первая жидкая культуральная среда. В некоторых примерах культуры с периодической подпиткой вторая жидкая культуральная среда представляет собой концентрированную форму первой жидкой культуральной среды. В некоторых примерах культуры с периодической подпиткой вторую жидкую культуральную среду добавляют в виде сухого порошка.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при практическом осуществлении или тестировании рассматриваемого в данном документе объекта изобретения можно применять способы и материалы, сходные с описанными в данном документе или эквивалентные им, ниже описаны только подходящие способы и материалы. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включены с помощью ссылки во всей своей полноте. В случае противоречий настоящее описание, в том числе определения, будут иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Подробности одного или нескольких вариантов осуществления изложены на прилагаемых графических материалах и в описании ниже. Другие признаки и преимущества будут очевидны из описания, графических материалов и формулы изобретения.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 представлено схематическое изображение примера системы для определения атрибутов качества продукта для аналита биологического образца.

На фиг. 2 представлено схематическое изображение модуля управления образцами.

На фиг. 3 представлена блок-схема, демонстрирующая набор примеров стадий для определения атрибутов качества продукта для аналита биологического образца.

На фиг. 4A-4C представлены схематические изображения, демонстрирующие примерные конфигурации устройств для регулирования потока.

На фиг. 5А представлен график, демонстрирующий хроматограммы в отношении титров для нескольких образцов.

На фиг. 5B представлена таблица, демонстрирующая рассчитанные массовые нагрузки и концентрации для нескольких образцов.

На фиг. 6А представлен график, демонстрирующий хроматограммы в отношении титра для нескольких образцов.

На фиг. 6B представлен набор таблиц с информацией об измеренных пиках для различных образцов.

На фиг. 7 представлен график, демонстрирующий измеренные хроматограммы для набора образцов.

На фиг. 8 представлено схематическое изображение, демонстрирующее пример системы биопроизводства.

На фиг. 9 представлено схематическое изображение, демонстрирующее пример методики переключения трех колонок.

На фиг. 10 представлен график, на котором сравнивают три способа определения титра (MIMICS-mPQA синим цветом; CEDEX™ Bioanalyzer красным цветом; Octet зеленым цветом) для биореактора терапевтического моноклонального антитела объемом 100 л. Все нанесенные на график точки данных кривой MIMICs-mPQA представляли собой данные о замороженных собранных образцах. Пробелы в данных представляют образцы, которые не были проанализированы.

На фиг. 11 представлен график, на котором сравнивают три способа определения титра (MIMICS-mPQA синим цветом; CEDEX™ Bioanalyzer красным цветом; Octet зеленым цветом) для биореактора терапевтического моноклонального антитела объемом 3 л (V09). Все нанесенные на график точки данных кривой MIMICs-mPQA представляли собой данные о замороженных собранных образцах. Пробелы в данных представляют образцы, которые не были проанализированы.

На фиг. 12 представлен график, на котором сравнивают три способа определения титра (MIMICS-mPQA синим цветом; CEDEX™ Bioanalyzer красным цветом; Octet зеленым цветом) для биореактора терапевтического моноклонального антитела объемом 3 л (V12). Все нанесенные на график точки данных кривой MIMICs-mPQA представляли собой данные о замороженных собранных образцах. Пробелы в данных представляют образцы, которые не были проанализированы.

На фиг. 13 представлен график, на котором сравнивают два способа агрегации (MIMICS-mPQA и автономный способ) для биореактора терапевтического моноклонального антитела объемом 100 л. На графике сравнивают два результата анализа: процентная доля мономера и процентная доля высокомолекулярных (HMW) соединений. Все нанесенные на график точки данных кривой MIMICS-mPQA представляли собой данные от замороженных собранных образцов. Пробелы в данных представляют образцы, которые не были проанализированы.

На фиг. 14 представлен график, на котором сравнивают два способа агрегации (MIMICS-mPQA и автономный способ) для биореактора терапевтического моноклонального антитела объемом 3 л (V09). На графике сравнивают два результата анализа: процентная доля мономера и процентная доля высокомолекулярных (HMW) соединений. Все нанесенные на график точки данных кривой MIMICS-mPQA представляли собой данные от замороженных собранных образцов. Пробелы в данных представляют образцы, которые не были проанализированы.

На фиг. 15 представлен график, на котором сравнивают два способа агрегации (MIMICS-mPQA и автономный способ) для биореактора терапевтического моноклонального антитела объемом 3 л (V12). На графике сравнивают два результата анализа: процентная доля мономера и процентная доля высокомолекулярных (HMW) соединений. Все нанесенные на график точки данных кривой MIMICS-mPQA представляли собой данные от замороженных собранных образцов. Пробелы в данных представляют образцы, которые не были проанализированы.

На фиг. 16 представлен график, на котором сравнивают два способа очистки (MIMICS-mPQA и автономный способ) для всех биореакторов (100 л, 3 л V09, 3 л V12) с терапевтическим моноклональным антителом в отношении общего % чистоты. Все нанесенные на график точки данных кривой MIMICS-mPQA представляли собой данные от замороженных собранных образцов. Пробелы в данных представляют образцы, которые не были проанализированы.

Подобные символы на графических материалах обозначают подобные элементы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Введение

Биопроизводство в промышленных масштабах может осуществляться в двух- и многоколоночных хроматографических системах, выполненных в различных конфигурациях. В этих сложных системах показатели выхода, качества продукта и отходов зависят от большого количества параметров, связанных с технологическим процессом, и стадий. Во ходе получения терапевтических белков и других коммерчески ценных биомолекул эти параметры и стадии могут значительно влиять на конечные характеристики продукта. Следовательно, соответствующий контроль над такими параметрами и стадиями является важным аспектом крупномасштабного производства. Особенности и аспекты систем биопроизводства раскрыты, например, в публикации РСТ-заявки на патент № WO 2014/137903, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

Осуществлению надлежащего контроля над параметрами биопроизводства, включая автоматизированный контроль, способствует мониторинг собранного материала из биореактора, промежуточных потоков растворов и/или продуктов. Традиционные методики мониторинга включают, например, измерения коэффициента поглощения в УФ-диапазоне.

К сожалению, такие способы могут быть подвержены дрифту показаний в течение периодов измерения, соответствующих нескольким дням, ввиду таких факторов, как температура, влажность, значения интенсивности окружающего света и локальная неоднородность образцов. Кроме того, такие способы могут не позволять вычислять или определять иным образом множество количественных значений. В сложных биопроизводственных средах обычно оценивается множество количественных значений, чтобы обеспечить подходящую информацию обратной связи для корректировки параметров процесса.

Настоящее изобретение включает системы и способы, которые можно использовать для определения значений множества атрибутов качества продукта. Системы могут быть реализованы как системы двумерной хроматографии. В первом измерении системы часть биологического образца может быть необязательно очищена с использованием устройства для очистки образцов, которое может включать хроматографическую колонку. Во втором измерении системы часть образца затем может быть направлена в один из нескольких различных анализаторов образцов для определения атрибута качества продукта для образца. Дополнительные части образца могут быть направлены в отличные анализаторы образцов для определения отличных атрибутов качества продукта для образца.

Системы анализа атрибутов качества продукта

На фиг. 1 представлено схематическое изображение, демонстрирующее пример системы измерения 100 для измерения множетсва атрибутов качества продукта. Система 100 включает модуль управления образцами 102, первый насос 104 (например, бинарный насос), первое устройство для регулирования потока 106, устройство для очистки образцов 108, второе устройство для регулирования потока 110, модуль управления колонками 112, множество анализаторов образцов 114a-114d, детектор 116, второй насос 118 (например, четвертичный насос), резервуары растворителя/буфера 120a-120d и блок управления 122. Модуль управления образцами 102, насос 104, первое устройство для регулирования потока 106, второе устройство для регулирования потока 110, модуль управления колонками 112 и детектор 116 могут быть соединены с блоком управления 122 через линии связи 124a-124g.

Во время работы модуль управления образцами 102 получает биологический образец для анализа. Модуль управления образцами 102 может быть реализован различными способами. В некоторых вариантах осуществления, например, модуль управления образцами включает приемник в виде контейнера, выполненный с возможностью принятия образца в контейнер. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, пробирки и другие герметичные или негерметичные сосуды. В определенных вариантах осуществления образцы можно вносить в одно- или многолуночные планшеты, и приемник в виде контейнера выполнен с возможностью принятия таких планшетов. Модуль управления образцами 102 может необязательно включать механизм передачи для передачи частей биологического образца в первое устройство для регулирования потока 106. Подходящие механизмы переноса включают без ограничения устройства для введения образца на основе шприца, а также одно- или многоканальные устройства для переноса жидкости. Примеры подходящих модулей управления образцами включают модуль управления образцами Waters H Class с проточной иглой и модуль управления образцами Waters (оба доступны в Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США).

В определенных вариантах осуществления модуль управления образцами 102 получает биологический образец из устройства для отбора образцов, сообщающегося по текучей среде с биореактором, трубкой для текучей среды или другим компонентом системы биологического производства. Например, биологический образец может быть собран непосредственно из биореактора (и, следовательно, соответствует собранному образцу питательной среды) или может представлять собой раствор или среду, экстрагированные из другого места в системе биологического производства.

На фиг. 2 представлено схематическое изображение примера модуля управления образцами 102, который выполнен с возможностью принятия биологического образца непосредственно из устройства для сбора образцов. Модуль управления образцами 102 включает впускное отверстие 202, удерживающую трубку 204 и шиберную задвижку 206, соединенную с блоком управления 122 через линию управления 124с. Биологический образец вводят в модуль управления образцами 102 через впускное отверстие 202, и образец выдерживают перед доставкой в первое устройство для регулирования потока 106 в удерживающей трубке 204. Чтобы доставить часть образца в первое устройство для регулирования потока 106, блок управления 122 передает сигнал на шиберную задвижку 206. Шиберная задвижка 206 открывается, выпуская часть образца из удерживающей трубки 204 в выпускную трубку 208. Выпущенная часть образца затем перекачивается (например, первым насосом 104) в первое устройство для регулирования потока 106.

Как правило, модуль управления образцами 102 может принимать широкий спектр различных биологических образцов. В некоторых вариантах осуществления, как описано выше, биологический образец соответствует собранной части питательной среды из биореактора. В определенных вариантах осуществления биологический образец соответствует технологической среде или среде, извлеченной из другого места в системе биологического производства, например раствору, содержащему продукт или промежуточное соединение, отобранному до или после стадии очистки в системе биологического производства.

В определенных вариантах осуществления систему 100 можно использовать для определения атрибутов качества продукта для развития клеточной линии, а биологический образец соответствует части клеточной культуры, клеточной культуральной среде, жидкой суспензии клеток или другому типу образца, в котором присутствуют клетки, продукты клеточного распада, клеточные метаболиты и/или примеси клеточных культур.

Система 100 определяет атрибуты качества продукта для одного или нескольких аналитов в биологическом образце, полученном модулем управления образцами 102. В общем, атрибуты могут быть определены для широкого спектра различных типов аналитов. Например, в некоторых вариантах осуществления система 100 определяет атрибуты качества продукта для белков-аналитов, включая без ограничения антитела (включая моно-, би- и триспецифические антитела), белки, отличные от антител, слитые белки и/или Fab-фрагменты.

В некоторых вариантах осуществления аналит представляет собой рекомбинантный терапевтический белок. Неограничивающие примеры рекомбинантных терапевтических белков, которые можно анализировать с использованием систем и способов, раскрытых в данном документе, включают иммуноглобулины (в том числе иммуноглобулины, содержащие легкие и тяжелые цепи, антитела или фрагменты антител (например, любые из фрагментов антител, описанных в данном документе), ферменты (например, галактозидазу (например, альфа-галактозидазу), миозим или церезим), белки (например, эритропоэтин человека, фактор некроза опухоли (TNF) или интерферон альфа или бета), или иммуногенные или антигенные белки, или фрагменты белков (например, белки для применения в вакцине)). Рекомбинантный терапевтический белок может представлять собой сконструированный антигенсвязывающий полипептид, который содержит каркас по меньшей мере одного многофункционального рекомбинантного белка (см., например, рекомбинантные антигенсвязывающие белки, описанные в Gebauer et al., Current Opin. Chem. Biol. 13:245-255, 2009; и публикацию заявки на патент США № 2012/0164066 (включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте)).

Неограничивающие примеры рекомбинантных терапевтических белков, которые представляют собой антитела, включают панитумумаб, омализумаб, абаговомаб, абциксимаб, актоксумаб, адалимумаб, адекатумумаб, афелимомаб, афутузумаб, алацизумаб, алацизумаб, алемтузумаб, алирокумаб, альтумомаб, аматуксимаб, аматуксимаб, анатумомаб, анрукинзумаб, аполизумаб, арцитумомаб, атинумаб, тоцилизумаб, базилизимаб, бектумомаб, белимумаб, бевацизумаб, безилезомаб, безлотоксумаб, бициромаб, канакинумаб, цертолизумаб, цетукцимаб, циксутумумаб, даклизумаб, деносумаб, денсумаб, экулизумаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, эпратузумаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, фигитумумаб, голимумаб, ибритутомаб тиуксетан, иговомаб, имгатузумаб, инфликсимаб, инолимомаб, инотузумаб, лабетузумаб, лебрикизумаб, моксетумомаб, натализумаб, обинутузумаб, ореговомаб, паливизумаб, панитумумаб, пертузумаб, ранибизумаб, ритуксимаб, тоцилизумаб, тозитумомаб, тралокинумаб, тукотузумаб, трастузумаб, велтузумаб, залутумумаб и затуксимаб.

Дополнительные неограничивающие примеры рекомбинантных терапевтических белков, которые можно анализировать, включают: алглюкозидазу альфа, ларонидазу, абатацепт, галсульфазу, лютропин альфа, антигемофилический фактор, агалзидазу бета, интерферон бета-1a, дарбэпоэтин альфа, тенектеплазу, этанерцепт, фактор свертывания крови IX, фолликулостимулирующий гормон, интерферон бета-1a, имиглюцеразу, дорназу альфа, эпоэтин альфа, инсулин или аналоги инсулина, мекасермин, фактор VIII, фактор VIIa, антитромбин III, белок C, человеческий альбумин, эритропоэтин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерлейкин-11, ларонидазу, идурсульфазу, галсульфазу, ингибитор α-1-протеиназы, лактазу, аденозиндезаминазу, тканевой активатор плазминогена, тиреотропин альфа (например, Thyrogen®) и альтеплазу. Дополнительные примеры рекомбинантных белков, которые можно получать с помощью способов по настоящему изобретению, включают кислую α-глюкозидазу, алглюкозидазу альфа (например, Myozyme® и Lumizyme®), α-L-идуронидазу (например, Aldurazyme®), идуронат-сульфатазу, гепаран-N-сульфатазу, галактоза-6-сульфатазу, кислую β-галактозидазу, β-глюкоронидазу, N-ацетилглюкозамин-1-фосфотрансферазу, α-N-ацетилгалактозаминидазу, кислую липазу, лизосомальную кислую церамидазу, кислую сфингомиелиназу, β-глюкозидазу (например, Cerezyme® и Ceredase®), галактозилцерамидазу, α-галактозидазу-A (например, Fabrazyme®), кислую β-галактозидазу, β-галактозидазу, нейраминидазу, гексозаминидазу A и гексозаминидазу B.

Как обсуждалось выше, в некоторых вариантах осуществления аналит является компонентом клетки, и способы и системы, описанные в данном документе, могут быть использованы для разработки способа с использованием линии клеток. Примеры таких клеток включают без ограничения клетки бактерий (например, грамотрицательных бактерий), дрожжей (например, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica или Arxula adeninivorans) или клетки млекопитающих. Клетка млекопитающего может представлять собой клетку, которая растет в суспензии, или адгезивную клетку. Неограничивающие примеры клеток млекопитающих включают: клетки яичника китайского хомячка (СНО), (например, клетки СНО DG44 или клетки CHO-K1s), Sp2.0, клетки миеломы (например, NS/0), В-клетки, клетки гибридомы, Т-клетки, клетки эмбриональной почки человека (HEK) (например, HEK 293E и HEK 293F), эпителиальные клетки почки африканской зеленой мартышки (клетки Vero) и эпителиальные клетки почки собаки (кокер-спаниель) Madin-Darby (клетки MDCK).

Клетка млекопитающего может содержать рекомбинантную нуклеиновую кислоту (например, нуклеиновую кислоту, стабильно интегрированную в геном клетки млекопитающего), которая кодирует рекомбинантный терапевтический белок. Неограничивающие примеры рекомбинантных нуклеиновых кислот, которые кодируют иллюстративные рекомбинантные терапевтические белки, описаны ниже, как и рекомбинантные терапевтические белки, которые можно получить с применением способов, описанных в данном документе. В некоторых случаях клетку млекопитающего, которую культивируют в биореакторе (например, в любом из биореакторов, описанных в данном документе), получили из более крупной культуры.

Нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный терапевтический белок, можно вводить в клетку млекопитающего с применением широкого ряда способов, известных в области молекулярной биологии и молекулярной генетики. Неограничивающие примеры включают трансфекцию (например, липофекцию), трансдукцию (например, инфицирование с помощью лентивируса, аденовируса или ретровируса) и электропорацию. В некоторых случаях нуклеиновая кислота, которая кодирует рекомбинантный терапевтический белок, не интегрируется стабильно в хромосому клетки млекопитающего (транзиентная трансфекция), тогда как в других случаях нуклеиновая кислота интегрируется. В качестве альтернативы или в дополнение, нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный терапевтический белок, может находится в плазмиде и/или в искусственной хромосоме млекопитающего (например, человеческой искусственной хромосоме). В качестве альтернативы или в дополнение, нуклеиновую кислоту можно вводить в клетку с применением вирусного вектора (например, лентивирусного, ретровирусного или аденовирусного векторов). Нуклеиновая кислота может быть функционально связана с последовательностью промотора (например, сильного промотора, такого как промотор β-актина и промотор CMV, или индуцируемого промотора). Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, может при необходимости также содержать селектируемый маркер (например, ген, который придает клетке млекопитающего устойчивость к гигромицину, пуромицину или неомицину).

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный терапевтический белок является секретируемым белком и высвобождается клеткой млекопитающего во внеклеточную среду. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая растворимый рекомбинантный терапевтический белок, может содержать последовательность, которая кодирует сигнальный пептид для секреции на N- или С-конце рекомбинантного терапевтического белка, который отщепляется ферментом, присутствующим в клетке млекопитающего, и затем высвобождается во внеклеточную среду.

После того как биологический образец получен модулем управления образцами 102, образец транспортируют первым насосом 104 по трубке 126 к первому устройству для регулирования потока 106. Первое устройство для регулирования потока 106 соединено с блоком управления 122 через линию управления 124b. Как правило, биологический образец может быть доставлен ко множеству различных выходов с помощью первого устройства для регулирования потока 106. В первой конфигурации первое устройство для регулирования потока 106 доставляет биологический образец непосредственно во второе устройство для регулирования потока 110 через трубку 128. В другой конфигурации первое устройство для регулирования потока 106 доставляет биологический образец в устройство для очистки образцов 108 по трубке 130. Блок управления 122 выполнен с возможностью корректирования конфигурации первого устройства для регулирования потока 106 для направления биологического образца в любое место назначения в зависимости от необходимого режима анализа биологического образца.

Первое устройство для регулирования потока 106 может быть реализовано различными способами. В некоторых вариантах осуществления, например, первое устройство для регулирования потока 106 может быть реализовано в виде многоходового клапана. Подходящие клапаны включают, например, 2-позиционный 6-портовый переключающий клапан IDEX MX Series II UltraLife (доступный в IDEX Corp., Лейк-Форест, Иллинойс, США). В определенных вариантах осуществления первое устройство для регулирования потока 106 может быть реализовано как многоканальное жидкостное устройство с входным и/или выходным коллекторами и электрически управляемыми регуляторами потока.

Когда биологический образец направляется в устройство для очистки образцов 108, биологический образец по меньшей мере частично очищается перед анализом образца в системе 100. Очистка может происходить различными способами, но обычно она включает удаление из образца одного или нескольких компонентов, не являющихся аналитами. Альтернативным образом или дополнительно очистка биологического образца может также включать концентрирование аналита в образце и отделение одного аналита от одного или нескольких дополнительных аналитов в образце.

Устройство для очистки образцов 108 может быть реализовано различными способами. В некоторых вариантах осуществления, например, устройство для очистки образцов 108 реализовано в виде хроматографического аппарата и включает одну или несколько хроматографических колонок. Подходящие хроматографические колонки для использования в устройстве для очистки образцов 108 включают, например, колонки для аффинной хроматографии. Термин "аффинная хроматография" относится к типу хроматографии, где молекула аналита (например, аналит, представляющий собой рекомбинантный белок) улавливается и выделяется на основе аффинности. Аффинная хроматография относится к использованию смолы для аффинной хроматографии (например, смолы для аффинной хроматографии, включающей белковый лиганд (например, белок А или белок G)). В некоторых вариантах осуществления аффинная хроматография включает смолу для псевдоаффинной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления смола для аффинной хроматографии включает лиганд-кофактор, лиганд-субстрат, металлолиганд, лиганд-продукт или лиганд-аптамер. Как правило, смола для аффинной хроматографии может включать любой рецептор или лиганд, характеризующийся аффинностью в отношении любого биологического аналита, включая ДНК, олигонуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления смола для аффинной хроматографии может включать фрагменты однодоменных антител из семейства Camelidae для очистки векторов генной терапии. В качестве другого примера, колонка для аффинной хроматографии может представлять собой колонку для аффинной хроматографии с аденоассоциированным вирусом (AAV).

Неограничивающие примеры смолы для аффинной хроматографии могут включать белковый или пептидный лиганд (например, длиной от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 100 аминокислот, от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 90 аминокислот, от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 80 аминокислот, от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 70 аминокислот, от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 60 аминокислот, от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 50 аминокислот, от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 40 аминокислот, от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 30 аминокислот или от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 20 аминокислот), низкомолекулярный субстрат или кофактор фермента, аптамер, ингибитор (например, конкурентный ингибитор белка) или металл.

Неограничивающими примерами смол для аффинной хроматографии с белком А являются: GE MabSelect SuRe™ (агарозная смола с большим количеством поперечных связей, характеризующаяся размером частиц 85 мкм, и эпоксидные функциональные группы, соединяющие белок А с агарозой), JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203 (пористая полиметакрилатная смола, характеризующаяся размером частиц ~ 50 мкм, и эпоксидные функциональные группы, соединяющие белок А с полиметакрилатом), и Kaneka KanCap A (целлюлоза с большим количеством поперечных связей, характеризующаяся размером частиц 65-85 мкм, с белком А, связанным с целлюлозой посредством восстановительного аминирования).

Для колонки для аффинной хроматографии, например колонки с белком А, стадии цикла аффинной хроматографии могут включать стадии загрузки колонки для аффинной хроматографии, например колонки для хроматографии с белком А, текучей средой, включающей аналит, промывания колонки с удалением нежелательного биологического материала (например, загрязняющих белков и/или малых молекул), элюирования целевого рекомбинантного белка, связанного с колонкой, и повторного уравновешивания колонки.

Любая из отдельных стадий в цикле хроматографии может предусматривать один буфер или несколько буферов (например, два или больше буферов), и одна или несколько из любых отдельных стадий в цикле хроматографии могут предусматривать градиент буфера. В данных способах можно принимать любую из комбинаций различных общеизвестных аспектов отдельного цикла хроматографии в любой комбинации, например, различных смолы(смол) для хроматографии, значения(значений) расхода, буфера(буферов), значения(значений) "мертвого объема" колонки, значения(значений) объема слоя колонки, значения(значений) объема буфера, применяемого на каждой стадии, значения(значений) объема текучей среды, включающей целевой белок, и количества и типа буфера(буферов), применяемого(применяемых) на каждой стадии.

В некоторых вариантах осуществления колонка с белком А может быть загружена 1x фосфатно-солевым буфером (PBS) при pH приблизительно 7 (например, pH приблизительно 7,0, pH приблизительно 7,1, pH приблизительно 7,2, pH приблизительно 7,3, pH приблизительно 7,4, pH приблизительно 7,5, pH приблизительно 7,6, pH приблизительно 7,7, pH приблизительно 7,8 или pH приблизительно 7,9). В некоторых вариантах осуществления колонка с белком А может быть загружена 1x PBS при pH приблизительно 7,2.

В некоторых вариантах осуществления колонку с белком А элюируют буфером, содержащим от приблизительно 50 мМ до приблизительно 200 мМ фосфата лимонной кислоты (например, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 180 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 170 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 160 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 140 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 130 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 120 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 110 мМ, приблизительно от 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 180 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 170 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 160 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 140 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 130 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 120 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 110 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 180 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 170 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 160 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 140 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 130 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 120 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 110 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 180 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 170 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 160 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 140 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 130 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 180 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 170 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 160 мМ, от приблизительно 175 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 175 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 175 мМ до приблизительно 180 мМ или от приблизительно 180 мМ до приблизительно 200 мМ), от приблизительно 50 мМ до приблизительно 200 мМ NaCL (например, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 180 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 170 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 160 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 140 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 130 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 120 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 110 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 180 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 170 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 160 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 140 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 130 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 120 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 110 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 180 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 170 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 160 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 140 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 130 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 120 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 110 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 180 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 170 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 160 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 140 мМ, от приблизительно 125 мМ до приблизительно 130 мМ, от приблизительно 130 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 130 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 130 мМ до приблизительно 180 мМ, от приблизительно 130 мМ до приблизительно 170 мМ, от приблизительно 130 мМ до приблизительно 160 мМ, от приблизительно 130 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 140 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 140 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 140 мМ до приблизительно 180 мМ, от приблизительно 140 мМ до приблизительно 170 мМ, от приблизительно 140 мМ до приблизительно 160 мМ, от приблизительно 140 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 180 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 170 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 160 мМ, от приблизительно 175 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 175 мМ до приблизительно 190 мМ, от приблизительно 175 мМ до приблизительно 180 мМ или от приблизительно 180 мМ до приблизительно 200 мМ), при рН от приблизительно 2 до приблизительно 4 (например, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,8, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,6, при рН от приблизительно pH 2 до приблизительно 3,8, при рН от приблизительно pH 2 до приблизительно 3,6, при рН от приблизительно pH 2 до приблизительно 3,4, при рН от приблизительно pH 2 до приблизительно 3,2, при рН от приблизительно рН 2 до приблизительно 3,0, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,8, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,6, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,4, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,2, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 4, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,8, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,6, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,4 или при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,2).

В некоторых вариантах осуществления колонку с белком А элюируют с помощью ацетата натрия в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ (например, от 10 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 25 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 80 мМ, приблизительно 80 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 80 мМ до приблизительно 90 мМ или от приблизительно 90 мМ до приблизительно 100 мМ), при рН от приблизительно 2 до приблизительно 4 (например, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,8, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,75, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,6, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,8, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,6, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,4, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,2, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,0, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,8, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,6, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,4, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,2, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 4, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,8, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,75, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,6, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,4 или при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,2).

Хроматография, выполняемая с использованием хроматографической колонки этого типа, может включать, например, последовательные хроматографические стадии загрузки, промывки, элюирования и регенерации хроматографической колонки, которые обычно выполняются. Любые из иллюстративных значений расхода, объемов буфера и/или продолжительности времени, отведенных для каждой последовательной хроматографической стадии, описанной в данном документе, могут быть использованы на любой из этих различных последовательных хроматографических стадий.

В некоторых вариантах осуществления одну хроматографическую колонку или одну хроматографическую мембрану, содержащие смолу, пригодную для захвата аналита, загружают за время, составляющее, например, от приблизительно 5 минут до приблизительно 90 минут (например, от приблизительно 10 минут до приблизительно 90 минут, от приблизительно 15 минут до 80 минут, от приблизительно 20 минут до 80 минут, от приблизительно 30 минут до приблизительно 80 минут, от приблизительно 40 минут до приблизительно 80 минут и от приблизительно 50 минут до 80 минут).

После загрузки аналита в колонку промывают по меньшей мере одним промывочным буфером. По меньшей мере один (например, два, три или четыре) буфер для промывания предназначен для элюирования всех соединений, отличных от аналита, из колонки без нарушения при этом взаимодействия аналита со смолой.

Буфер для промывания можно пропускать через колонку при расходе, составляющем от приблизительно 0,1 мл/минута до приблизительно 25 мл/минута (например, от приблизительно 0,2 мл/минута до приблизительно 20 мл/минута, от приблизительно 0,5 мл/минута до приблизительно 20 мл/минута, от приблизительно 0,2 мл/минута до приблизительно 15 мл/минута, от приблизительно 0,5 мл/минута до приблизительно 15 мл/минута, от приблизительно 0,5 мл/минута до приблизительно 10 мл/минута, от приблизительно 0,5 мл минута до приблизительно 14 мл/минута, от приблизительно 1,0 мл/минута до приблизительно 25,0 мл/минута или от приблизительно 1,0 мл/минута до приблизительно 15,0 мл/минута).

Объем применяемого буфера для промывания (например, совокупный общий объем применяемых буферов для промывания, если применяют более одного буфера для промывания) может составлять, например, от приблизительно 1×объема колонки (CV) до приблизительно 15×CV (например, от приблизительно 1×CV до приблизительно 14×CV, от приблизительно 1×CV до приблизительно 13×CV, от приблизительно 1×CV до приблизительно 12×CV, от приблизительно 1×CV до приблизительно 11×CV, от приблизительно 2×CV до приблизительно 11×CV, от приблизительно 3×CV до приблизительно 11×CV, от приблизительно 4×CV до приблизительно 11×CV, от приблизительно 5×CV до приблизительно 11×CV или от приблизительно 5×CV до приблизительно 10×CV). Общее время промывания может составлять, например, от приблизительно 2 минут до приблизительно 3 часов (например, от приблизительно 2 минут до приблизительно 2,5 часа, от приблизительно 2 минут до приблизительно 2,0 часа, от приблизительно 5 минут до приблизительно 1,5 часа, от приблизительно 10 минут до приблизительно 1,5 часа, от приблизительно 10 минут до приблизительно 1,25 часа, от приблизительно 20 минут до приблизительно 1,25 часа или от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 часа).

После промывания колонки аналит элюируют из колонки посредством пропускания буфера для элюирования через колонку. Буфер для элюирования можно пропускать через колонку при расходе, составляющем от приблизительно 0,2 мл/минута до приблизительно 25 мл/минута (например, от приблизительно 0,1 мл/минута до приблизительно 20 мл/минута, от приблизительно 0,5 мл/минута до приблизительно 20 мл/минута, от приблизительно 0,2 мл/минута до приблизительно 15 мл/минута, от приблизительно 0,5 мл/минута до приблизительно 15 мл/минута, от приблизительно 0,5 мл/минута до приблизительно 10 мл/минута, от приблизительно 0,5 мл минута до приблизительно 6,0 мл/минута, от приблизительно 1,0 мл минута до приблизительно 5,0 мл/минута, от приблизительно 0,5 мл минута до приблизительно 14 мл/минута, от приблизительно 1,0 мл/минута до приблизительно 25,0 мл/минута или от приблизительно 1,0 мл/минута до приблизительно 15,0 мл/минута). Объем буфера для элюирования, применяемого для элюирования аналита из колонки, может составлять, например, от приблизительно 1×объема колонки (CV) до приблизительно 15×CV (например, от приблизительно 1×CV до приблизительно 14×CV, от приблизительно 1×CV до приблизительно 13×CV, от приблизительно 1×CV до приблизительно 12×CV, от приблизительно 1×CV до приблизительно 11×CV, от приблизительно 2×CV до приблизительно 11×CV, от приблизительно 3×CV до приблизительно 11×CV, от приблизительно 4×CV до приблизительно 11×CV, от приблизительно 5×CV до приблизительно 11×CV или от приблизительно 5×CV до приблизительно 10×CV). Общее время элюирования может составлять, например, от приблизительно 0,1 минуты до приблизительно 3 часов (например, от приблизительно 2 минут до приблизительно 2,5 часа, от приблизительно 2 минут до приблизительно 2,0 часа, от приблизительно 2 минут до приблизительно 1,5 часа, от приблизительно 2 минут до приблизительно 1,5 часа, от приблизительно 2 минут до приблизительно 1,25 часа, от приблизительно 2 минут до приблизительно 1,25 часа, от приблизительно 2 минут до приблизительно 1 часа, от приблизительно 2 минут до приблизительно 40 минут, от приблизительно 10 минут до приблизительно 40 минут, от приблизительно 20 минут до приблизительно 40 минут или от приблизительно 0,1 минуты до приблизительно 10 минут).

Неограничивающие примеры буферов для элюирования, которые можно применять, зависят от механизма захвата и/или аналита. Например, буфер для элюирования может иметь разную концентрацию соли (например, повышенную концентрацию соли), разный pH (например, повышенную или пониженную концентрацию соли) или молекулу, которая будет конкурировать с аналитом за связывание со смолой. Примеры таких буферов для элюирования описаны выше.

После элюирования аналита из колонки колонку можно уравновешивать с помощью буфера для регенерации. Буфер для регенерации можно пропускать через колонку при расходе, составляющем, например, от приблизительно 0,1 мл/минута до приблизительно 25 мл/минута (например, от приблизительно 0,2 мл/минута до приблизительно 20 мл/минута, от приблизительно 0,5 мл/минута до приблизительно 20 мл/минута, от приблизительно 0,2 мл/минута до приблизительно 15 мл/минута, от приблизительно 0,5 мл/минута до приблизительно 15 мл/минута, от приблизительно 0,5 мл/минута до приблизительно 10 мл/минута, от приблизительно 0,5 мл/минута до приблизительно 6,0 мл/минута, от приблизительно 1,0 мл/минута до приблизительно 5,0 мг/минута, от приблизительно 0,5 мл/минута до приблизительно 14 мл/минута, от приблизительно 1,0 мл/минута до приблизительно 25,0 мл/минута, от приблизительно 5,0 мл/минута до приблизительно 15,0 мл/минута или от приблизительно 1,0 мл/минута до приблизительно 15,0 мл/минута).

