Способ диагностики бронхиальной астмы у пациента с помощью определения концентрации аргиназы-1 в плазме крови Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 A61B5/107 G01N33/573 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической медицине (пульмонология), и может быть использовано при диагностике бронхиальной астмы (БА).

БА является глобальной проблемой здравоохранения, занимая одно из первых мест в мире по распространенности среди заболеваний органов дыхания. Согласно глобальной инициативе по диагностике и лечению бронхиальной астмы (GINA), бронхиальная астма характеризуется высокой гетерогенностью и существованием множества фенотипов и эндотипов, что затрудняет постановку диагноза традиционными клиническими методами и делает важным поиск биомаркеров, которые могут быть использованы для диагностики БА. При этом важность ранней диагностики бронхиальной астмы сложно переоценить, потому что своевременная постановка диагноза позволяет вовремя начать лечение БА и тем самым предотвратить серьёзные осложнения БА.

Известно, что при бронхиальной астме отмечается изменение ряда биохимических показателей крови, одним из которых является фермент аргиназа, под действием которого L-аргинин превращается в L-орнитин и мочевину. У людей были идентифицированы два изофермента аргиназы, аргиназа-1 и аргиназа-2, которые отличаются по клеточному расположению и распределению в тканях (Wu G, Morris SM, 1998). Оба фермента аргиназы экспрессируются в дыхательных путях и могут быть обнаружены в эндотелиальных и эпителиальных клетках, фибробластах, макрофагах, в клетках гладких мышц дыхательных путей (Bergeron C, Boulet L, 2007). Проведенные ранее исследования показывают участие аргиназы в патогенезе бронхиальной астмы и других бронхообструктивных заболеваний. Показано, что повышенная активность аргиназы в дыхательных путях способствует обструкции дыхательных путей и гиперреактивности, уменьшая доступный субстрат для образования оксида азота (H.Maarsingh, J.Zaagsma, 2009). В результате снижается выработка оксида азота, участвующего в механизмах расширения дыхательных путей, и, кроме того, образуются супероксиды, которые реагируют с оксидом азота с образованием пероксинитрита, тем самым усиливая сократимость дыхательных путей и активность воспаления в дыхательных путях. Кроме того, повышенная активность аргиназы дыхательных путей приводит к увеличению продукции L-орнитина, что потенциально способствует ремоделированию дыхательных путей из-за стимуляции пролиферации клеток и образования коллагена (H. Maarsingh, J.Zaagsma, 2009). Однако в отечественной и зарубежной литературе отсутствуют результаты определения аргиназы, позволяющие определить диагностически значимый уровень для диагностики бронхиальной астмы.

Наиболее близким по назначению способом к заявленному изобретению по совокупности признаков является применение метода, описанного в патенте JP 2007537984 A Compositions and methods for diagnosis and treatment of asthma or other allergic or inflammatory diseases (Композиции и методы диагностики и лечения астмы и других аллергических и воспалительных заболеваний, Япония), в котором предлагается использовать в диагностике бронхиальной астмы активность экспрессии генов, кодирующих синтез аргиназы-1, и оценке уровня мРНК аргиназы-1. Однако этот способ требует применение труднодоступного метода оценки экспрессии генов, что ограничивает возможности его практической реализации, в то время, как в предлагаемом способе производится расчёт согласно разработанной формуле вероятности наличия бронхиальной астмы у пациента в зависимости от концентрации аргиназы-1 в плазме крови методом иммуноферментного анализа и индекса массы тела пациента, что является более доступным методом диагностики.

Также известен способ диагностики бронхиальной астмы, описанный в патенте RU 2391663 C1 Способ дифференциальной диагностики бронхиальной астмы, в котором предложено для целей диагностики определять уровень транскрипционного фактора рSТАТ6 в условиях активации IL-4 лимфоцитов периферической венозной крови методом иммунноблоттинга и зависимости от полученных результатов диагностировать аллергическую или неаллергическую бронхиальную астму. Недостатком предложенного способа является невозможность на основании определяемого уровня транскрипционного фактора рSТАТ6 определить наличие бронхиальной астмы в сравнении со здоровым человеком.

