СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ У ПОДРОСТКОВ С ЛАТЕНТНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области медицины, а именно, к фтизиатрии и может быть использовано для обнаружения признаков активной туберкулезной инфекции при обследовании детей и подростков, у которых идентифицирована латентная туберкулезная инфекция.

Проблема определения признаков активности туберкулезной инфекции является чрезвычайно актуальной, поскольку в современном мире число лиц с латентной туберкулезной инфекцией составляет, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), не менее четверти населения Земли: 1,7 млрд человек. Для предупреждения реактивации латентной туберкулезной инфекции у детей и подростков, у которых в большом числе случаев при реактивации не выделяется мокрота с выделением микобактерий туберкулеза в России, как и в большинстве стран мира для, рекомендуется проводить контрольные исследования с помощью компьютерной томографии органов грудной клетки и специфическое химиопрофилактическое лечение двумя противотуберкулезными препаратами, традиционно – рифампицин и изониазид (2-3 месяца), либо изониазид при более длительном применении. Разумеется, что эти мероприятия обоснованы, однако, оба указанных препарата обладают гепато- и нефротоксичностью. В связи с этим международные исследования с анализом нескольких десятков генов посвящаются поиску новых методов определения незначительно выраженных, начинающихся признаков активной туберкулезной инфекции с целью назначения противотуберкулезных препаратов при латентной инфекции по более обоснованным критериям. В то же время, разработка методов иммунологической диагностики и скрининга активной туберкулезной инфекции является весьма актуальной задачей фтизиатрии. При этом актуальной задачей является разработка способа определения группы высокого риска развития активной туберкулезной инфекции у детей и подростков с минимальными изменениями, выявляемыми при компьютерной томографии органов грудной клетки, которые пока не рассматриваются в качестве патологических.

Известен способ дифференцирования активной и латентной туберкулезной инфекции на основе анализа экспрессии гена PDCD1, кодирующего рецептор Т-лимфоцитов PD1, в которой описана возможность дифференцирования активной и латентной туберкулезной инфекции с точностью 93,3% (Ёлов А.А, Владимирский М.А., Смердин С.В., Елуфимова Е.И. «Экспрессия генов в клетках периферической крови для дифференцирования активной и латентной туберкулёзной инфекции у детей и подростков». Туберкулез и болезни легких 2019, Т.97 – №12. С. 28-33). В этой работе проводилось сравнение экспрессии генов у пациентов с выраженным активным туберкулезом легких и пациентов с латентной туберкулезной инфекцией, у которых не было обнаружено рентгенологических признаков активного туберкулеза легких. На небольшом материале было показано, что анализ экспрессии гена PDCD1 с высокой точностью позволил дифференцировать больных активным туберкулезом и пациентов с латентной формой этой инфекции. Однако, это исследование было проведено на очень малой выборке лиц детско-подросткового возраста с латентной туберкулезной инфекцией, что не позволяет считать этот эффект достижимым на при обследовании большого числа пациентов.

Известна также возможность определения активности туберкулезной инфекции у детей и подростков с помощью определения концентрации неоптерина (RU2726789, 15.07.2020). При использовании этого способа с помощью исследования неоптерина его концентрация в образцах плазмы крови на уровне 9 нМ/мл и более характерна для пациентов с активной туберкулезной инфекцией. Однако, повышение неоптерина само по себе не является специфичным маркером активности туберкулезной инфекции, но является лишь маркером активности воспаления и может использоваться при наличии других специфических признаков туберкулезной инфекции, например, рентгенологических признаков туберкулеза легких в отсутствие выделения микобактерий туберкулеза с мокротой. Для диагностики активной туберкулезной инфекции и ее реактивации при латентной туберкулезной инфекции необходимо определять ранние и более специфичные признаки ее реактивации, в том числе при неопределенных результатах компьютерной томографии органов грудной клетки. Решению этой задачи посвящены усилия большого числа, в том числе международных исследований.