Объем буфера для регенерации, применяемого для уравновешивания колонки, может составлять, например, от приблизительно 1×объема колонки (CV) до приблизительно 15×CV (например, от приблизительно 1×CV до приблизительно 14×CV, приблизительно 1×CV до приблизительно 13×CV, от приблизительно 1×CV до приблизительно 12×CV, от приблизительно 1×CV до приблизительно 11×CV, от приблизительно 2×CV до приблизительно 11×CV, от приблизительно 3×CV до приблизительно 11×CV, от приблизительно 2×CV до приблизительно 5×CV, от приблизительно 4×CV до приблизительно 11×CV, от приблизительно 5×CV до приблизительно 11×CV или от приблизительно 5×CV до приблизительно 10×CV).

В некоторых вариантах осуществления устройство для очистки образцов 108 включает одну колонку для аффинной хроматографии. В определенных вариантах осуществления устройство для очистки образцов 108 включает множество колонок для аффинной хроматографии. При использовании множества колонок колонки могут быть разными (например, включать разные хроматографические смолы) или могут быть одинаковыми. Кроме того, множество колонок можно загружать и/или элюировать одними и теми же растворителями и буферами или разными растворителями и/или буферами. Каждая из колонок в многоколоночном устройстве для очистки образцов может включать любую одну или несколько хроматографических смол, описанных в данном документе, и может быть загружена и/или элюирована любым одним или несколькими разными растворителями и буферами, описанными в данном документе.

Биологический образец доставляется во второе устройство для регулирования потока 110 либо непосредственно из первого устройства для регулирования потока 106, либо через устройство для очистки образцов 108, как описано выше. Второе устройство для регулирования потока 110 принимает биологический образец и направляет его по одному из множества путей потока в соответствии с сигналом управления от блока управления 122, передаваемым по линии управления 124d. Второе устройство для регулирования потока 110 в целом может быть реализовано таким же образом, как и первое устройство для регулирования потока 106, описанное выше.

Как правило, второе устройство для регулирования потока 110 направляет биологический образец в один из множества анализаторов образцов, как показано на фиг. 1. Как правило, система 100 может включать 2 или больше анализаторов образцов (например, 3 или больше, 4 или больше, 5 или больше, 6 или больше, 7 или больше, 8 или больше, 10 или больше, 15 или больше или даже больше). Каждый из анализаторов образцов связан с измерением одного атрибута качества продукта для аналита биологического образца. На фиг. 1 в качестве примера показаны четыре различных анализатора образцов 114a-114d. Однако следует понимать, что система 100 может включать любое количество анализаторов образцов, в зависимости от количества измеряемых атрибутов качества продукта.

В некоторых вариантах осуществления конкретный анализатор образцов не включает хроматографическую колонку. Например, на фиг. 1, анализатор образцов 114а не включает хроматографическую колонку. Биологический образец может быть доставлен непосредственно в анализатор образцов 114а из второго устройства для регулирования потока 110. Более конкретно, когда необходимо измерить атрибут качества продукта, связанный с анализатором образцов 114а, блок управления 122 передает сигнал управления на второе устройство для регулирования потока 110, корректируя конфигурацию второго устройства для регулирования потока 110 и вызывая доставку биологического образца в анализатор образцов 114а. Атрибут качества продукта, связанный с анализатором образцов 114а, измеряют для аналита в биологическом образце.

В определенных вариантах осуществления конкретный анализатор образцов включает хроматографическую колонку. Например, на фиг. 1, каждый из анализаторов образцов 114b-114d включает хроматографическую колонку. Для доставки биологического образца в такой анализатор образцов образец может быть доставлен непосредственно из второго устройства для регулирования потока 110 под управлением блока управления 122, как описано выше.

Альтернативным образом, в некоторых вариантах осуществления система 100 необязательно включает модуль управления колонками 112, который получает биологический образец из второго устройства для регулирования потока 110 и направляет его в анализатор образцов. Модуль управления колонками может быть особенно полезен в системах, включающих несколько анализаторов образцов с хроматографическими колонками. Как показано на фиг. 1, модуль управления колонками 112 может быть соединен с блоком управления 122 через линию управления 124f. Чтобы направить биологический образец в анализатор образцов, связанный с конкретным измеряемым атрибутом качества продукта, блок управления 122 может передавать сигнал управления на модуль управления колонками 112, корректируя конфигурацию модуля управления колонками 112 таким образом, чтобы направить биологический образец в путь потока анализатора образцов.

Модуль управления колонками 112 может дополнительно сообщаться по текучей среде с одним или несколькими резервуарами (показанными на фиг. 1 как четыре резервуара 120a-120d для иллюстративных целей) через второй насос 118, который также может быть необязательно соединен с блоком управления 122 через линию управления 124e. Когда биологический образец направляется в конкретный анализатор образцов, блок управления 122 также передает сигнал управления второму насосу 118, вызывая направление вторым насосом 118 потока подходящего загрузочного буфера, буфера для элюирования или другого подходящего растворителя или раствора в конкретный анализатор образцов. Хотя в качестве примера на фиг. 1 показаны четыре резервуара, следует понимать, что второй насос 118 может сообщаться по текучей среде с 2 или больше резервуарами (например, 3 или больше, 4 или больше, 5 или больше, 6 или больше, 8 или больше, 10 или больше, 15 или больше, 20 или больше, или даже больше).

Второй насос, как правило, может быть реализован рядом различных способов. Например, в некоторых вариантах осуществления подходящий второй насос 118 представляет собой четвертичный насос Waters H-Class Bio с дополнительной модификацией клапана выбора растворителя (Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США).

После загрузки биологического образца в колонку выбранного хроматографического анализатора образцов колонку обрабатывают и элюируют, и элюат анализируют для получения информации об атрибуте качества продукта, связанном с анализатором образцов, для аналита биологического образца.

Анализ элюата можно проводить различными способами. В некоторых вариантах осуществления, например, система 100 включает детектор 116, сообщающийся по текучей среде с выпускным отверстием хроматографической колонки анализатора образцов. Детектор 116 обнаруживает аналит в элюате и передает информацию об измерении через линию управления 124g в блок управления 122. Блок управления 122 использует информацию измерений (которая обычно соответствует хроматограммам и/или информации, полученной посредством хроматографии, такой как значения высоты, площади и время обнаруженных пиков) для определения значения конкретного атрибута качества продукта для аналита биологического образца.

В системе 100 обычно может использоваться широкий спектр детекторов. В некоторых вариантах осуществления детектор 116 соответствует матричному фотодиодному детектору. Подходящие матричные диодные детекторы для использования в системе 100 включают без ограничения фотодиодный матричный детектор Waters Photodiode Array Detector (Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США).

Можно использовать и другие типы детекторов. Например, в некоторых вариантах осуществления детектор 116 соответствует абсорбционному спектрометру, который измеряет оптическую плотность биологического образца (например, по меньшей мере в одном из ультрафиолетового, видимого и инфракрасного диапазона электромагнитного спектра). В определенных вариантах осуществления детектор 116 может быть реализован как флуоресцентный детектор и включает источник света для направления освещающего света на биологический образец и элемент обнаружения для измерения флуоресцентного излучения образца. В некоторых вариантах осуществления детектор 116 может быть реализован как масс-спектрометрический детектор, в котором биологический образец ионизируется, и распределение ионов разрешается по массе для определения информации о количестве для биологического образца. В определенных вариантах осуществления детектор 116 может быть реализован как детектор многоуглового светорассеяния или детектор угла преломления.

В некоторых вариантах осуществления каждый анализатор образцов на основе колонки может сообщаться по текучей среде с другим специализированным детектором. В определенных вариантах осуществления, как показано на фиг. 1, два или больше анализатора образцов на основе колонки могут сообщаться по текучей среде с общим детектором. То есть детектор 116 может совместно использоваться двумя или больше анализаторами образцов, поскольку система 100 одновременно анализирует только одну часть биологического образца.

В некоторых вариантах осуществления детектор 116 эффективно работает как анализатор образцов. Например, на фиг. 1, анализатор образцов 114а может включать трубку для текучей среды, проходящую между вторым устройством для регулирования потока 110 и детектором 116. Когда образец доставляется в анализатор образцов 114а, образец просто распространяется по трубке для текучей среды и впоследствии анализируется непосредственно детектором 116.

Как правило, в системе 100 каждый анализатор образцов предназначен для измерения конкретного атрибута качества продукта для аналита в биологическом образце. Конкретный определяемый атрибут качества продукта определяется блоком управления 122, который корректирует конфигурацию второго устройства для регулирования потока 110 для направления части биологического образца в один из анализаторов образцов.

Как правило, система 100 может быть выполнена с возможностью измерения любого количества атрибутов качества продукта в зависимости от количества анализаторов образцов, присутствующих в системе. Например, в определенных вариантах осуществления система 100 может измерять 2 или больше (например, 3 или больше, 4 или больше, 5 или больше, 6 или больше, 7 или больше, 8 или больше, 10 или больше, 12 или больше, 15 или больше, 20 или больше или даже больше) атрибутов качества продукта для аналита в биологическом образце.

Атрибуты качества продукта

Как обсуждалось выше, система 100 может использоваться для измерения множества атрибутов качества продукта для аналита в биологическом образце. В зависимости от типа анализаторов образцов, присутствующих в системе 100, можно измерять различные атрибуты качества продукта.

(а) Концентрация или титр

В некоторых вариантах осуществления система 100 включает анализатор образцов, который измеряет концентрацию или титр аналита в биологическом образце. Концентрацию или титр аналита можно измерить непосредственно в биологическом образце с помощью любого из различных типов детекторов, описанных выше. Так, например, для измерения концентрации или титра биологического образца на фиг. 1 часть биологического образца может быть доставлена непосредственно от второго устройства для регулирования потока 110 к детектору 116, т. е. анализатор образцов может эффективно представлять собой трубку для текучей среды, проходящую между вторым устройством для регулирования потока 110 и детектором 116.

(b) Отличающиеся зарядом варианты или гетерогенность

В некоторых вариантах осуществления система 100 включает анализатор образцов, который измеряет отличающиеся зарядом варианты или гетерогенность аналита в биологическом образце. Отличающиеся зарядом варианты/гетерогенность можно определить, например, с помощью анализатора образцов, который включает катионообменную колонку для проведения катионообменной хроматографии аналита в образце.

Термин "катионообменная хроматография" относится к типу ионообменной хроматографии, в котором используется отрицательно заряженная ионообменная смола для разделения молекул на основе различия зарядов. В некоторых вариантах осуществления колонка для катионообменной хроматографии представляет собой колонку для сильной катионообменной хроматографии, например колонку для катионообменной хроматографии HiTrap SP HP, колонку для катионообменной хроматографии Mono S, колонку для сильной катионообменной хроматографии Thermo MAbPac.

Цикл хроматографии с применением колонки для катионообменной хроматографии (например, колонки для сильной катионообменной хроматографии), где аналит связывается со смолой для хроматографии на стадии загрузки, может включать стадии загрузки колонки текучей средой, включающей аналит, промывания колонки с удалением нежелательного биологического материала, элюирования аналита, связанного с колонкой, и повторного уравновешивания колонки. В определенных вариантах осуществления цикл хроматографии с применением колонки для катионообменной хроматографии, где нежелательный биологический материал связывается со смолой для хроматографии во время стадии загрузки, тогда как аналит не связывается, может включать стадии загрузки колонки текучей средой, включающей целевой белок, сбора целевого рекомбинантного белка в непрерывном потоке и повторного уравновешивания колонки.

Любая из отдельных стадий в цикле хроматографии может предусматривать один буфер или несколько буферов (например, два или больше буферов), и одна или несколько из любых отдельных стадий в цикле хроматографии могут предусматривать градиент буфера. В данных способах можно принимать любую из комбинаций различных общеизвестных аспектов отдельного цикла хроматографии в любой комбинации, например, различных смолы(смол) для хроматографии, значения(значений) расхода, буфера(буферов), значения(значений) "мертвого объема" колонки, значения(значений) объема слоя колонки, значения(значений) объема буфера, применяемого на каждой стадии, значения(значений) объема текучей среды, включающей целевой белок, и количества и типа буфера(буферов), применяемого(применяемых) на каждой стадии.

В некоторых вариантах осуществления в колонку для катионообменной хроматографии загружают с помощью от приблизительно 50 мМ до приблизительно 120 мМ фосфата лимонной кислоты (например, приблизительно 50 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 100 мМ, приблизительно 110 мМ или приблизительно 120 мМ), от приблизительно 100 мМ до приблизительно 150 мМ NaCl (например, приблизительно 100 мМ, приблизительно 110 мМ, приблизительно 120 мМ, приблизительно 130 мМ, приблизительно 140 мМ или приблизительно 150 мМ), при рН от приблизительно 3 до приблизительно 4 (например, при pH приблизительно 3,2, при pH приблизительно 3,4, при pH приблизительно 3,6, при pH приблизительно 3,8 или при pH приблизительно 4).

В некоторых вариантах осуществления колонку с белком А элюируют с помощью ацетата натрия в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ (например, от 10 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 25 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 80 мМ, приблизительно 80 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 80 мМ до приблизительно 90 мМ или от приблизительно 90 мМ до приблизительно 100 мМ), при рН от приблизительно 2 до приблизительно 4 (например, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,8, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,75, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,6, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,8, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,6, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,4, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,2, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,0, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,8, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,6, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,4, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,2, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 4, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,8, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,75, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,6, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,4 или при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,2).

В некоторых вариантах осуществления колонку для катионообменной хроматографии элюируют с помощью от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ трисацетата (например, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 80 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 80 мМ до приблизительно 90 мМ или от приблизительно 90 мМ до приблизительно 100 мМ) и приблизительно от 10 мМ до приблизительно 100 мМ NaCl (например, приблизительно от 10 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 90 мМ, приблизительно от 20 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 25 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 80 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 80 мМ до приблизительно 90 мМ, или от приблизительно 90 мМ до приблизительно 100 мМ), при рН от приблизительно 7 до приблизительно 10 (например, при рН от приблизительно 7,2 до приблизительно 9,8, при pH от приблизительно 7,2 до приблизительно 9,6, при pH от приблизительно 7,2 до приблизительно 9,4, при pH от приблизительно 7,2 до приблизительно 9,2, при pH от приблизительно 7,2 до приблизительно 9, при pH от приблизительно 7,2 до приблизительно 8,8, при pH от приблизительно 7,2 до приблизительно 8,6, при pH от приблизительно 7,2 до приблизительно 8,4, при pH от приблизительно 7,2 до приблизительно 8,2, при pH от приблизительно 7,2 до приблизительно 8, при pH от приблизительно 7,2 до приблизительно 7,8, при pH от приблизительно 7,2 до приблизительно 7,6, при pH от приблизительно 7,2 до приблизительно 7,4, при pH от приблизительно 8 до приблизительно 10, при pH от приблизительно 8 до приблизительно 9,8, при pH от приблизительно 8 до приблизительно 9,6, при pH от приблизительно 8 до приблизительно 9,4, при pH от приблизительно 8 до приблизительно 9,2, при pH от приблизительно 8 до приблизительно 9, при pH от приблизительно 8 до приблизительно 8,8, при pH от приблизительно 8 до приблизительно 8,6, при pH от приблизительно 8 до приблизительно 8,4, при pH от приблизительно 8 до приблизительно 8,2, при pH от приблизительно 9 до приблизительно 10, при pH от приблизительно 9 до приблизительно 9,2, при pH от приблизительно 9 до приблизительно 9,4, при pH от приблизительно 9 до приблизительно 9,6, при pH от приблизительно 9 до приблизительно 9,8, при pH от приблизительно 9,5 до приблизительно 10 или при pH от приблизительно 9,5 до приблизительно 9,8).

В некоторых вариантах осуществления колонку для катионообменной хроматографии элюируют с помощью от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ (например, 10 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 40 мМ или приблизительно 50 мМ) и от приблизительно 20 мМ до приблизительно 50 мМ NaCl (например, 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 40 мМ или приблизительно 50 мМ), при рН от приблизительно 8 до приблизительно 10 (например, при рН от приблизительно 8 до приблизительно 9,8, при рН от приблизительно 8 до приблизительно 9,6, при рН от приблизительно 8 до приблизительно 9,4, при рН от приблизительно 8 до приблизительно 9,2, при рН от приблизительно 8 до приблизительно 9, при рН от приблизительно 8 до приблизительно 8,8, при рН от приблизительно 8 до приблизительно 8,6, при рН от приблизительно 8 до приблизительно 8,4, при рН от приблизительно 8 до приблизительно 8,2, при рН от приблизительно 9 до приблизительно 10, при рН от приблизительно 9 до приблизительно 9,8, при рН от приблизительно 9 до приблизительно 9,6, при рН от приблизительно 9 до приблизительно 9,4, при рН от приблизительно 9 до приблизительно 9,2 или при рН от приблизительно 9,4 до приблизительно 10).

(c) Агрегация

В некоторых вариантах осуществления система 100 включает анализатор образцов, который измеряет агрегацию аналита в биологическом образце. Степень агрегации можно определить, например, с помощью анализатора образцов, который включает колонку для эксклюзионной хроматографии для проведения эксклюзионной хроматографии аналита в образце.