Нами предложен способ дополнительной диагностики бронхиальной астмы с помощью определения концентрации аргиназы-1 в плазме крови и дальнейшего расчёта вероятности согласно разработанной формуле. Основным отличием предложенного способа от прототипа, описанного в патенте JP 2007537984 A Compositions and methods for diagnosis and treatment of asthma or other allergic or inflammatory diseases (Композиции и методы диагностики и лечения астмы и других аллергических и воспалительных заболеваний, Япония), является определение концентрации аргиназы-1 в плазме крови методом иммуноферментного анализа с дальнейшим расчётом вероятности наличия бронхиальной астмы по предложенной формуле, что является более простым и доступным методом по сравнению с определением мРНК аргиназы.

Техническим результатом нашего изобретения является разработка доступного и эффективного способа дополнительной диагностики бронхиальной астмы.

Описание способа

Практическое обоснование метода основано на проведённом исследовании. В исследовании использовалась плазма крови пациентов с бронхиальной астмой. В качестве контроля использовалась плазма здоровых добровольцев. В исследование были включены 65 человек, среди которых 35 пациентов с бронхиальной астмой (средний возраст 54 [41; 61] год) и 30 здоровых добровольцев (средний возраст 47 [40; 55] лет). Группы не отличались по возрасту (p=0,194) и полу (p=0,586).

Согласно протоколу исследования, после подписания информированного согласия перед забором крови у пациентов проводилась оценка факторов, способных оказывать независимое влияние на уровень аргиназы-1 в крови, а именно проводилась оценка наличия следующих факторов невключения в исследование:

• декомпенсированная патология сердечно-сосудистой системы;

• тяжёлое нарушение функции печени в анамнезе, сопровождающихся повышением АЛТ, АСТ, общего билирубина, или щелочной фосфатазы более чем в 3 раза выше верхней границы нормы;

• тяжёлое нарушение функции почек в анамнезе, сопровождающихся снижением скорости клубочковой фильтрации ниже 60 мл/мин (рассчитанной по формуле CKD-EPI);

• злоупотребление и/или зависимость от психоактивных веществ и/или алкоголя.

У пациентов осуществлялся забор крови из локтевой вены в вакуумные пробирки, содержащие антикоагулянт ЭДТА-К3. Полученная кровь центрифугировалась в охлаждаемой центрифуге EPPENDORF Centrifuge 5702 R. Для центрифугирования применялись следующие настройки центрифугирования – ускорение 1000 g, температура 6°C, длительность центрифугирования 20 минут. Далее с полученной сывороткой проводили иммуноферментный анализ с применением коммерчески доступного лабораторного набора SEB120Hu (ELISA Kit for Arginase (ARG), производство Cloud-Clone Corp., Китай), согласно официальной инструкции к лабораторным наборам.

Полученные результаты обрабатывали с помощью компьютерной программы jamovi 2.3.28.0. Описательная статистика показателей представлена в виде медианы, верхнего и нижнего квартиля (Me; Q25; Q75). Для оценки статистически значимых различий использовали попарные сравнения с помощью рангового критерия Манна-Уитни (U-тест). Критический уровень статистической значимости различий нулевой гипотезы (р) принимали равным 0,05. Для оценки связи количественных переменных между собой применялся коэффициент ранговой корреляции Спирмана и метод линейной регрессии. Для оценки вероятности бинарного исхода применялся метод бинарной логистической регрессии. Для изучения чувствительности, специфичности и точности/диагностической значимости показателей использовались кривые операциональных характеристик (ROC-анализ).

В результате исследования доказано, что уровень аргиназы у здоровых добровольцев составляет 0,85 нг/мл (0,6; 1,86), а у больных бронхиальной астмой составляет 25,8 нг/мл (10,8; 36,5), что значительно выше, чем у здоровых добровольцев (p < 0,001). Установлено, что уровень аргиназы имеет зависимость от уровня индекса массы тела пациентов (ИМТ) определяемого по формуле:

ИМТ = (масса тела пациента, кг) / (рост пациента, м) ² (1)

Коэффициент корреляции R по Спирману – 0,403, p<0,001.