Известен также способ выявления предрасположенности к активации туберкулезной инфекции на основе анализа экспрессии десятков различных генов в клетках крови пациентов с предположительно латентной инфекцией (Tabone L., Verma R., Singhania A. et al. Blood transcriptomics reveal the evolution and resolution of the immune response in tuberculosis. Journal Experimental of Medicine, 2021, vol.218, N 10, e 20210915). В этой работе анализируется экспрессия 30 генов. Положительные результаты при анализе транскрипции большого числа генов рассматриваются в качестве вероятного прогноза развития активной туберкулезной инфекции в течение 20-40 дней, что увеличивает сроки получения результата и отсутствует их оценка в динамике. Информация о большом количестве генов не позволяет оценить истинную предрасположенность из-за эпигенетической регуляции, возникающей на разных этапах жизни человека. Кроме того, на реализацию генетической предрасположенности к инфекции могут оказывает влияние другие факторы, например, цитокины (интерферон). Однако, в этой работе отсутствуют определенные данные о транскрипции генов, которые бы с высокой достоверностью свидетельствовали о наличии активной туберкулезной инфекции в конкретный момент исследования.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка способа, позволяющего определить активность туберкулезной инфекции у пациентов детско-подросткового возраста с латентной туберкулезной инфекцией в течение 2 суток, что позволяет своевременно начать терапию и предотвратить активацию туберкулезной инфекции.

Технический результат достигается способом определения активности туберкулезной инфекции у пациентов детско-подросткового возраста с латентной туберкулезной инфекцией, заключающийся в количественном определении интерферона гамма и измерении уровня экспрессии по меньшей мере двух мРНК - PDL2 и BATF2 в образце гепаринизированной крови после 24-часовой инкубации в присутствии специфического в отношении микобактерий туберкулеза рекомбинантного белка ESAT-6-CFP-10, высокоочищенного от липополисахаридов (ЛПС), при определении концентрации интерферона гамма более 14 пг/мл и выявлении экспрессии по меньшей мере двух мРНК генов PDL2 и BATF2 делают вывод о наличии активной туберкулезной инфекции у пациентов детско-подросткового возраста. При этом при выявлении экспрессии только одного мРНК гена проводят определение концентрации интерлейкина 6 (ИЛ-6) и при получении значения более 8 пг/мл делают вывод о наличии активной туберкулезной инфекции. Дополнительно проводят измерение уровня экспрессии мРНК генов PDL1 и GBP5.

Применение комбинации иммунологических и молекулярно-биологического методов при определении следующих признаков: 1) уровень антиген-специфической (с использованием специфического в отношении микобактерий туберкулеза рекомбинантного белка ESAT-6-CFP-10) индукции интерферона гамма (IFN-g) не менее 14 pg/ml; 2) положительных результатах мРНК экспрессии двух генов: PDL2 и BATF2; 3) при необходимости содержание в сыворотке крови пациентов интерлейкина 6 (ИЛ-6) в концентрации более 8 пг/мл, позволяет получить результаты исследований на ранних этапах развития инфекции.

Осуществление изобретения

Заявляемый способ включает анализ антиген-специфической индукции, с использованием специфического рекомбинантного белка ESAT-6-CFP-10, индукции интерферона гамма (не менее 14 пг/мл); оценка мРНК экспрессии по меньшей мере 2-х генов (PDL2 и BATF2). В случае повышения уровня экспрессии 1 гена, то пациенту проводится дополнительное определение концентрации интерлейкина 6 (ИЛ-6). При уровне более 8 пг/мл расценивают туберкулезную инфекцию как активную.

Указанные данные свидетельствуют, что применение комбинации указанных иммунобиологических методов при обнаружении приведенных результатов позволяет определить начальные субклинические признаки активной туберкулезной инфекции у детей и подростков (лица до 18 лет включительно (ст. 54 СК РФ)). При этом к числу начальных рентгенологических признаков активности туберкулезной инфекции относится общепризнанное выявление кальцинатов внутригрудных лимфоузлов или мелких внутрилегочных лимфоузлов. При этом выявление мелких мягкотканных внутрилегочных лимфоузлов в качестве признака активности туберкулезной инфекции признается пока не всеми специалистами в области рентгенодиагностики туберкулеза.

Реализация способа проводится при анализе образцов гепаринизированной крови после 24-часовой инкубации в присутствии специфического в отношении микобактерий туберкулеза рекомбинантного белка ESAT-6-CFP-10, высокоочищенного от липополисахаридов (ЛПС), с последующим количественным определением продуцируемого лимфоцитами интерферона гамма с помощью иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов «Тубинферон» (ООО «Мон-А», Россия) или “Human interferon gamma” ThermoFisher определением положительных результатов мРНК экспрессии по меньшей мере двух генов PDL2 и BATF2. При определении экспрессии только одного из двух генов, проводят определение интерлейкина 6 (ИЛ-6) в образцах сыворотки крови на уровне более 8 пг/мл. При этом положительным результатом считают концентрацию интерферона гамма не менее 14 пг/мл, а ИЛ-6 – более 8 пг/мл. Для исследования экспрессии двух генов (PDL2 и BATF2) проводится также анализ так называемого гена домашнего хозяйства GAPDH. Используют 100 мкл крови с гепарином, которые смешивают с 700 мкл тризола. Такая смесь может длительно сохраняться для последующего анализа. При добавлении 160 мкл хлороформа образуемая водная фаза, из которой выделяют РНК с помощью магнитного сорбента. Полученные образцы РНК анализируют с помощью набора для обратно-транскрипионной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) реагентов с соответствующими праймерами для анализа выбранных генов и гена домашнего хозяйства GAPDH, из пороговых циклов которого вычитаются пороговые циклы мРНК исследуемого гена. При проведении ОТ-ПЦР используются реагенты производства ООО «Синтол», Россия. При этом положительным результатом считают положительные результаты мРНК экспрессии 2-х представленных выше генов.