Термин "колонка для эксклюзионной хроматографии" или "хроматография на молекулярных ситах" относится к хроматографической колонке, в которой аналиты и другие компоненты разделяются по размеру и/или молекулярной массе. В некоторых вариантах осуществления колонку для эксклюзионной хроматографии используют для разделения белковых агрегатов, например белковых мультимеров (например, димеров и тримеров). Неограничивающие примеры колонок для эксклюзионной хроматографии включают: Sephadex G-10, Sephadex G-25, Sephadex G-50, Sephadex G-75, Sephadex G-100, Sephadex G-150, Sephadex G-200, Sepharose 2B, Sepharose 4B, Sepharose 6B, Bio-gel P-300 и Waters BEH SEC 200A.

В некоторых вариантах осуществления колонку для эксклюзионной хроматографии загружают 1x фосфатно-солевым буфером (PBS) при pH приблизительно 7 (например, pH приблизительно 7,0, pH приблизительно 7,1, pH приблизительно 7,2, pH приблизительно 7,3, pH приблизительно 7,4, pH приблизительно 7,5, pH приблизительно 7,6, pH приблизительно 7,7, pH приблизительно 7,8 или pH приблизительно 7,9). В некоторых вариантах осуществления колонку для эксклюзионной хроматографии загружают 1x PBS при pH приблизительно 7,2.

(d) Целостность или чистота

В некоторых вариантах осуществления система 100 включает анализатор образцов, который измеряет целостность или чистоту аналита в биологическом образце. Целостность или чистоту можно определить, например, с помощью анализатора образцов, который включает колонку для обращенно-фазовой хроматографии для проведения обращенно-фазовой хроматографии аналита в образце.

Термин "обращенно-фазовая хроматография" или "хроматография гидрофобных взаимодействий" относится к типу хроматографии, который включает гидрофобную неподвижную фазу. Неограничивающие примеры колонок для обращенно-фазовой хроматографии известны в данной области техники и включают, например, Sepax Opalshell-C18. Неограничивающие примеры гидрофобных лигандов включают алифаты, например С2, С4, С8, С10, С12, С16 и С18, и полифенилы.

Цикл хроматографии с применением колонки для обращенно-фазовой хроматографии, может включать стадии загрузки колонки текучей средой, включающей аналит, промывания колонки с удалением нежелательного биологического материала, элюирования аналита, связанного с колонкой, и повторного уравновешивания колонки.

Любая из отдельных стадий в цикле хроматографии может предусматривать один буфер или несколько буферов (например, два или больше буферов), и одна или несколько из любых отдельных стадий в цикле хроматографии могут предусматривать градиент буфера. В данных способах можно принимать любую из комбинаций различных общеизвестных аспектов отдельного цикла хроматографии в любой комбинации, например, различных смолы(смол) для хроматографии, значения(значений) расхода, буфера(буферов), значения(значений) "мертвого объема" колонки, значения(значений) объема слоя колонки, значения(значений) объема буфера, применяемого на каждой стадии, значения(значений) объема текучей среды, включающей целевой белок, и количества и типа буфера(буферов), применяемого(применяемых) на каждой стадии.

В некоторых вариантах осуществления колонку для обращенно-фазовой хроматографии элюируют с помощью от приблизительно 0,01% до приблизительно 1% (например, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,5% , от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,6%, приблизительно от 0,05% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,06% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,06% до приблизительно 0,8%, приблизительно 0,06% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,06% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,06% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,06% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,06% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,6% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,6% до приблизительно 0,8% или от приблизительно 0,8% до приблизительно 1%) трифторуксусной кислоты (TFA) в воде.

В некоторых вариантах осуществления колонку для обращенно-фазовой хроматографии элюируют с помощью от приблизительно 0,01% до приблизительно 1% (например, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,06% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,06% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,06% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,06% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,06% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,06% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,06% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,08% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,6% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,6% до приблизительно 0,8% или от приблизительно 0,8% до приблизительно 1%) трифторуксусной кислоты (TFA) в изопропаноле (IPA):ацетонитриле (ACN) при соотношении от приблизительно 1:10 до приблизительно 10: 120 (например, приблизительно 1:50, 1:90, 1:100, 1:120, 10:50, 10:90 или 10:120).

В некоторых вариантах осуществления колонку для обращенно-фазовой хроматографии элюируют с помощью от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,2% (например, приблизительно 0,01%, приблизительно 0,02%, приблизительно 0,04%, приблизительно 0,05%, приблизительно 0,06%, приблизительно 0,08%, приблизительно 0,1%, приблизительно 0,12%, приблизительно 0,14%, приблизительно 0,15%, приблизительно 0,16%, приблизительно 0,18% или приблизительно 0,2%) трифторуксусной кислоты (TFA) в изопропаноле (IPA):ацетонитриле (ACN) при соотношении от приблизительно 10:90 до приблизительно 1:80.

В некоторых вариантах осуществления колонку для обращенно-фазовой хроматографии элюируют с помощью ацетата натрия в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ (например, от 10 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 25 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 80 мМ, приблизительно 80 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 80 мМ до приблизительно 90 мМ или от приблизительно 90 мМ до приблизительно 100 мМ), при рН от приблизительно 2 до приблизительно 4 (например, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,8, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,75, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,6, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,8, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,6, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,4, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,2, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,0, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,8, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,6, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,4, при рН от приблизительно 2 до приблизительно 2,2, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 4, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,8, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,75, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,6, при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,4 или при рН от приблизительно 3 до приблизительно 3,2).

(e) Восстановление антител

В некоторых вариантах осуществления система 100 включает анализатор образцов, который измеряет восстановление аналита, представляющего собой антитело, в биологическом образце. В производственных платформах биопроизводства восстановительная деградация продуктов антител вызывает озабоченность, и системы, описанные в данном документе, могут использоваться для измерения снижения количества антител для корректировки параметров производственного процесса с обратной связью. Восстановление антител можно определить, например, с помощью анализатора образцов, который включает колонку для обращенно-фазовой хроматографии для проведения обращенно-фазовой хроматографии аналита в образце. Любые смолы, буферы, значения pH и другие рабочие условия колонок для обращенно-фазовой хроматографии, обсуждаемые в данном документе, могут быть использованы в связи с обращенно-фазовой хроматографией в анализаторе образцов.

В некоторых вариантах осуществления колонки для хроматографии гидрофильных взаимодействий можно использовать для измерения атрибутов качества продукта для аналита образца. В определенных вариантах осуществления колонки для хроматографии гидрофобных взаимодействий можно использовать для измерения атрибутов качества продукта, таких как анализ окисления. В некоторых вариантах осуществления лектиновые колонки можно использовать для получения атрибутов качества продукта, связанных с информацией о гликозилировании.

В определенных вариантах осуществления колонки для хроматографии с участием ферментов можно использовать для осуществления картирования пептидов с целью измерения атрибутов качества продукта. Разделение с помощью обращенно-фазовой хроматографии можно использовать для разделения пептидных аналитов для анализа.

Анализ атрибутов качества продукта с использованием системы 100, как правило, может быть выполнен почти в реальном времени, чтобы обеспечить своевременную обратную связь по управлению для корректировки широкого спектра условий и параметров процесса биопроизводства. В некоторых вариантах осуществления, например, атрибут концентрации или титра для аналита биологического образца может быть определен в течение 10 минут или меньше (например, 9 минут или меньше, 8 минут или меньше, 7 минут или меньше, 6 минут или меньше, 5 минут или меньше, 4 минут или меньше, 3 минут или меньше, 2 минут или меньше, 1 минуты или меньше) от первоначального введения части образца в подходящий анализатор образцов до определения значения атрибута.

В определенных вариантах осуществления атрибут отличающихся зарядом вариантов или гетерогенности для аналита биологического образца может быть определен в течение 70 минут или меньше (например, 65 минут или меньше, 60 минут или меньше, 55 минут или меньше, 50 минут или меньше, 45 минут или меньше, 40 минут или меньше, 35 минут или меньше, 30 минут или меньше) от первоначального введения части образца в подходящий анализатор образцов до определения значения атрибута.

В некоторых вариантах осуществления атрибут агрегации для аналита биологического образца может быть определен в течение 30 минут или меньше (например, 28 минут или меньше, 26 минут или меньше, 24 минут или меньше, 22 минут или меньше, 20 минут или меньше, 18 минут или меньше, 16 минут или меньше, 14 минут или меньше, 12 минут или меньше, 10 минут или меньше) от первоначального введения части образца в подходящий анализатор образцов до определения значения атрибута.

В определенных вариантах осуществления атрибут целостности или чистоты для аналита биологического образца может быть определен в течение 30 минут или меньше (например, 28 минут или меньше, 26 минут или меньше, 24 минут или меньше, 22 минут или меньше, 20 минут или меньше, 18 минут или меньше, 16 минут или меньше, 12 минут или меньше, 14 минут или меньше, 10 минут или меньше) от первоначального введения части образца в подходящий анализатор образцов до определения значения атрибута.

Для цикла анализа, в котором значения каждого из четырех вышеперечисленных атрибутов качества продукта определяют для аналита, прошедшее время может составлять 150 минут или меньше (например, 130 минут или меньше, 110 минут или меньше, 105 минут или меньше, 100 минут или меньше, 95 минут или меньше, 90 минут или меньше, 80 минут или меньше, 70 минут или меньше, 60 минут или меньше) от первоначального введения первой части биологического образца в первый анализатор образцов до определения значения четвертого атрибута.

На фиг. 3 представлена блок-схема 300, которая включает ряд примеров стадий для определения атрибутов качества продукта для аналита биологического образца. На первой стадии 302 образец принимается модулем управления образцами. Как описано выше, образец может быть получен в автономном режиме во флаконе, луночном планшете или другом контейнере, из которого он извлекается и вводится в первое устройство для регулирования потока 106. Образец также может быть получен из устройства для отбора образцов "у линии" и удерживаться в контуре или канале с текучей средой, из которых части биологического образца вводятся в первое устройство для регулирования потока 106.

Затем, на стадии 304, часть биологического образца вводят в первое устройство для регулирования потока 106. Введенная часть образца может быть необязательно очищена на стадии 306. Независимо от того, очищена она или нет, часть биологического образца доставляется ко второму устройству для регулирования потока 110, из которого она впоследствии доставляется на стадии 308 к анализатору образцов, связанному с представляющим интерес атрибутом качества продукта.

В анализаторе образцов часть биологического образца анализируется для определения значения связанного атрибута качества продукта для аналита в образце на стадии 310. После определения значения атрибута качества продукта, если значения всех атрибутов качества продукта для цикла анализа образца еще не были определены (см. стадию 312), управление возвращается к стадии 304, и другая часть биологического образца вводится в первое устройство для регулирования потока 106.

Альтернативным образом, если все значения атрибутов качества продукта были определены на стадии 312, то значения атрибутов могут необязательно передаваться блоком управления 122 на главный контроллер для корректирования одного или нескольких параметров процесса биопроизводства. Затем цикл анализа заканчивается на стадии 316.

Способы, с помощью которых биологический образец доставляется из первого устройства для регулирования потока 106 либо непосредственно во второе устройство для регулирования потока 110, либо во второе устройство для регулирования потока 110 через устройство для очистки образцов 108, зависят, среди прочего, от типа устройств для регулирования потока. На фиг. 4А-4С показаны примеры доставки биологического образца между первым и вторым устройствами для регулирования потока, когда первое и второе устройства для регулирования потока выполнены в виде многоходовых клапанов.

На фиг. 4A представлено схематическое изображение первого устройства для регулирования потока 106 с его конфигурацией, откорректированной так, чтобы оно находилось в первом положении, в котором соединены отверстия 1 и 2, соединены отверстия 3 и 4 и соединены отверстия 5 и 6. Биологический образец вводят в отверстие 2 из модуля управления образцами 102. Отверстие 2 соединено с отверстием 1, которое в свою очередь соединено со вторым устройством для регулирования потока 110 и модулем управления колонками 112. В результате образец напрямую доставляется ко второму устройству для регулирования потока 110, не проходя через устройство для очистки образцов 108.

На фиг. 4B и 4C представлены схематические изображения, демонстрирующие первое и второе устройства для регулирования потока 106 и 110, выполненные с возможностью доставки биологического образца в устройство для очистки образцов 108. На фиг. 4В, конфигурация первого устройства для регулирования потока такова, что устройство находится во втором положении, в котором соединены отверстия 2 и 3, соединены отверстия 4 и 5 и соединены отверстия 1 и 6. Второе устройство для регулирования потока выполнено в первом положении, в котором соединены отверстия 1 и 2, соединены отверстия 3 и 4 и соединены отверстия 5 и 6. Кроме того, устройство для очистки образцов 108 соединено между отверстиями 1 и 4, отверстие 3 соединено с резервуаром для отходов, а отверстие 2 соединено с отверстием 3 первого устройства для регулирования потока. Конфигурация, показанная на фиг. 4В, используется для загрузки биологического образца в колонку устройства для очистки образцов 108, при этом загрузочный буфер вводится через отверстие 1 первого устройства для регулирования потока.

Как только биологический образец загружен в колонку устройства для очистки образцов, конфигурации первого и второго устройств для регулирования потока корректируются, как показано на фиг. 4C, для элюирования биологического образца из колонки устройства для очистки образцов. В этой конфигурации второе устройство для регулирования потока откорректировано на другую конфигурацию, в которой соединены отверстия 2 и 3, соединены отверстия 4 и 5 и соединены отверстия 1 и 6. Кроме того, отверстие 6 второго устройства для регулирования потока 110 соединен с портом 1 первого устройства для регулирования потока 106. Для элюирования аналита из колонки устройства для очистки образцов буфер для элюирования доставляется к отверстию 5 второго устройства для регулирования потока, а элюированный аналит доставляется ко второму устройству для регулирования потока, а затем в один из анализаторов образцов, сообщающихся по текучей среде со вторым устройством для регулирования потока.

Анализ биологических образцов для определения значений атрибутов качества продукта в соответствии с системами и способами, описанными в данном документе, может быть преимущественным по различным причинам. Например, описанные системы могут функционировать как единая собирающая платформа для множества различных атрибутов качества продукта на протяжении всего процесса разработки (например, от разработки клеточной линии до разработки лекарственного препарата), обеспечивая непрерывность и согласованность данных в методологии сбора.

Кроме того, измерения атрибутов качества продукта могут использоваться для валидации спектроскопической модели и валидации текущей модели. Используя периодически измеряемые атрибуты качества продукта, например, спектроскопические модели можно поддерживать, валидируя точность прогнозирования хемометрических способов, использующих встроенные в технологическую линию измерения FTIR и/или методом комбинационного рассеяния.

Автоматизированный характер описанных в данном документе систем можно использовать для устранения трудоемких, повторяющихся аналитических стадий, которые в противном случае выполнялись бы вручную, экономя время и уменьшая вероятность того, что ошибка оператора повлияет на значения измеренных атрибутов. Аналогичным образом, интегрированная очистка образцов может выполняться, будучи встроенной в технологическую линию, что значительно сокращает время, необходимое для получения более чистых биологических образцов.

Описанные в данном документе системы и способы можно использовать для анализа собранных сред непосредственно в месте, близком к биореактору в производственной системе. Обратная связь, содержащая информацию об измеренных атрибутах качества продукта (например, обеспеченная блоком управления 122) может в некоторых вариантах осуществления обеспечивать более непосредственное и своевременное управление параметрами производственного процесса, которые можно корректировать для увеличения выхода продукта, снижения количества отходов и иного улучшения эффективности процессов биопроизводства.

В дополнение к приложениям, связанным с непосредственной оценкой атрибутов качества продукта для управления биореактором, значения атрибутов могут использоваться в процессе разработки клеточных линий. Например, способы, описанные в данном документе, можно применять для определения атрибутов качества продукта для терапевтического средства, представляющего собой моноклональное антитело, для анализа и сравнения различных клонов.

Интеграция и регулировка систем биопроизводства

Системы, раскрытые в данном документе, могут быть интегрированы в системы биопроизводства для обеспечения управления с обратной связью для различных компонентов и стадий в технологического процессах синтеза и очистки для ряда биологических продуктов.

Интегрированные и полностью непрерывные технологические процессы для получения лекарственных средств на основе терапевтических белков и других веществ могут включать, например, обеспечение жидкой культуральной среды, содержащей рекомбинантный терапевтический белок, который по сути не содержит клеток, а затем подачу жидкой культуральной среды в первую многоколоночную хроматографическую систему (MCCS1). Следующая стадия включает захват рекомбинантного терапевтического белка из жидкой культуральной среды с использованием MCCS1, а затем непрерывную подачу элюата MCCS1, содержащего рекомбинантный терапевтический белок, во вторую многоколоночную хроматографическую систему (MCCS2) и очистку и полировку белка с помощью MCCS2. Полученный в результате элюат из MCCS2 считается лекарственной субстанцией на основе терапевтического белка. Технологические процессы интегрированы и могут выполняться непрерывно начиная с жидкой культуральной среды и заканчивая элюатом из MCCS2, который представляет собой лекарственную субстанцию на основе терапевтического белка.