Для определения влияния ИМТ, используя метод линейной регрессии, нами получено уравнение регрессии для связи аргиназы и ИМТ пациента:

Аргиназа, нг/мл = 0,747 ИМТ, кг/м² – 7,171 (2)

Для оценки наличия бронхиальной астмы у пациента применялся метод бинарной логистической регрессии на основании разницы расчётного ожидаемого уровня аргиназы по ИМТ и полученных результатов определения уровня аргиназы в крови пациента по формуле (2).

R-квадрат МакФаддена составил 0,521 (R²=0,521).

Значимость модели составила 0,001 (p<0,001).

Полученное уравнение регрессии:

Z = 0,485 * (0,747 * X - 7,171 - Y) - 4,029 (3)

где X – ИМТ, кг/м²;

Y – Аргиназа, нг/мл.

Расчёт вероятности наличия бронхиальной астмы у пациента:

P = (1 - (1 / (1 + e^-Z))) * 100% (4)

где P – вероятность наличия бронхиальной астмы у пациента;

e – основание натурального логарифма (число Эйлера);

Z – значение, полученное в уравнении регрессии.

Клинический пример № 1

Пациентка N.: определённый в крови уровень аргиназы составил 0,7 нг/мл, индекс массы тела – 34,6 кг/м². Подставим значение в уравнение регрессии: Z = 0,485 * (0,747 * 34,6 - 7,171 - 0,7) - 4,029 = 4,69 Тогда вероятность наличия бронхиальной астмы составляет P = (1 - (1 / (1 + e^-4,69))) * 100% = 1%. В анамнезе у пациентки бронхиальная астма отсутствует.

Клинический пример № 2

Пациентка M.: определённый в крови уровень аргиназы составил 29,7 нг/мл, индекс массы тела – 34,7 кг/м². Подставим значение в уравнение регрессии: Z = 0,485 * (0,747 * 34,7 - 7,171 - 29,7) - 4,029 = -9,34 Тогда вероятность наличия бронхиальной астмы составляет P = (1 - (1 / (1 + e^9,34))) * 100% = 99%. В анамнезе у пациентки есть бронхиальная астма.

Клинический пример № 3

Пациентка K.: определённый в крови уровень аргиназы составил 11,6 нг/мл, индекс массы тела – 31,0 кг/м². Подставим значение в уравнение регрессии: Z = 0,485 * (0,747 * 31,0 - 7,171 - 11,6) - 4,029 = -1,90 Тогда вероятность наличия бронхиальной астмы составляет P = (1 - (1 / (1 + e^1,90))) * 100% = 87%. В анамнезе у пациентки есть бронхиальная астма.

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для диагностики бронхиальной астмы у пациента с помощью определения концентрации аргиназы-1 в плазме крови. Осуществляют измерение концентрации аргиназы-1 в плазме крови методом иммуноферментного анализа и индекса массы тела пациента. Проводят расчет вероятности наличия бронхиальной астмы у пациента по формуле: P = (1 - (1 / (1 + e^-Z))) * 100%, где P – вероятность наличия бронхиальной астмы у пациента, е – основание натурального логарифма – число Эйлера, а Z – показатель, рассчитываемый следующим образом: Z = 0,485 * (0,747 * X - 7,171 - Y) - 4,029, где X – индекс массы тела, кг/м², а Y – аргиназа, нг/мл. При Р более 50 % диагностируют бронхиальную астму у пациента. Способ обеспечивает возможность доступной и эффективной диагностики бронхиальной астмы за счет определения концентрации аргиназы-1 в крови и индекса массы тела пациента. 3 пр.

Способ диагностики бронхиальной астмы у пациента с помощью определения концентрации аргиназы-1 в плазме крови, включающий измерение концентрации аргиназы-1 в плазме крови методом иммуноферментного анализа и индекса массы тела пациента, характеризующийся тем, что проводят расчет вероятности наличия бронхиальной астмы у пациента по формуле:

P = (1 - (1 / (1 + e^-Z))) * 100%,

где P – вероятность наличия бронхиальной астмы у пациента, е – основание натурального логарифма – число Эйлера, а Z – показатель, рассчитываемый следующим образом:

Z = 0,485 * (0,747 * X - 7,171 - Y) - 4,029,

где X – индекс массы тела, кг/м², а Y – аргиназа, нг/мл;

и при Р более 50 % диагностируют бронхиальную астму у пациента.