В рамках исследований были изучены образцы крови с гепарином 8 (восемь) пациентов детско-подросткового возраста, проходивших лечение в детском стационарном отделении туберкулеза легких и 91 пациента с латентной туберкулезной инфекцией, наблюдаемых в Московском областном противотуберкулезном диспансере. В образцах крови с гепарином исследовали уровень антиген-индуцированного интерферона гамма с использованием российской тест-системы «Тубинферон». В 95% случаев у обследованных пациентов были отмечены положительные результаты специфической индукции интерферона гамма: более 14 пг/мл. Средний уровень антиген-специфической индукции интерферона-гамма в группе пациентов с активной туберкулезной инфекцией составил 256 ± 67,7 пг/мл, а в группе с латентной туберкулезной инфекций 251 ± 26,8 пг/мл. В образцах крови всех пациентов в обеих групп была также изучена экспрессия 2-х мРНК генов PDL2, BATF2. Уровень совпадения положительных результатов индукции интерферона гамма и мРНК экспрессии 2-х генов составил 95%. Кроме того, у всех пациентов было проведено исследование образцов сыворотки крови для определения интерлейкина-6 (Ил-6) с помощью иммуноферментной тест-системы ИЛ-6 (Interleukin -6). При сопоставлении результатов иммунологических и молекулярно-генетических методов с описанием результатов компьютерной томографии (КТ) органов грудной клетки петрификаты и мелкие мягко-тканные лимфоцитарные очаги отмечались только у лиц с положительными иммунологическими (индукция ИФН-γ) и молекулярно – генетическими (экспрессия генов PD-L2 и BATF2) тестами.

Дополнительно в образцах крови пациентов может быть определена экспрессия еще 2-х мРНК генов PDL1 и GBP5. Определение экспрессии 4-х мРНК генов повышает достоверность получаемых результатов при определении активности туберкулезной инфекции.

В качестве примеров можно привести следующих пациентов.

Пример 1. Пациентка Б., 12 лет, наблюдается в амбулаторном отделении Московского областного противотуберкулезного диспансера по поводу латентной туберкулезной инфекции. По результатам анализа гепаринизированной крови через 48 часов после забора крови и антиген-специфической индукции клеток крови специфическим белком ESAT-6-CFP-10, уровень интерферона гамма: 149 пг/мл, что выше референсных значений; экспрессия мРНК генов составила PDL2 – 1,29, BATF2 – 1,86. То есть, все показатели отмечались выше референсных значений и свидетельствовали об активности туберкулезной инфекции.

По данным компьютерной томографии (КТ) органов грудной клетки: в легких полисегментарно отмечены мелкие мягко-тканные очаги.

Пациентке были назначены противотуберкулезные препараты на 2 мес. С контролем лучевых методов исследования.

Пример 2. Подросток К, 10 лет. По результатам анализа гепаринизированной крови через 42 часов после забора крови уровень антиген-индуцированного интерферона-гамма -266 пг/мл экспрессия мРНК генов: PDL2 – (-1,03); BATF2-2,38. Учитывая отсутствие экспрессии гена PDL2 мы определили уровень ИЛ-6 в сыворотке крови, который имел значение 200 пг/мл, что существенно выше референсных значений. Результаты иммунобиологических тестов коррелируют с очевидными признаками туберкулеза легких.

По КТ выявлены очаги в паренхиме легких.

Назначен 2-х месячный курс химитерапии противотуберкулезными препаратами.

Пример 3. Пациентка Л., 15 лет. По результатам анализа гепаринизированной крови через 46 часов после забора крови антиген-индуцированный интерферон-гамма 254 пг/мл; экспрессия мРНК генов: PDL2 - 0,79, BATF2 – 0,73.