Системы биопроизводства обычно используются для выполнения вышеуказанных технологических процессов. Например, такие системы могут содержать MCCS1, которая предусматривает впускное отверстие, и MCCS2, которая предусматривает выпускное отверстие. В этих системах первая и вторая MCCS сообщаются друг с другом по текучей среде. Системы также выполнены таким образом, что жидкость может поступать во впускное отверстие, проходить через первую и вторую MCCS и выходить из производственной системы через выпускное отверстие.

Такие системы могут обеспечивать непрерывное и эффективное в отношении затрачиваемого времени получение терапевтической лекарственной субстанции из жидкой питательной среды. Например, время, прошедшее между подачей жидкости (например, жидкой культуральной среды), содержащей терапевтический белок, в первую MCCS и элюированием лекарственной субстанции на основе терапевтического белка (содержащей терапевтический белок) из выпускного отверстия второго MCCS, может составлять, например, от приблизительно 4 часов до приблизительно 48 часов.

На фиг. 8 представлено схематическое изображение, демонстрирующее пример системы биопроизводства. Система 1 содержит первую MCCS, т. е. четырехколоночную периодическую противоточную хроматографическую систему (PCCS) 2, где три из четырех колонок 3, 4 и 5 в четырехколоночной PCCS 2 выполняют отдельную операцию захвата рекомбинантного терапевтического белка из жидкости, содержащей рекомбинантный терапевтический белок (например, жидкой культуральной среды, которая по сути не содержит клеток млекопитающих), и одна из колонок 6 в PCCS 2 выполняет отдельную операцию по инактивации вирусов, присутствующих в элюате из колонок 3, 4 и 5 в PCCS 2, содержащем рекомбинантный терапевтический белок. Колонки 3, 4 и 5 могут содержать смолу, в которой реализован механизм захвата на основе связывания с белком А. Колонка 6 способна удерживать жидкость при pH приблизительно 3,75 в течение приблизительно 1 часа. PCCS 1 также имеет впускное отверстие 7. Впускное устройство 7 может представлять собой, например, отверстие, которое обеспечивает поступление жидкости в PCCS 1.

Система 1 также содержит вторую MCCS, которая представляет собой PCCS 8, которая содержит три хроматографические колонки 9, 10 и 11 и одну хроматографическую мембрану 12. Колонки 9, 10 и 11 в PCCS 8 могут содержать катионообменную смолу. Хроматографическая мембрана 12 в PCCS 8 может содержать катионообменную смолу. В PCCS 8 также имеется жидкостный трубопровод 13, расположенный между колонками 9, 10 и 11 в PCCS 8 и хроматографической мембраной 12 в PCCS 8. В PCCS 8 также имеется встроенный в технологическую линию резервуар 14 для регулировки буфера, который сообщается по текучей среде с жидкостным трубопроводом 13 и выполнен таким образом, что буфер, содержащийся внутри встроенного в технологическую линию резервуара 14 для регулировки буфера, вводят в жидкость, присутствующую в жидкостном трубопроводе 13. PCCS 8 также содержит выпускное отверстие 15. Выпускное отверстие 15 может представлять собой, например, отверстие, которое обеспечивает выход жидкости из PCCS 8.

Система 1 может дополнительно содержать жидкостный трубопровод 16, расположенный между PCCS 2 и PCCS 8. Система 1 также может содержать встроенный в технологическую линию резервуар 17 для регулировки буфера, сообщающийся по текучей среде с жидкостным трубопроводом 16, выполненный таким образом, что буфер, содержащийся во встроенном резервуаре 17 для регулировки буфера, может быть введен в жидкость, присутствующую в жидкостном трубопроводе 16. Система 1 также может содержать фильтр 18, расположенный в жидкостном трубопроводе 16, для фильтрации жидкости, присутствующей в жидкостном трубопроводе 16. Система 1 может также содержать буферную емкость 19, расположенную в жидкостном трубопроводе 16 и выполненную с возможностью удерживания любую жидкость в жидкостном трубопроводе 16, которая не может без промедления подаваться в PCCS 8.

Система 1 может дополнительно содержать насосную систему 20, которая сообщается по текучей среде с впускным отверстием 7. Насосная система 20 может содержать насос 21 для нагнетания жидкости во впускное отверстие 7. Система 1 может также содержать жидкостный трубопровод 22, расположенный между насосом 21 и впускным отверстием 7. Система 1 также может содержать фильтр 23, расположенный в жидкостном трубопроводе 22, для фильтрации жидкости (например, жидкой культуральной среды), присутствующей в жидкостном трубопроводе 22. Система 1 может также содержать буферную емкость 24, расположенную в жидкостном трубопроводе 22, выполненную таким образом, что буферная емкость 24 сообщается по текучей среде с жидкостным трубопроводом 22 и способна хранить любую жидкость, присутствующую в жидкостном трубопроводе 22, которая не способна войти во впускное отверстие 7.

Система 1 также может содержать биореактор 25 и жидкостный трубопровод 26, расположенный между биореактором 25 и насосом 21. Система фильтрации 27 может быть расположена в жидкостном трубопроводе 26 для фильтрации (например, удаления клеток из) жидкой культуральной среды, присутствующей в жидкостном трубопроводе 26.

Первая MCCS (PCCS 2) содержит впускное отверстие, через которое жидкость (например, жидкая культуральная среда, которая по сути не содержит клеток) может перемещаться в первую MCCS. Впускное отверстие может иметь любую структуру, известную из уровня техники для таких целей. Оно может предусматривать, например, резьбу, оребрение или уплотнение, которые позволяют вставлять жидкостный трубопровод таким образом, что после вставки жидкостного трубопровода во впускное отверстие жидкость будет поступать в первую MCCS через впускное отверстие без значительной просачивания жидкости из впускного отверстия.

Первая MCCS содержит по меньшей мере две хроматографические колонки, по меньшей мере две хроматографические мембраны или по меньшей мере одну хроматографическую колонку и по меньшей мере одну хроматографическую мембрану и впускное отверстие. Например, первая MCCS может в общей сложности содержать четыре хроматографические колонки или три хроматографические колонки и одну хроматографическую мембрану, или представлять собой любую другую из иллюстративных MCCS, описанных в данном документе, или иметь один или несколько из иллюстративных признаков MCCS (в любой комбинации), описанных в данном документе.

Хроматографическая(хроматографические) колонка(колонки) и/или хроматографическая(хроматографические) мембрана(мембраны), присутствующие в первой MCCS, могут содержать одну или несколько из ряда различных смол. Например, смола, содержащаяся в одной или нескольких хроматографических колонках и/или хроматографических мембранах, присутствующих в первой MCCS, может представлять собой смолу, в которой реализован механизм захвата (например, механизм захвата на основе связывания белком A, механизм захвата на основе связывания белком G, механизм захвата на основе связывания антителом или фрагментом антитела, механизм захвата на основе связывания субстратом, механизм захвата на основе связывания кофактором, механизм захвата на основе связывания аптамером и/или механизм захвата на основе связывания меткой). Смола, содержащаяся в одной или нескольких хроматографических колонках и/или хроматографических мембранах первой MCCS, может представлять собой катионообменную смолу, анионообменную смолу, смолу в качестве молекулярного сита или смолу, обеспечивающую гидрофобные взаимодействия, или любую их комбинацию. Дополнительные примеры смол, которые можно использовать для очистки рекомбинантного терапевтического белка, известны в данной области техники, и они могут содержаться в одной или нескольких хроматографических колонках и/или хроматографических мембранах, присутствующих в первой MCCS. Хроматографическая(хроматографические) колонка(колонки) и/или хроматографическая(хроматографические) мембраны, присутствующие в первой MCCS, могут содержать одинаковые и/или разные смолы (например, любые смолы, описанные в данном документе или известные в данной области техники для использования при очистке рекомбинантных белков).

Две или более хроматографических колонок и/или хроматографических смол, присутствующих в первой MCCS, могут выполнять одну или несколько отдельных операций (например, захват рекомбинантного терапевтического белка, очистку рекомбинантного терапевтического белка, полировку рекомбинантного терапевтического белка, инактивацию вирусов, регулировку концентрации ионов и/или pH жидкости, содержащей рекомбинантный терапевтический белок, или фильтрацию жидкости, содержащей рекомбинантный терапевтический белок). В неограничивающих примерах первая MCCS может выполнять отдельные операции по захвату рекомбинантного терапевтического белка из жидкости (например, жидкой культуральной среды) и инактивации вирусов, присутствующих в жидкости, содержащей рекомбинантный терапевтический белок. Первая MCCS может выполнять любую комбинацию двух или более отдельных операций, описанных в данном документе или известных в данной области техники.

Хроматографическая(хроматографические) колонка(колонки) и/или хроматографическая(хроматографические) мембрана(мембраны), присутствующие в первой MCCS, могут быть соединены или перемещены относительно друг друга с помощью механизма переключения (например, механизма переключения колонок). Первая MCCS может также содержать один или несколько (например, два, три, четыре или пять) насосов (например, автоматизированных, например, автоматизированных перистальтических насосов). События переключения колонок могут быть инициированы в результате обнаружения определенного уровня рекомбинантного терапевтического белка в жидкости, проходящей через первую MCCS (например, поступление в одну или несколько хроматографических колонок и/или хроматографических мембран в первой MCCS и/или элюирование из них), определенного объема жидкости (например, буфера) или определенного прошедшего времени. Переключение колонок обычно означает механизм, с помощью которого для по меньшей мере двух разных хроматографических колонок и/или хроматографических мембран в MCCS (например, двух или более разных хроматографических колонок и/или хроматографических мембран, присутствующих в MCCS (например, первой или второй MCCS)) обеспечивается прохождение другой стадии (например, уравновешивания, загрузки, элюирования или промывки) по сути в одно и то же время в течение по меньшей мере части технологического процесса.

PCCS 2, которая представляет собой первую MCCS, может содержать четыре хроматографические колонки, где первые три колонки выполняют отдельную операцию захвата рекомбинантного терапевтического белка из жидкости (например, жидкой культуральной среды), а четвертая колонка PCCS выполняет отдельную операцию по инактивации вирусов в жидкости, содержащей рекомбинантный терапевтический белок. В PCCS, которая представляет собой первую MCCS, может использоваться механизм переключения колонок. В системе PCC можно использовать модифицированную систему ÄKTA (GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси), в которой может функционировать, например, до четырех, пяти, шести, семи или восьми колонок или большее их количество.

События переключения колонок могут быть инициированы в результате обнаружения концентрации определенного белка или другого вещества в жидкости, элюируемой из одной из колонок PCCS 2 или PCCS 8, поток которой перемещается через фильтр в MCCS, которая содержится в буферной емкости MCCS, или поток которой перемещается через трубопровод в MCCS (например, между MCCS 1 и MCCS 2). Системы измерения, раскрытые в данном документе, могут использоваться для измерения концентраций таких белков и для передачи информации относительно концентрации контроллеру в системе 1, который инициирует такие события, как переключение колонок, фильтрация и транспортировка жидкости в системе 1.

Первая MCCS может быть оснащена одной или несколькими (например, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или десятью) системами измерения, выполненными с возможностью получения спектроскопической информации в инфракрасном диапазоне для технологических жидкостей (например, система 100), одним или несколькими (например, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или десятью) клапанами, одним или несколькими (например, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или десятью) pH-метрами, и/или одним или несколькими (например, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или десятью) измерителями проводимости. Первая MCCS также может быть оснащена контроллером с работающей операционной системой, которая использует программное обеспечение (например, программное обеспечение на основе Unicorn, GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси, или другое программное обеспечение, реализующее аналогичные функции) для определения того, когда должно произойти переключение колонок (например, на основе информации относительно концентрации, полученной на основе спектроскопических измерений в инфракрасном диапазоне, объема жидкости или прошедшего времени), и который влияет на (инициирует) события переключения колонок. Системы измерения могут быть необязательно размещены возле впускного отверстия одной или нескольких (например, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти) хроматографических колонок и/или хроматографических мембран в первой MCCS и/или возле выпускного отверстия одной или нескольких хроматографических колонок и/или хроматографических мембран в первой MCCS.

Первая MCCS может дополнительно содержать один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать один, двадцать два, двадцать три или двадцать четыре) встроенных в технологическую линию резервуаров для регулировки буфера и/или буферных резервуаров. В других примерах первая MCCS может содержать одну или несколько (например, две, три, четыре, пять или шесть) буферных емкостей, которые могут содержать жидкость, которая не может без промедления перемещаться в одну или несколько хроматографических колонок и/или хроматографических мембран в первой MCCS. Системы, описанные в данном документе, могут содержать одну или несколько буферных емкостей (например, буферную емкость, описанную в данном документе) в первой и/или второй MCCS. Другие примеры систем, описанных в данном документе, не содержат буферной емкости в первой MCCS или второй MCCS или не содержат буферной емкости во всей системе. Другие примеры систем содержат максимально одну, две, три, четыре или пять буферных емкостей во всей системе.

В некоторых вариантах осуществления первая MCCS может содержать устройство для инактивации вирусов. Например, как показано на фиг. 8, в некоторых вариантах осуществления первая MCCS содержит устройство 6 для инактивации вирусов (т. е., вместо колонки 6, описанной выше). Устройство для инактивации вирусов 6 выполнено с возможностью инактивации вирусов и вирусных векторов, используемых в процессах биопроизводства. В некоторых вариантах осуществления, например, устройство для инактивации вирусов 6 предусматривает смесительный сосуд. В качестве альтернативы в определенных вариантах осуществления, например, устройство 6 содержит систему инактивации пробкового потока. Каждый из этих примеров устройств для инактивации вирусов помогает устранять активные вирусы и вирусные векторы из технологических жидкостей в первой MCCS.

Вторая MCCS содержит по меньшей мере две хроматографические колонки, по меньшей мере две хроматографические мембраны или по меньшей мере одну хроматографическую колонку и по меньшей мере одну хроматографическую мембрану и выпускное отверстие. Например, вторая MCCS может содержать в общей сложности четыре хроматографические колонки, три хроматографические колонки и одну хроматографическую мембрану, или представлять собой любую другую из иллюстративных MCCS, описанных в данном документе, или может иметь один или несколько из иллюстративных признаков MCCS (в любой комбинации), описанных в данном документе. Хроматографическая(хроматографические) колонка(колонки) и/или хроматографическая(хроматографические) мембрана(мембраны), присутствующие во второй MCCS, характеризоваться одним или несколькими из: любыми из форм, размеров, объемов (объемов слоя) и/или отдельных операций, описанных в данном документе. Смола, содержащаяся в одной или нескольких хроматографических колонках и/или хроматографических мембранах, присутствующих во второй MCCS, может представлять собой смолу, в которой реализован механизм захвата (например, механизм захвата на основе связывания белком A, механизм захвата на основе связывания белком G, механизм захвата на основе связывания антителом или фрагментом антитела, механизм захвата на основе связывания субстратом, механизм захвата на основе связывания кофактором, механизм захвата на основе связывания меткой и/или механизм захвата на основе связывания аптамером). Применимые смолы включают, например, катионообменную смолу, анионообменную смолу, смолу в качестве молекулярного сита, смолу, обеспечивающую гидрофобные взаимодействия. Хроматографическая(хроматографические) колонка(колонки) и/или хроматографическая(хроматографические) мембраны, присутствующие во второй MCCS, могут содержать одинаковые и/или разные смолы (например, любые смолы, описанные в данном документе или известные в данной области техники для использования при очистке рекомбинантных белков).

Хроматографическая(хроматографические) колонка(колонки) и/или хроматографическая(хроматографические) мембрана(мембраны), присутствующие во второй MCCS, могут выполнять одну или несколько отдельных операций (например, любую из отдельных операций, описанных в данном документе, или любую комбинацию из отдельных операций, описанных в данном документе). В неограничивающих примерах вторая MCCS может выполнять отдельные операции по очистке рекомбинантного терапевтического белка из жидкости и полировке рекомбинантного терапевтического белка, присутствующего в жидкости, содержащей рекомбинантный терапевтический белок. В других неограничивающих примерах вторая MCCS может выполнять отдельные операции по очистке рекомбинантного терапевтического белка, присутствующего в жидкости, полировке рекомбинантного терапевтического белка, присутствующего в жидкости, и фильтрации жидкости, содержащей рекомбинантный терапевтический белок. В другом примере вторая MCCS может выполнять отдельные операции по очистке рекомбинантного терапевтического белка, присутствующего в жидкости, полировке рекомбинантного терапевтического белка, присутствующего в жидкости, фильтрации жидкости, содержащей рекомбинантный терапевтический белок, и регулировке концентрации ионов и/или pH жидкости, содержащей рекомбинантный терапевтический белок. Вторая MCCS может выполнять любую комбинацию двух или более отдельных операций, описанных в данном документе или известных в данной области техники.

Вторая MCCS может также содержать один или несколько (например, два, три, четыре или пять) насосов (например, автоматизированных, например, автоматизированных перистальтических насосов).

Хроматографическая(хроматографические) колонка(колонки) и/или хроматографическая(хроматографические) мембрана(мембраны), присутствующие во второй MCCS, могут быть соединены или перемещены относительно друг друга с помощью механизма переключения (например, механизма переключения колонок). События переключения колонок могут быть инициированы в результате обнаружения уровня рекомбинантного белка или другой субстанции с помощью спектрометрических измерений в инфракрасном диапазоне и их анализа с использованием хемометрических моделей, как обсуждалось выше, с определением уровня рекомбинантного терапевтического белка в жидкости, проходящей через вторую MCCS (например, поступающей в одну или несколько хроматографических колонок и/или хроматографических мембран во второй MCCS и/или элюируемой из них), определенного объема жидкости (например, буфера) или определенного прошедшего времени.

PCCS 8, которая образует вторую MCCS, может содержать три колонки, которые выполняют отдельную операцию очистки рекомбинантного терапевтического белка из жидкости, и хроматографическую мембрану, которая выполняет отдельную операцию полировки рекомбинантного терапевтического белка, присутствующего в жидкости. Например, три колонки, которые выполняют отдельную операцию очистки рекомбинантного терапевтического белка из жидкости, могут содержать, например, катионообменную смолу, а хроматографическая мембрана, которая выполняет отдельную операцию полировки, может содержать катионообменную смолу. В PCCS, которая представляет собой вторую MCCS, может использоваться механизм переключения колонок. Например, в PCCS может использоваться модифицированная система ÄKTA (GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси), в которой может функционировать, например, до четырех, пяти, шести, семи или восьми колонок или большее их количество.

Аналогично первой MCCS, вторая MCCS также может быть оснащена одной или несколькими (например, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или десятью) системами спектроскопических измерений в инфракрасном диапазоне, одним или несколькими (например, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или десятью) клапанами, одним или несколькими (например, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или десятью) pH-метрами и/или одним или несколькими (например, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или десятью) измерителями проводимости. Одна или несколько систем измерения передают информацию относительно концентрации белка или другого вещества в жидкости, которая подвергается измерению, в контроллер, который использует информацию относительно концентрации, чтобы определить имеется ли необходимость инициирования события переключения колонки. Вторая MCCS может быть оснащена операционной системой, исполняемой контроллером, который получает информацию относительно концентрации, которая использует программное обеспечение (например, программное обеспечение на базе Unicorn, GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси) для определения того, когда должно произойти событие переключения колонки (например, на основе спектроскопических измерений в инфракрасном диапазоне, объема жидкости или прошедшего времени), и инициирования событий переключения колонок. В примерах, когда вторая MCCS содержит одну или несколько спектроскопических систем измерения в инфракрасном диапазоне, системы измерения могут быть необязательно размещены возле впускного отверстия одной или нескольких (например, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти) хроматографических колонок и/или хроматографических мембран во второй MCCS и/или возле выпускного отверстия одной или нескольких хроматографических колонок и/или хроматографических мембран во второй MCCS.

Вторая MCCS может дополнительно содержать один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать один, двадцать два, двадцать три или двадцать четыре) встроенных в технологическую линию резервуаров для регулировки буфера и/или буферных резервуаров. В других примерах вторая MCCS может содержать одну или несколько (например, две, три, четыре, пять или шесть) буферных емкостей (например, любую из буферных емкостей, описанных в данном документе), которые могут содержать жидкость, которая не может без промедления перемещаться в одну или несколько хроматографических колонок и/или хроматографических мембран во второй MCCS.

Вторая MCCS содержит выпускное отверстие, через которое лекарственная субстанция на основе терапевтического белка может выходить из системы. Выпускное отверстие может предусматривать, например, резьбу, оребрение или уплотнение, которые позволяют вставлять жидкостный трубопровод или флакон, выполненный с возможностью содержания или хранения лекарственной субстанции на основе терапевтического белка. Выпускное отверстие может содержать поверхность, которую можно использовать для герметизации стерильного флакона или другого такого контейнера для хранения на выпускном отверстии для того, чтобы обеспечить перемещение потока рекомбинантного белкового лекарственного продукта непосредственно в стерильный флакон или контейнер для хранения.

Любой из жидкостных трубопроводов, описанных в данном документе, может представлять собой, например, трубку, которая выполнена, например, из полиэтилена, поликарбоната или пластмассы. Жидкостный трубопровод, расположенный между первой MCCS и второй MCCS, может дополнительно предусматривать одно или несколько из следующего в любой комбинации: один или несколько встроенных в технологическую линию резервуаров для регулировки буфера, которые сообщаются по текучей среде с жидкостным трубопроводом и расположены таким образом, что буфер, хранящийся внутри встроенного в технологическую линию резервуара (резервуаров) для регулировки буфера, добавляется к жидкости, присутствующей в жидкостном трубопроводе; буферную емкость (например, любую из буферных емкостей, описанных в данном документе), которая сообщается по текучей среде с жидкостным трубопроводом и расположена таким образом, что она может удерживать любую избыточную жидкость, присутствующую в жидкостном трубопроводе, которая не может без промедления подаваться во вторую MCCS; и один или несколько фильтров, которые расположены в жидкостном трубопроводе таким образом, что они способны фильтровать жидкость (например, удалять бактерии), присутствующую в жидкостном трубопроводе. Любой из встроенных в технологическую линию резервуаров для регулировки буфера может содержать, например, объем от приблизительно 0,5 л до 50 л буфера (например, при температуре 50ºC, 37ºC, 25ºC, 15ºC или 10ºC или ниже).

Системы, описанные в данном документе, могут необязательно содержать жидкостный трубопровод, расположенный между конечной хроматографической колонкой или хроматографической мембраной во второй MCCS и выпускным отверстием. Системы, описанные в данном документе, могут дополнительно содержать один или несколько фильтров, находящихся в жидкостном соединении с жидкостным трубопроводом, расположенным между конечной хроматографической колонкой или хроматографической мембраной во второй MCCS и выпускным отверстием, вследствие чего фильтр может удалять, например, осажденный материал, твердые частицы или бактерии из жидкости, присутствующей в жидкостном трубопроводе, расположенном между последней хроматографической колонкой или хроматографической мембраной во второй MCCS и выпускным отверстием.

Некоторые примеры систем, представленных в данном документе, также предусматривают биореактор, который находится в жидкостном соединении с впускным отверстием первой MCCS. В системах по настоящему изобретению можно использовать любой из иллюстративных биореакторов, описанных в данном документе или известных в данной области техники.

Некоторые примеры систем, представленных в данном документе, также предусматривают наличие насосной системы. Насосная система может предусматривать одно или несколько из следующего: один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять) насосов (например, любых насосов, описанных в данном документе или известных в данной области техники), один или несколько (например, два, три, четыре или пять) фильтров (например, любых фильтров, описанных в данном документе или известных в данной области техники), один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть , семь, восемь, девять или десять) УФ-детекторов и одну или несколько (например, две, три, четыре или пять) буферных емкостей (например, любых буферных емкостей, описанных в данном документе). Некоторые примеры систем, представленных в данном документе, дополнительно предусматривают жидкостный трубопровод, расположенный между насосом и впускным отверстием первой MCCS (например, любой из иллюстративных жидкостных трубопроводов, описанных в данном документе или известных в данной области техники). В некоторых примерах этот конкретный жидкостный трубопровод может предусматривать один или несколько (например, два, три или четыре) насосов (например, любых насосов, описанных в данном документе или известных в данной области техники) и/или одну или несколько (например, две, три или четыре) буферных емкостей (например, любых иллюстративных буферных емкостей, описанных в данном документе), где этот(эти) насос(насосы) и/или буферная(буферные) емкость(емкости) находятся в жидкостном соединении с жидкостью, присутствующей в жидкостном трубопроводе.

Некоторые примеры систем, описанных в данном документе, дополнительно предусматривают дополнительный жидкостный трубопровод, соединенный с жидкостным трубопроводом, расположенным между насосом и впускным отверстием, где один конец дополнительного жидкостного трубопровода находится в жидкостном соединении с биореактором, а другой конец находится в жидкостном соединении с жидкостным трубопроводом, расположенным между насосом и впускным отверстием. Этот дополнительный жидкостный трубопровод может содержать фильтр, который способен удалять клетки из жидкой культуральной среды, извлекаемой из биореактора (например, систему удержания клеток ATF).

Вышеупомянутые системы биопроизводства позволяют осуществлять непрерывное получение лекарственной субстанции на основе терапевтического белка. Например, системы, представленные в данном документе, обеспечивают процентный показатель выхода рекомбинантного терапевтического белка (из исходного материала, например, исходной жидкой культуральной среды), составляющий более чем приблизительно 70%, более чем приблизительно 80%, более чем приблизительно 82%, более чем приблизительно 84%, более чем приблизительно 86%, более чем приблизительно 88%, более чем приблизительно 90%, более чем приблизительно 92%, более чем приблизительно 94%, более чем приблизительно 96% или более чем приблизительно 98%. Системы, описанные в данном документе, также могут обеспечивать получение в результате процентного показателя выхода рекомбинантного терапевтического белка (из исходного материала, например, исходной жидкой культуральной среды), составляющего от приблизительно 80% до приблизительно 90%, от приблизительно 82% до приблизительно 90%, от приблизительно 84% до приблизительно 90%, от приблизительно 84% до приблизительно 88%, от приблизительно 84% до приблизительно 94%, от приблизительно 82% до приблизительно 92% или от приблизительно 85% до приблизительно 95%.

Системы, описанные в данном документе, также могут обеспечивать получение в результате лекарственной субстанции на основе терапевтического белка, которая предусматривает содержание рекомбинантного терапевтического белка в концентрации, которая составляет более чем приблизительно 1,0 мг/мл, например, более чем приблизительно 15 мг/мл, более чем приблизительно 20 мг/мл, более чем приблизительно 25 мг/мл, более чем приблизительно 30 мг/мл, более чем приблизительно 35 мг/мл, более чем приблизительно 40 мг/мл, более чем приблизительно 45 мг/мл, более чем приблизительно 50 мг/мл, более чем приблизительно 55 мг/мл, более чем приблизительно 60 мг/мл, более чем приблизительно 65 мг/мл, более чем приблизительно 70 мг/мл, более чем приблизительно 75 мг/мл, более чем приблизительно 80 мг/мл, более чем приблизительно 85 мг/мл, более чем приблизительно 90 мг/мл, более чем приблизительно 100 мг/мл, более чем приблизительно 125 мг/мл или более чем приблизительно 150 мг/мл.

Как обсуждалось выше, в некоторых вариантах осуществления первая и/или вторая MCCS может представлять собой периодическую противоточную хроматографическую систему (PCCS). PCCS может, например, содержать две или более хроматографических колонок (например, три колонки или четыре колонки), которые переключают с целью обеспечения непрерывного элюирования рекомбинантного терапевтического белка из двух или более хроматографических колонок. PCCS может содержать две или более хроматографических колонок, две или более хроматографических мембран или по меньшей мере одну хроматографическую колонку и по меньшей мере одну хроматографическую мембрану. Технологическая операция в колонке обычно состоит из стадий загрузки, промывки, элюирования и регенерации. В PCCS несколько колонок применяют для проведения тех же стадий по отдельности и непрерывно циклическим образом. Поскольку колонки функционируют последовательно, вышедший поток и промывная жидкость из одной колонки захватывается другой колонкой. Этот уникальный признак PCCS обеспечивает возможность загрузки смолы до значений, близких к ее статической связывающей емкости, а не значений динамической связывающей емкости, типичных в ходе хроматографии в периодическом режиме.

Пример методики переключения трех колонок, используемой в PCCS, содержащей три колонки, показан на фиг. 9. Цикл определяется как три полные технологические операции в колонках, в результате которых получают объединенные фракции элюата из каждой из трех колонок, применяемых в методике переключения колонок. После завершения всех стадий в цикле цикл повторяется. В результате непрерывного проведения циклов и элюирования жидкость, поступающая в PCCS, подвергается непрерывной обработке, в то время как элюирование рекомбинантного терапевтического белка из каждой колонки является дискретным и периодическим.

Для перехода от одной стадии к другой в цикле PCCS, таком как иллюстративный цикл, показанный на фиг. 9, используется стратегия переключения колонок. В способе переключения колонок используются две операции автоматического переключения на колонку в трех колонках в иллюстративной системе PCCS, показанной на фиг. 9, первая из которых связана с начальным прорывом продукта, а вторая с насыщением колонки. Определение того, когда должны происходить операции переключения колонок, основано на информации относительно концентраций рекомбинантного терапевтического белка в элюате из каждой хроматографической колонки в PCCS.

Как обсуждалось выше, подходящий анализатор образцов может использоваться для определения концентраций рекомбинантных терапевтических белков в элюате из колонок PCCS. Информация относительно концентрации, которая несет функцию обеспечения управления с обратной связью для системы биопроизводства, передается блоком управления 122 контроллеру MCCS, который инициирует переключение колонок после определения того, что переключение является обоснованным.

В качестве примера во время загрузки колонки система управления PCC может определять исходный уровень концентрации субстанции на основе терапевтического белка, элюируемой из колонки (который обычно характеризуется нулевой концентрацией), с использованием систем спектроскопического измерения в инфракрасном диапазоне, описанных выше. Во время активного элюирования в ходе прорыва белковой субстанции происходит увеличение (например, выше исходного уровня концентрации) измеряемой концентрации белка. Система продолжает мониторинг возрастающей концентрации белка, и когда концентрация достигает заранее определенного порогового значения, непрерывный поток из колонки 1 направляется в колонку 2, а не в отходы. Номинально это происходит в момент времени t₁.

При продолжающейся подаче в колонку 1 колонка 1 в конечном итоге подвергается почти полному насыщению белковым продуктом. В этот момент измеряемая концентрация белка в элюате достигает другого заранее определенного значения, что происходит в момент времени t₂. В этот момент контроллер MCCS переключает подачу на впускном отверстии в колонку 2.

Вышеупомянутая стратегия переключения колонок обеспечивает равномерную загрузку колонок независимо от концентрации подаваемого продукта и емкости. Могут быть реализованы аналогичные переключения колонок в зависимости от уровня рекомбинантного белка, обнаруживаемого в элюате из каждой колонки. События переключения колонок также могут быть основаны на прошедшем времени или количестве жидкости (например, буфера), прошедшей через одну или несколько хроматографических колонок и/или хроматографических мембран в первой или второй MCCS.

В дополнение к предоставлению информации обратной связи для управления событиями переключения колонок системы измерения, описанные в данном документе, также могут предоставлять информацию обратной связи для регулировки различных других стадий биопроизводства и рабочих параметров. Одним из примеров таких регулировок является контролируемая регулировка концентраций буфера на различных стадиях технологических процессов биопроизводства.

Как правило, один или несколько (например, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать один, двадцать два, двадцать три или двадцать четыре) различных типов буфера могут применяться во время использования двух или более MCCS в любом из технологических процессов, описанных в данном документе. Как известно из уровня техники, один или несколько типов буферов, применяемых в двух или более MCCS, используемых в технологических процессах, описанных в данном документе, будут зависеть от смолы, находящейся в хроматографической(хроматографических) колонке(колонках) и/или хроматографической(хроматографических) мембране(мембранах) в двух или более MCCS (например, первой и второй MCCS), рекомбинантного терапевтического белка и отдельной операции (например, любой из иллюстративных отдельных операций, описанных в данном документе), осуществляемой конкретной(конкретными) хроматографической(хроматографическими) колонкой(колонками) и/или хроматографическими мембранами в двух или более MCCS. Объем и тип буфера, используемого в ходе применения двух или более MCCS при осуществлении любого из технологических процессов, описанных в данном документе, также может определить специалист в данной области техники (например, как обсуждается более подробно ниже). Например, объем и тип(типы) буфера, используемого в ходе применения двух или более MCCS в любом из технологических процессов, описанных в данном документе, могут быть выбраны с целью оптимизации одного или нескольких из следующих свойств лекарственного препарата на основе рекомбинантного белка: общего выхода рекомбинантного терапевтического белка, активности рекомбинантного терапевтического белка, степени чистоты рекомбинантного терапевтического белка и удаления биологических загрязнителей из жидкости, содержащей рекомбинантный терапевтический белок (например, отсутствие активных вирусов, микобактерий, дрожжей, бактерий или клеток млекопитающих).

Отдельные операции по регулировке концентрации ионов и/или pH жидкости, содержащей рекомбинантный терапевтический белок, могут выполняться с использованием MCCS (например, первой и/или второй MCCS), в которой предусматривается и используется резервуар для регулировки буфера (например, встроенный в технологическую линию резервуар для регулировки буфера), который добавляет новый или дополнительный буферный раствор в жидкость, содержащую рекомбинантный терапевтический белок (например, между колонками в пределах одной MCCS или после последней колонки в предпоследней MCCS (например, в первой MCCS) и перед подачей жидкости, содержащей рекомбинантный терапевтический белок, в первую колонку следующей MCCS (например, второй MCCS). Встроенный в технологическую линию резервуар для регулировки буфера может быть любого размера (например, более 100 мл) и может содержать любой буферный раствор (например, буферный раствор, который имеет одну или несколько из следующих характеристик: повышенный или пониженный pH по сравнению с жидкостью, содержащей рекомбинантный терапевтический белок, повышенную или пониженную концентрацию ионов (например, соли) по сравнению с жидкостью, содержащей рекомбинантный терапевтический белок, и/или повышенную или пониженную концентрацию средства, которое конкурирует с рекомбинантным терапевтическим белком за связывание со смолой, присутствующей в по меньшей мере одной хроматографической колонке или в по меньшей мере одной хроматографической мембране в MCCS (например, в первой или второй MCCS)).