По КТ выявлены мелкие кальцинаты внутригрудных лимфоузлов, что может свидетельствовать об активности туберкулезной инфекции. Пациентке проведен курс профилактического лечения 3 мес. При контрольном исследовании по КТ органов грудной клетки динамика отсутствовала, что свидетельствовало о своевременном проведении профилактического лечения.

Пример 4. Пациент Д., 12 лет. По результатам анализа гепаринизированной крови через 48 часов после забора крови антиген-индуцированный интерферон гамма – 344 пг/мл; мРНК экспрессия генов: PDL2 – (-1,19); BATF2 – (-2,71)

На КТ органов грудной клетки: единичные внутрилегочные лимфоузлы в 3-х сегментах правого легкого и в 2-х сегментах левого легкого, а также поствоспалительные изменения в верхушках легких. При дополнительном обследовании выявлено, что пациент перенес накануне пневмонию. В динамике через 3 недели поствоспалительных изменений не зафиксировано.

Пример 5. Подросток Б., 10 лет. Наблюдается в амбулаторном отделении Московского областного противотуберкулезного диспансера по поводу латентной туберкулезной инфекции. По результатам анализа гепаринизированной крови через 44 часов после забора крови уровень антиген-индуцированного интерферона-гамма - 266 пг/мл, экспрессия мРНК генов: PD1 - 2,18, PDL2 – 1,03; BATF2 - 2,38; GBP5 – 2,16.

На КТ органов грудной клетки: очагово-инфильтративные тени в обоих легких. Назначен 4-х месячный курс химитерапии двумя препаратами: изониазид и рифампицин.

Пример 6. Пациент Н., 13 лет. По результатам анализа гепаринизированной крови через 48 часов после забора крови антиген-индуцированный интерферон-гамма 254 пг/мл; экспрессия мРНК генов: PDCD1 - 0,23, PDL2 - 0,79, BATF2 – 0,73, GBP5 – 2,06. Был сделан вывод об активности туберкулезной инфекции. На КТ органов грудной клетки: мелкие кальцинаты во внутригрудных лимфоузлах.

Таким образом, способ определения активности туберкулезной инфекции у детей и подростков с латентной туберкулезной инфекции осуществляется путем определения антиген-специфической индукции интерферона гамма в концентрации более 14 пг/мл, положительных результатах определения мРНК экспрессии 2-х генов: PDL2, BATF2. Указанные результаты иммунобиологического исследования не менее чем в 90% случаев сопровождаются воспалительными изменениями в легких пациентов характерными для активной туберкулезной инфекции, которые выявляются при компьютерной томографии органов грудной клетки.

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для определения активности туберкулезной инфекции у пациентов детского возраста с латентной туберкулезной инфекцией. В образце гепаринизированной крови после 24-часовой инкубации в присутствии специфического рекомбинантного белка ESAT-6-CFP-10 проводят количественное определение интерферона гамма, измерение уровня экспрессии мРНК генов PDL2 и BATF2, а также определение в сыворотке крови концентрации интерлейкина 6 (ИЛ-6). При определении концентрации интерферона гамма от 14 пг/мл и более, положительного уровня экспрессии мРНК PDL2 и BATF2 и ИЛ-6 более 8 пг/мл делают вывод о наличии активной туберкулезной инфекции. Способ позволяет определить активность туберкулезной инфекции у пациентов детского возраста с латентной туберкулезной инфекцией в течение 2 суток за счет определения маркеров в образце гепаринизированной крови после 24-часовой инкубации в присутствии специфического в отношении микобактерий туберкулеза рекомбинантного белка ESAT-6-CFP-10. 6 пр.

Способ определения активности туберкулезной инфекции у пациентов детского возраста с латентной туберкулезной инфекцией, характеризующийся тем, что в образце гепаринизированной крови после 24-часовой инкубации в присутствии специфического в отношении микобактерий туберкулеза рекомбинантного белка ESAT-6-CFP-10, высокоочищенного от липополисахаридов (ЛПС), проводят количественное определение интерферона гамма, измерение уровня экспрессии мРНК двух генов - PDL2 и BATF2, а также определение в сыворотке крови концентрации интерлейкина 6 (ИЛ-6) и при определении концентрации интерферона гамма в концентрации от 14 пг/мл и более, выявлении положительного уровня экспрессии мРНК двух генов - PDL2 и BATF2, а также ИЛ-6 в сыворотке крови более 8 пг/мл делают вывод о наличии активной туберкулезной инфекции у пациентов детского возраста.