В некоторых вариантах осуществления определение с помощью контроллера MCCS количества буферного раствора, подлежащего добавлению к технологической жидкости, основано на информации относительно концентрации или титра аналита в биологическом образце. Например, растворенное вещество для целей таких измерений может представлять собой компонент буферного раствора или компонент технологической жидкости, концентрация которого связана с составом буфера для жидкости, pH технологической жидкости и/или ионной силой технологической жидкости. Измерение информации относительно концентрации для компонента передается в качестве информации обратной связи в контроллер MCCS, который использует информацию обратной связи для определения того, когда и какое количество одного или нескольких буферных растворов необходимо высвободить в технологическую жидкость. Спектроскопические системы измерения в инфракрасном диапазоне, как правило, могут быть размещены в любом местоположении системы биопроизводства с целью измерения характеристик технологических жидкостей для передачи информации обратной связи, связанной с буфером, в контроллер MCCS.

В определенных вариантах осуществления информация относительно концентрации антитела в технологической жидкости может использоваться для управления скоростью, с которой культуры клеток вводятся в биореактор. В частности, определяя значение концентрации антитела в технологической жидкости, собираемой из биореактора, контроллер MCCS может регулировать скорость поступления культуры клеток в биореактор. Регулировка, выполняемая таким образом, позволяет контролировать объемную производительность, определяемую на основе плотности клеток и удельной производительности биореактора. Для фиксированной скорости перфузии такие регулировки позволяют контролировать концентрацию антитела в технологической жидкости таким образом, что MCCS1 будет получать примерно постоянное количество продукта в единицу времени. Другими словами, регулировки такого рода могут быть использованы для обеспечения того, чтобы скорость образования продукта в биореакторе оставалась примерно постоянной на протяжении определенного периода времени.

В некоторых вариантах осуществления определение конкретных атрибутов качества, ассоциированных с технологическими жидкостями, может использоваться контроллером MCCS для определения того, работает ли система биопроизводства в приемлемом диапазоне параметров или в ходе своей работы система находится за пределами одного или нескольких приемлемых диапазонов параметров.

Для каждого из одного или нескольких атрибутов качества диапазон приемлемых значений может быть установлен с помощью процедур калибровки. Эти диапазоны эффективно устанавливают рабочие условия для системы, в которых биологические продукты образуются с приемлемыми скоростями и уровнями чистоты, в то время как показатели выхода побочных продуктов и других нежелательных соединений находятся на приемлемо низких уровнях. Когда система работает за пределами одного или нескольких диапазонов, показатели выхода и/или чистоты продукта могут снижаться, показатели скорости/количества образования нежелательных соединений могут повышаться, показатели скорости потребления реагентов могут повышаться и/или, как результат, могут иметь место другие нежелательные эффекты или состояния.

Атрибуты качества, определенные для технологических жидкостей в одном или нескольких местоположениях внутри системы, могут использоваться для обеспечения работы системы в приемлемых диапазонах этих рабочих параметров. Если определенные значения одного или нескольких атрибутов качества выходят за пределы установленных допустимых диапазонов, контроллер MCCS определяет, что имеет место потенциальное неисправное состояние.

Для устранения неисправного состояния контроллер MCCS (или другой системный контроллер, подключенный к контроллеру MCCS) может регулировать любые рабочие параметры системы биопроизводства для изменения ее работы, тем самым также регулируя значения атрибутов качества таким образом, чтобы они попадали в приемлемые диапазоны. Корректирующие действия такого характера гарантируют, что на основе обратной связи, обеспечиваемой определенными значениями атрибутов качества, система может активно поддерживаться в рамках установленной совокупности или диапазона рабочих условий.

В определенных вариантах осуществления, если контроллер MCCS (или другой системный контроллер, подключенный к контроллеру MCCS) определяет, что система находится значительно за пределами приемлемого диапазона рабочих условий, вследствие чего возврат системы в приемлемый диапазон условий будет затруднен, или даже невозможен, или может привести к другим нежелательным последствиям, контроллер может передавать управляющие сигналы в биореактор, обеспечивающие прекращение процедуры получения и высвобождение его содержимого в отходы. В таком случае эффективные корректирующие действия нецелесообразны или невозможны, поскольку технологический процесс получения значительно отклонился от приемлемого диапазона рабочих условий для системы. В результате простого высвобождения содержимого биореактора система может значительно сэкономить время, перезапустив технологический процесс получения, вместо того, чтобы пытаться отрегулировать текущий технологический процесс получения, который мог безвозвратно отклониться от приемлемого диапазона условий.

Кроме того, в контроллер MCCS (или другой системный контроллер) могут передаваться данные обратной связи на основе измеряемых значений одного или нескольких компонентов среды биореактора (таких как концентрация глюкозы, концентрация глутамина, концентрация лактата и концентрация ионов аммония), которые затем могут быть использованы для регулировки условий в реакторе для того, чтобы гарантировать, что жизнеспособность клеток, показатели выхода продукта и другие показатели производительности поддерживаются в рамках целевых диапазонов. Контроллер может регулировать любые из одного или нескольких параметров технологического процесса на основе значений компонентов среды биореактора аналогично регулировкам, выполняемым на основе атрибутов качества продукта и значений других измеряемых величин.

Реализация аппаратного и программного обеспечения

Блок управления 122 может быть выполнен с возможностью выполнения любой из описанных в данном документе функций управления и может быть реализован в аппаратном обеспечении, программном обеспечении или в комбинации как аппаратного, так и программного обеспечения. Блок управления 122 обычно включает по меньшей мере один электронный процессор, подключенный к блоку памяти, устройство хранения данных, устройство вывода (например, дисплей) и устройство пользовательского интерфейса (например, клавиатуру, мышь, сенсорную панель, сенсорный дисплей). Блок управления 122 принимает информацию в виде электрических сигналов от компонентов системы по некоторым или всем линиям управления, показанным в данном документе, и передает электрические сигналы управления по линиям управления компонентам системы.

Стадии способа и функции управления, описанные в данном документе, могут быть реализованы в компьютерных программах с использованием стандартных или проприетарных языков программирования. Такие программы предназначены для выполнения блоком управления 122 (например, электронным процессором блока управления) и вызывают выполнение блоком управления описанных стадий и функций. Каждая программа может быть сохранена на машиночитаемом носителе данных (например, на оптическом, магнитном, твердотельном, перезаписываемом или другом постоянном носителе данных). Примером проприетарного языка программирования, который можно использовать для предоставления инструкций блоку управления 122, является пакет программного обеспечения Empower^® (Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США).

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры представлены для дополнительной иллюстрации различных аспектов вышеизложенного изобретения, но не предназначены для ограничения каким-либо иным образом каких-либо признаков формулы изобретения или ограничения каких-либо аспектов вариантов осуществления, если явно не указано другое.

Пример 1.

Систему 100 использовали для анализа антитела к TGFβ из перфузионного биореактора, работающего при интенсивном процессе перфузии. Система включала модуль управления образцами (PSM), нагреватель колонок (CH), модуль управления колонками (CM), содержащий два 1-позиционных клапана с 9 отверстиями, бинарный насос (BSM), четвертичный насос (QSM) с дополнительным клапаном выбора растворителя на линии "D", детектор PDA (PDA), 2-позиционный клапан выбора колонки с 10 отверстиями, содержащий петлю для хранения образца из нержавеющей стали объемом 5 мл (все получены от Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США) и два вспомогательных 2-позиционных переключающих клапана IDEX с 6 отверстиями.

Собранный материал из биореактора отбирали автоматически с использованием MAST (модульной автоматизированной технологии отбора образцов) (полученной от Lonza, Базель, Швейцария), соединенной с жидкостным манипулятором (полученным от Gilson, Миддлтон, Висконсин, США). Система MAST откачивала ~ 40 мл собранного материала с помощью поршневых насосов для очистки линий, прежде чем поместить 10 мл собранного материала в прозрачный стеклянный флакон объемом 12 мл на платформе жидкостного манипулятора. Затем жидкостный манипулятор переносил 7,5 мл собранного материала в систему 100 путем повторного введения материала в линию переноса из полиэфирэфиркетоновых трубок, соединяющую жидкостный манипулятор и систему всасывания. Образец переносили непосредственно в петлю для удержания образца объемом 5 мл, где он удерживался до анализа образца.

После завершения переноса образца компьютер MAST отправлял сигнал на блок управления 122 для инициализации набора способов, указанного в программном обеспечении Empower^® 3.

Набор способов для этого примера включал функцию загрузки петли, две инъекции в колонку с белком А (Pro A) устройства для очистки образцов при двух массовых нагрузках, две инъекции в колонку для эксклюзионной хроматографии при 2 массовых нагрузках, промежуточные способы промывки водой между методиками разделения (Pro A и эксклюзионной хроматографией (SEC)) общих компонентов системы и, наконец, очистку петли 20% метанолом и конечный сегмент для того, чтобы убедиться, что петля находится в правильном положении для приема большего количества образца. Следует отметить, что всякий раз, когда упоминается вторичная колонка (например, SEC), следует исходить из того, что этот способ включает встроенную в технологическую линию очистку с помощью Pro A, если не указано иное.

Для каждой инъекции 1 мл собранного материала выкачивали из удерживающей петли и переносили в петлю для ввода образца объемом 50 мкл для введения полного объема петли в систему. Для тестирования различных массовых загрузок выполнялось как введение полного объема петли, так и разведение в режиме реального времени 1:2 с использованием 1X фосфатно-солевого буфера (PBS) при pH 7,2.

Очистку образцов для анализа титра проводили на колонке Thermo POROS A 2,1×30 мм, 20 мкм (т. е. колонке для аффинной хроматографии с белком А). Детали градиента для первого и второго насосов показаны в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Параметры способа с первым (бинарным) насосом для анализа титра

Время
(мин.) Расход (мл/мин.) Буфер А (%) Буфер B (%) 0,00 0,250 100 0 1,00 0,250 100 0 1,10 1,000 100 0 2,10 1,000 100 0 2,20 0,100 100 0 2,40 0,100 100 0 2,50 0,500 100 0 2,90 0,500 100 0 3,00 0,100 100 0 3,20 0,100 100 0 3,30 0,750 0 100 4,80 0,750 0 100 5,00 1,000 100 0 7,00 1,000 100 0 7,50 0,000 100 0

Таблица 2. Параметры способа со вторым (четвертичным) насосом для анализа титра

Время
(мин.) Расход (мл/мин.) Буфер А (%) 0,00 0,750 100 2,10 0,750 100 2,20 0,100 100 2,40 0,100 100 2,50 1,200 100 2,90 1,200 100 3,00 0,100 100 3,20 0,100 100 3,30 0,750 100 7,00 0,750 100 7,50 0,000 100

Для способа, показанного в таблице 1, буфер А представлял собой 1X фосфатно-солевой буфер Дульбекко при рН 7,2, а буфер В представлял собой 20 мМ фосфата натрия, 1 М хлорида натрия и 7,5% изопропанола при рН 8,0. Для способа, показанного в таблице 2, буфер А представлял собой 0,1 М фосфат-цитрата, 0,14 М хлорида натрия при рН 3,2.

Система была выполнена с возможностью направления очищенного образца непосредственно на детектор 116 (детектор PDA) без прохождения через какие-либо анализаторы образцов на основе колонки. Разделение контролировали при коэффициенте поглощения на 280 нм. Колонку с белком А хранили при комнатной температуре в условиях окружающей среды. После обнаружения в детекторе PDA измеренную хроматограмму интегрировали для расчета площади под кривой пика, соответствующего элюированному белку, через ~2,5 мин. Затем площадь моноклонального антитела количественно определяли с использованием калибровочной кривой, построенной для массовых нагрузок от 50 мкг до 2 мкг на колонке, нанесенной на график в зависимости от площади.

На фиг. 5А представлен график, демонстрирующий хроматограммы в отношении титра для чистого образца и образца, разведенного в соотношении 1:2, а на фиг. 5B представлена таблица, демонстрирующая рассчитанные массовые нагрузки и концентрации из 6 различных циклов при каждом соотношении разведения. Данные показывают отличную воспроизводимость между циклами, как визуально, так и среди расчетных результатов.

Анализ агрегации проводили с использованием способа эксклюзионного разделения на колонке Waters UPLC BEH SEC 4,6×300 мм, 1,7 мкм и 200 Å. Детали градиента для первого и второго насосов показаны в таблицах 3 и 4.

Таблица 3. Параметры способа с первым (бинарным) насосом для анализа агрегации

Время
(мин.) Расход (мл/мин.) Буфер А (%) Буфер B (%) 0,00 0,250 100 0 1,00 0,250 100 0 1,10 1,000 100 0 2,10 1,000 100 0 2,20 0,000 100 0 2,40 0,000 100 0 2,50 0,500 100 0 8,00 0,500 100 0 8,10 0,000 100 0 8,30 0,000 100 0 8,40 0,750 0 100 10,00 0,750 0 100 10,20 1,000 100 0 13,50 1,000 100 0 14,00 0,000 100 0 22,50 0,000 100 0

Таблица 4. Параметры способа со вторым (четвертичным) насосом для анализа агрегации

Время
(мин.) Расход (мл/мин.) Буфер А (%) Буфер B (%) 0,00 0,500 100 0 2,10 0,500 100 0 2,20 0,000 100 0 2,40 0,000 100 0 2,50 0,100 100 0 5,00 0,100 100 0 5,50 0,100 0 100 8,00 0,100 0 100 8,10 0,000 0 100 8,30 0,000 0 100 8,40 0,350 0 100 22,00 0,350 0 100 22,50 0,000 0 100

Для способа, показанного в таблице 3, буфер А представлял собой 1X фосфатно-солевой буфер Дульбекко при рН 7,2, а буфер В представлял собой 20 мМ фосфата натрия, 1 М хлорида натрия и 7,5% изопропанола при рН 8,0. Для способа, показанного в таблице 4, буфер А представлял собой 0,1 М фосфат-цитрата и 0,14 М хлорида натрия при рН 3,2, а буфер В представлял собой 1X фосфатно-солевой буфер Дульбекко при рН 7,2.

Модуль управления колонками был выполнен с возможностью направления образца в анализатор образцов с колонкой для эксклюзионной хроматографии. Разделение аналита и других компонентов контролировали при коэффициенте поглощения на 280 нм. Эксклюзионную колонку поддерживали при 25°С в 30-сантиметровом нагревателе колонок, в то время как колонка с белком А находилась в условиях окружающей среды. После обнаружения в детекторе PDA 116 записанную хроматограмму интегрировали для расчета площади под кривой для пиков, соответствующих высокомолекулярным соединениям (до основного пика), основным соединениям и низкомолекулярным соединениям (после основного пика).

На фиг. 6А представлен график, демонстрирующий хроматограммы в отношении титра для чистого образца и образца, разведенного в соотношении 1:2, а на фиг. 6В показаны таблицы с информацией об измеренных пиках для 6 различных образцов при каждом из двух соотношений разведения. Данные показывают отличную воспроизводимость между циклами, как визуально, так и среди расчетных результатов. Существуют некоторые различия в процентах пиков между массовыми нагрузками, которые могут быть следствием самой колонки.

На фиг. 7 представлен график, демонстрирующий измеренные хроматограммы из эксперимента, в котором образцы отбирались каждые 1,5 часа, всего 12 образцов. В этих экспериментах только 1 массовую нагрузку доставляли как в колонку с белком А, так и в колонку для эксклюзионной хроматографии: оперативное разведение 1:2 в модуле управления образцами с 1X PBS при pH 7,2. Как титр, так и атрибут качества продукта, представляющий собой агрегацию, показали отличную воспроизводимость среди 12 образцов.

Для обращенно-фазового анализа разделение проводили на колонке Waters BioResolve Polyphen 2,1×100 мм, 2,7 мкм, 450 Å с использованием 0,1% трифторуксусной кислоты в воде (подвижная фаза А), 0,1% трифторуксусной кислоты в 10% изопропаноле, 90% ацетонитрила (подвижная фаза B) и 20 мМ ацетата натрия, pH 3,75 (элюент колонки с белком A). Для сильного катионообменного анализа разделение выполняли на колонке Thermo MabPac SCX-10 RS, 2,1×150 мм, 5 мкм. Подвижные фазы представляли собой 20 мМ ацетата натрия при рН 3,75 (как подвижная фаза А, так и элюент с белком А) и 20 мМ трисацетата, 25 мМ хлорида натрия при рН 9,8 (подвижная фаза В). В настоящее время в данном способе используется кривизна градиента для создания "S"-подобного градиента для оптимального пикового разрешения.

Вышеуказанные способы использовали для анализа проб "у линии". Как обсуждалось выше, система 100 может также анализировать автономные пробы с использованием, например, модуля, представляющего собой проточную иглу, в модуле управления образцами (доступного от Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США). С помощью проточной иглы образец вводится непосредственно из флакона или луночного планшета. Объем инъекции может варьировать по необходимости от 1 мкл до 100 мкл. Эта гибкость позволяет варьировать массовые нагрузки на колонки без выполнения разведения в реальном времени. Кроме того, в этой версии системы отсутствует петля для удерживания образца, поскольку весь объем образца содержится во флаконе или луночном планшете, и для каждого флакона разрешено несколько инъекций.

Пример 2. Применение MIMICS-mPQA для мониторинга процессов "у линии" в отношении разработки процессов и биореакторов полупромышленного масштаба

Обзор эксперимента

Платформу MIMICS-mPQA применяли к циклу 100 л в требуемом масштабе моноклонального терапевтического антитела к TGFβ. Образцы собранных материалов прогоняли на платформе MIMICS-mPQA для сбора информации о качестве продукта "у линии" по 3 атрибутам: титру, агрегации и чистоте/целостности.

Анализируемые образцы представляли собой собранный материал (после ATF) из 100-литрового биореактора и 2 вспомогательных 3-литровых биореакторов. Для анализа использовали колонку для аффинной хроматографии с белком A (Pro A) для определения титра, колонку с белком A в одной технологической линии с колонкой для эксклюзионной хроматографии (SEC) для анализа агрегации и колонку с белком A в одной технологической линии с колонкой для обращенно-фазовой (RP) хроматографии для информации о чистоте/целостности. Тестирование проводилось в течение 4-недельного периода, в течение которого образцы запускались блоками по ~ 4 дня сбора материала из всех реакторов в каждой очереди. Во время анализа подвижные фазы системы заменяли по мере необходимости после израсходования.

На каждый проанализированный день сбора материала из каждого биореактора 0,75 мл материала переносили во флакон устройства для автоматического сбора образцов и помещали в систему MIMICS-mPQA. Каждый образец вводили на 1 цикл анализа в систему для количественного определения 3 целевых атрибутов. Объем введения оставался постоянным на уровне 20 мкл, но массовые нагрузки на каждую колонку варьировались путем применения различных коэффициентов разведения в реальном времени в диапазоне от 1:2 до 1:10 для целевых линейных областей каждого способа на основе предыдущего опыта разработки. Короче говоря, нагрузки на колонку Pro A были рассчитаны на уровне 10-25 мкг, на колонку SEC - на уровне 20-50 мкг, и на колонку RP - на уровне 3-7 мкг.

Для способа титрования Pro A стандартную кривую проводили в начале всего цикла и снова во второй точке после замены буфера Pro A, для всей этого цикла проводили всего 2 стандартные кривые. Стандартную кривую строили с помощью различных разведений в реальном времени исходного антитела к TGFβ DS в концентрации 2,5 мг/мл для получения кривой от 2 до 50 мкг на колонке.

Исходный материал, используемый для стандартной кривой, предварительно разбавляли для предыдущих циклов и хранили в субаликвотах при температуре -80°C для использования в циклах MIMICS-mPQA.

Результаты

Полученные данные количественного определения Pro A также сравнивали с двумя количественными измерениями титра в автономном режиме: титр в соответствии с измерением посредством Octet с использованием наконечников биосенсора Pro A и титр в соответствии с измерением на биоанализаторе CEDEX™. Фигуры 10-12 демонстрируют сопоставимость титра MIMICS-mPQA по сравнению с автономными способами для биореакторов объемом 100 л и 3 л.

В целом, тенденции были одинаковыми между 3 способами. При сравнении данных MIMICS-mPQA со способом биоанализатора CEDEX™ разница в % составила менее 10% для всего цикла, что является приемлемым CV для аналитического способа. Использование биоанализатора CEDEX™ обычно представляет собой способ, применяемый для измерения титра для ежедневного мониторинга технологического процесса. Сопоставимость MIMICS-mPQA с этой методикой предусматривала ортогональный инструмент для определения титра для культивирования млекопитающих. Дополнительным преимуществом MIMICS-mPQA было меньшее количество ручных манипуляций с образцом и уменьшение риска потенциальной погрешности хранения образца, когда тестирование проводится в автономном режиме.

Данные об агрегации, собранные в этом эксперименте, сравнивали с автономным циклом способа SEC для обычного мониторинга процесса. Данные для каждого биореактора представлены на фигурах 13-15.

В целом тенденции сопоставимы между автономным аналитическим способом и MIMICS-mPQA. Оба способа показали уровень агрегации менее 2,5% по всему циклу. Система MIMICS-mPQA позволила получить большее количество точек данных для этого цикла, чем обычно анализируется в автономной аналитике. Эта увеличенная выборка позволяет глубже изучить колебания агрегации в ходе цикла.

Данные о чистоте, полученные в результате анализа MIMICS-mPQA, также сравнивали с данными автономного способа чистоты для мониторинга процесса, как показано на фигуре 16. Автономный способ был основан на методологии CE-SDS, которая ортогональна измерению чистоты, выполненному с помощью MIMICS-mPQA.

Как показано на фигуре 16, система MIMICS-mPQA обеспечивает в целом более низкий абсолютный процент чистоты по сравнению с автономным способом. Несмотря на абсолютные различия в процентах, общая тенденция была одинаковой для обоих способов.

В целом, систему MIMICS-mPQA успешно применяли в режиме оперативного мониторинга в цикле 100-литрового биореактора полупромышленного масштаба с антителом к TGFβ. Система позволила увеличить выборку по сравнению с автономным анализом, что также позволило лучше понять процесс в ходе цикла. Кроме того, способы титрования и агрегации были в высокой степени сопоставимы с автономной аналитикой, обеспечивая достоверность анализов на производстве по сравнению с результатами, полученными в аналитической лаборатории. Система MIMICS-mPQA также позволила снизить потребление образцов и повысить пропускную способность, поскольку отпала необходимость в предварительной очистке белка А перед анализом, поскольку эта стадия встроена в общий рабочий процесс MIMICS-mPQA. Наконец, система смогла работать в течение 4 недель с минимальными инцидентами, что еще больше укрепило понимание надежности прибора и стабильности колонки.

Настоящее изобретение относится к системам и способам измерения атрибута качества продукта для образцов, включая образцы, собранные в системах непрерывного биопроизводства. Система для измерения атрибута качества продукта для аналита биологического образца содержит: первое устройство для регулирования потока; устройство для очистки образцов, сообщающееся по текучей среде с первым устройством для регулирования потока; второе устройство для регулирования потока, сообщающееся по текучей среде с первым устройством для регулирования потока, с устройством для очистки образцов и с первым и вторым анализаторами образцов, причем первый анализатор образцов содержит первую хроматографическую колонку; и блок управления, соединенный с первым и вторым устройствами для регулирования потока и выполненный так, что во время работы системы блок управления: (a) корректирует конфигурацию первого устройства для регулирования потока для направления первой части биологического образца из первого устройства для регулирования потока либо в устройство для очистки образцов, либо во второе устройство для регулирования потока, с тем чтобы эта часть биологического образца принималась во втором устройстве для регулирования потока; (b) корректирует конфигурацию второго устройства для регулирования потока для направления первой части биологического образца в один из первого и второго анализаторов образцов; (c) определяет первый атрибут качества продукта для аналита биологического образца на основе анализа первой части биологического образца одним из первого и второго анализаторов образцов; (d) корректирует конфигурацию первого устройства для регулирования потока для направления второй части биологического образца из первого устройства для регулирования потока либо в устройство для очистки образцов, либо во второе устройство для регулирования потока, с тем чтобы вторая часть биологического образца принималась во втором устройстве для регулирования потока; (e) корректирует конфигурацию второго устройства для регулирования потока для направления второй части биологического образца в один из первого и второго анализаторов образцов, который не принимал первую часть биологического образца; и (f) определяет второй атрибут качества продукта для аналита биологического образца на основе анализа второй части биологического образца одним из первого и второго анализаторов образцов, который принял вторую часть биологического образца, причем первый и второй атрибуты качества продукта являются разными, и причем каждый из первого и второго атрибутов качества продукта выбран из группы, состоящей из концентрации аналита в биологическом образце, меры агрегации аналита в биологическом образце, меры отличающихся зарядом вариантов или гетерогенности аналита в биологическом образце и меры чистоты или целостности аналита в биологическом образце. Техническим результатом является возможность контроля и корректировки широкого спектра условий биопроцесса. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 16 ил., 4 табл.

1. Система для измерения атрибута качества продукта для аналита биологического образца, содержащая:

первое устройство для регулирования потока;

устройство для очистки образцов, сообщающееся по текучей среде с первым устройством для регулирования потока;

второе устройство для регулирования потока, сообщающееся по текучей среде с первым устройством для регулирования потока, с устройством для очистки образцов и с первым и вторым анализаторами образцов, причем первый анализатор образцов содержит первую хроматографическую колонку; и

блок управления, соединенный с первым и вторым устройствами для регулирования потока и выполненный так, что во время работы системы блок управления:

(a) корректирует конфигурацию первого устройства для регулирования потока для направления первой части биологического образца из первого устройства для регулирования потока либо в устройство для очистки образцов, либо во второе устройство для регулирования потока, с тем чтобы эта часть биологического образца принималась во втором устройстве для регулирования потока;

(b) корректирует конфигурацию второго устройства для регулирования потока для направления первой части биологического образца в один из первого и второго анализаторов образцов;

(c) определяет первый атрибут качества продукта для аналита биологического образца на основе анализа первой части биологического образца одним из первого и второго анализаторов образцов;

(d) корректирует конфигурацию первого устройства для регулирования потока для направления второй части биологического образца из первого устройства для регулирования потока либо в устройство для очистки образцов, либо во второе устройство для регулирования потока, с тем чтобы вторая часть биологического образца принималась во втором устройстве для регулирования потока;

(e) корректирует конфигурацию второго устройства для регулирования потока для направления второй части биологического образца в один из первого и второго анализаторов образцов, который не принимал первую часть биологического образца; и

(f) определяет второй атрибут качества продукта для аналита биологического образца на основе анализа второй части биологического образца одним из первого и второго анализаторов образцов, который принял вторую часть биологического образца,

причем первый и второй атрибуты качества продукта являются разными, и причем каждый из первого и второго атрибутов качества продукта выбран из группы, состоящей из концентрации аналита в биологическом образце, меры агрегации аналита в биологическом образце, меры отличающихся зарядом вариантов или гетерогенности аналита в биологическом образце и меры чистоты или целостности аналита в биологическом образце.

2. Система по п. 1, причем первая хроматографическая колонка представляет собой колонку для катионообменной хроматографии, колонку для эксклюзионной хроматографии или колонку для обращенно-фазовой хроматографии.

3. Система по п. 1, причем устройство для очистки образцов содержит колонку для аффинной хроматографии.

4. Система по п. 1, причем второй анализатор образцов содержит детектор для количественного определения, выполненный с возможностью генерирования электрического сигнала, характеризующего количество аналита в биологическом образце.

5. Система по п. 4, причем первая хроматографическая колонка сообщается по текучей среде с детектором для количественного определения, и причем детектор для количественного определения выполнен с возможностью генерирования электрического сигнала, характеризующего количество аналита в потоке элюата из первой хроматографической колонки.

6. Система по п. 1, причем первый анализатор образцов содержит детектор для количественного определения, сообщающийся по текучей среде с первой хроматографической колонкой и выполненный с возможностью генерирования электрического сигнала, характеризующего количество аналита в потоке элюата из первой хроматографической колонки.

7. Система по п. 1, причем второй анализатор образцов содержит вторую хроматографическую колонку, и причем вторая хроматографическая колонка отличается от первой хроматографической колонки и представляет собой одну из колонки для катионообменной хроматографии, колонки для эксклюзионной хроматографии, колонки для обращенно-фазовой хроматографии и колонки для хроматографии гидрофильных взаимодействий.

8. Система по п. 7, причем второе устройство для регулирования потока сообщается по текучей среде с третьим анализатором образцов, содержащим третью хроматографическую колонку, и причем третья хроматографическая колонка отличается от первой и второй хроматографических колонок и представляет собой одну из колонки для катионообменной хроматографии, колонки для эксклюзионной хроматографии, колонки для обращенно-фазовой хроматографии и колонки для хроматографии гидрофильных взаимодействий.

9. Система по п. 1, причем второе устройство для регулирования потока сообщается по текучей среде с четырьмя дополнительными анализаторами образцов, при этом каждый из четырех дополнительных анализаторов образцов содержит хроматографическую колонку, отличную от первой хроматографической колонки и от хроматографических колонок остальных четырех дополнительных анализаторов образцов.

10. Система по п. 3, причем колонка для аффинной хроматографии представляет собой одну из колонки для хроматографии с белком A, колонки для хроматографии с белком G и колонки для связывания рецепторов.

11. Система по п. 7, дополнительно содержащая модуль управления колонками, сообщающийся по текучей среде с первым и вторым анализаторами образцов и со вторым устройством для регулирования потока и соединенный с блоком управления, причем блок управления выполнен с возможностью корректирования конфигурации модуля управления колонками для направления первой и второй частей биологического образца в один из первого и второго анализаторов образцов.

12. Система по п. 8, дополнительно содержащая модуль управления колонками, сообщающийся по текучей среде с первым, вторым и третьим анализаторами образцов и со вторым устройством для регулирования потока и соединенный с блоком управления, причем блок управления выполнен с возможностью корректирования конфигурации модуля управления колонками для направления первой и второй частей биологического образца в один из первого, второго, третьего и четвертого анализаторов образцов.

13. Система по п. 7, причем блок управления выполнен с возможностью повторения стадий (a)-(c) с другой частью биологического образца для определения двух различных атрибутов качества продукта для аналита биологического образца.

14. Система по п. 1, дополнительно содержащая устройство для отбора образцов, соединенное с блоком управления и выполненное с возможностью принятия биологического образца и доставки первой и второй частей биологического образца в первое устройство для регулирования потока.

15. Система по п. 7, дополнительно содержащая:

насос, сообщающийся по текучей среде со вторым устройством для регулирования потока, с первым и вторым анализаторами образцов и с первым и вторым резервуарами для буфера, связанными соответственно с первым и вторым анализаторами образцов,

причем блок управления и насос выполнены так, что во время работы системы насос доставляет буферный раствор в один из первого и второго анализаторов образцов из соответствующего связанного с ним резервуара для буфера, когда первая и вторая части биологического образца направляются в один из первого и второго анализаторов образцов.

16. Система для измерения атрибутов качества продукта для аналита биологического образца, содержащая:

первое устройство для регулирования потока;

устройство для очистки образцов, содержащее колонку для очистительной хроматографии, сообщающуюся по текучей среде с первым устройством для регулирования потока;

второе устройство для регулирования потока, сообщающееся по текучей среде с первым устройством для регулирования потока и с устройством для очистки образцов;

первый анализатор образцов, содержащий первую хроматографическую колонку, сообщающуюся по текучей среде со вторым устройством для регулирования потока;

второй анализатор образцов, содержащий вторую хроматографическую колонку, сообщающуюся по текучей среде со вторым устройством для регулирования потока;

третий анализатор образцов, содержащий третью хроматографическую колонку, сообщающуюся по текучей среде со вторым устройством для регулирования потока;

четвертый анализатор образцов, содержащий детектор для количественного определения; и

блок управления, соединенный с первым и вторым устройствами для регулирования потока и выполненный так, что во время работы системы блок управления:

(a) корректирует конфигурацию первого устройства для регулирования потока для направления первой части биологического образца из первого устройства для регулирования потока либо в устройство для очистки образцов, либо во второе устройство для регулирования потока, с тем чтобы эта часть биологического образца принималась во втором устройстве для регулирования потока;

(b) корректирует конфигурацию второго устройства для регулирования потока для направления первой части биологического образца в один из первого, второго, третьего и четвертого анализаторов образцов;

(c) определяет первый атрибут качества продукта для аналита биологического образца на основе анализа первой части биологического образца одним из первого, второго, третьего и четвертого анализаторов образцов; и

(d) повторяет стадии (а)-(с) с тремя дополнительными частями биологического образца с корректировкой конфигурации второго устройства для регулирования потока так, чтобы каждая часть биологического образца направлялась в другой из анализаторов образцов, с определением в общей сложности четырех атрибутов качества продукта для аналита биологического образца.

17. Способ измерения атрибутов качества продукта для аналита биологического образца, включающий:

получение биологического образца путем извлечения биологического образца из работающего биореактора или из устройства для очистки, сообщающегося по текучей среде с работающим биореактором;

направление первой части биологического образца в первый анализатор образцов и получение информации о первом атрибуте качества продукта для аналита биологического образца путем анализа первой части биологического образца в первом анализаторе образцов;

направление второй части биологического образца во второй анализатор образцов и получение информации о втором атрибуте качества продукта для аналита биологического образца путем анализа второй части биологического образца во втором анализаторе образцов;

причем первый и второй атрибуты качества продукта различны; и

причем по меньшей мере один из первого и второго атрибутов качества продукта включает меру отличающихся зарядом вариантов или гетерогенности аналита в биологическом образце, меру агрегации аналита в биологическом образце, меру чистоты или целостности аналита в биологическом образце и концентрацию аналита в биологическом образце.