Способ диагностики бронхиальной астмы у пациента с помощью определения концентрации асимметричного диметиларгинина в плазме крови Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 A61B5/107 G01N33/573 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической медицине (пульмонология), и может быть использовано при диагностике бронхиальной астмы (БА).

БА является глобальной проблемой здравоохранения, занимая одно из первых мест в мире по распространенности среди заболеваний органов дыхания. Согласно глобальной инициативе по диагностике и лечению бронхиальной астмы (GINA), бронхиальная астма характеризуется высокой гетерогенностью и существованием множества фенотипов и эндотипов, что затрудняет постановку диагноза традиционными клиническими методами и делает важным поиск биомаркеров, которые могут быть использованы для диагностики БА. При этом важность ранней диагностики бронхиальной астмы сложно переоценить, потому что своевременная постановка диагноза позволяет вовремя начать лечение БА и тем самым предотвратить серьёзные осложнения БА.

Известно, что при бронхиальной астме отмечается изменение ряда биохимических показателей крови, одним из которых является асимметричный диметиларгинин (АДМА), который влияет на метаболизм L-аргинина ингибируя синтазу оксида азота и снижая тем самым его выработку. АДМА в сыворотке, а также концентрации L-аргинина увеличиваются при бронхообструктивных заболеваниях и дополнительно повышаются при развитии обострения (Ruzsics I, Nagy L, 2016). Важно отметить, что концентрация АДМА в сыворотке крови, возможно, является независимым фактором риска долгосрочной смертности от всех причин при бронхообструктивных заболеваниях (Vogeli A, Ottiger M, 2017) и связана с повышением сопротивления дыхательных путей (Tajti G, Geszteli R, 2017). В последние годы было проведено несколько исследований, изучающих связь АДМА с бронхообструктивными заболеваниями (Calabrese et al., 2015). Показана связь АДМА с развитием бронхиальной астмы (Scott et al., 2011), сопротивлением дыхательных путей (Scott, Grasemann, 2013) и показателями функции внешнего дыхания у больных бронхообструктивными заболеваниями лёгких (Winnica et al., 2017). Однако в отечественной и зарубежной литературе отсутствуют результаты определения асимметричного диметиларгинина, позволяющие определить его диагностически значимый уровень для диагностики бронхиальной астмы.

Наиболее близким по назначению способом к заявленному изобретению по совокупности признаков является применение методов, описанных в патенте JP2007537984A Compositions and methods for diagnosis and treatment of asthma or other allergic or inflammatory diseases (Композиции и методы диагностики и лечения астмы и других аллергических и воспалительных заболеваний, Япония), в котором предлагается использовать в диагностике бронхиальной астмы активности экспрессии генов, кодирующих синтез аргиназы-1, и оценке уровня мРНК аргиназы-1. Однако этот способ требует применение труднодоступного метода оценки экспрессии генов, что ограничивает возможности его практической реализации в то время, как в предлагаемом способе производится расчёт согласно разработанной формуле вероятности наличия бронхиальной астмы у пациента в зависимости от концентрации аргиназы-1 в плазме крови методом иммуноферментного анализа и индекса массы тела пациента, что является более доступным методом диагностики.

Также известен способ диагностики бронхиальной астмы US11412953B2 Diagnosis of asthma versus chronic obstructive pulmonary disease (COPD) using urine metabolomic analysis (Диагностика астмы против хронической обструктивной болезни лёгких (ХОБЛ), используя метаболомный анализ мочи), в котором для диагностики бронхиальной астмы, в отличие от ХОБЛ, предлагается определение ряда биомаркеров в моче пациентов, включая определение L-аргинина. Недостатком предложенного способа является невозможность диагностики бронхиальной астмы в сравнении со здоровым человеком.

Нами предложен способ дополнительной диагностики бронхиальной астмы с помощью определения концентрации асимметричного диметиларгинина в плазме крови плазме крови и дальнейшего расчёта диагностического коэффициента по предложенной формуле в зависимости от индекса массы тела (ИМТ) пациента. Основным отличием предложенного способа от прототипа, описанного в патенте JP2007537984A Compositions and methods for diagnosis and treatment of asthma or other allergic or inflammatory diseases (Композиции и методы диагностики и лечения астмы и других аллергических и воспалительных заболеваний, Япония), является определение концентрации асимметричного диметиларгинина в плазме крови методом иммуноферментного анализа с дальнейшим расчётом диагностического коэффициента согласно разработанной формуле в зависимости от индекса массы тела (ИМТ) пациента, что является более простым и доступным методом по сравнению с определением мРНК аргиназы или метаболомного исследования мочи.

Техническим результатом нашего изобретения является разработка доступного и эффективного способа дополнительной диагностики бронхиальной астмы.

Описание чертежей

Фиг. 1 - ROC кривая, характеризующая прогностическую модель при пороге классификации 3,126. Площадь под кривой (AUC) 0,93.

Описание способа

Практическое обоснование метода основано на проведённом исследовании. В исследовании использовалась плазма крови пациентов с бронхиальной астмой. В качестве контроля использовалась плазма здоровых добровольцев. В исследование были включены 65 человек, среди которых 35 пациентов с бронхиальной астмой (средний возраст 54 [41; 61] год) и 30 здоровых добровольцев (средний возраст 47 [40; 55] лет). Группы не отличались по возрасту (p=0,194) и полу (p=0,586).

Согласно протоколу исследования после подписания информированного согласия перед забором крови у пациентов проводилась оценка факторов, способных оказывать независимое влияние на уровень асимметричного диметиларгинина в плазме крови, а именно проводилась оценка наличия следующих факторов невключения в исследование:

• декомпенсированная патология сердечно-сосудистой системы;

• тяжёлое нарушение функции печени в анамнезе, сопровождающихся повышением АЛТ, АСТ, общего билирубина, или щелочной фосфатазы более чем в 3 раза выше верхней границы нормы;

• тяжёлое нарушение функции почек в анамнезе, сопровождающихся снижением скорости клубочковой фильтрации ниже 60 мл/мин (рассчитанной по формуле CKD-EPI);

• злоупотребление и/или зависимость от психоактивных веществ и/или алкоголя.

У пациентов осуществлялся забор крови из локтевой вены в вакуумные пробирки, содержащие антикоагулянт ЭДТА-К3. Полученная кровь центрифугировалась в охлаждаемой центрифуге EPPENDORF Centrifuge 5702 R. Для центрифугирования применялись следующие настройки центрифугирования - ускорение 1000 g, температура 6°C, длительность центрифугирования 20 минут. Далее с полученной сывороткой проводили иммуноферментный анализ с применением коммерчески доступного лабораторного набора CEB301Ge ELISA Kit for Asymmetrical Dimethylarginine (ADMA), производство Cloud-Clone Corp., Китай), согласно официальной инструкции к лабораторным наборам.

Полученные результаты обрабатывали с помощью компьютерной программы jamovi 2.3.28.0. Описательная статистика показателей представлена в виде медианы, верхнего и нижнего квартиля (Me; Q25; Q75). Для оценки статистически значимых различий использовали попарные сравнения с помощью рангового критерия Манна-Уитни (U-тест). Критический уровень статистической значимости различий нулевой гипотезы (р) принимали равным 0,05. Для оценки связи количественных переменных между собой применялся коэффициент ранговой корреляции Спирмана и метод линейной регрессии. Для изучения чувствительности, специфичности и точности/диагностической значимости показателей использовались кривые операциональных характеристик (ROC-анализ).

В результате исследования доказано, что уровень аргиназы у здоровых добровольцев составляет 99,9 нг/мл (90,1; 107,0), а у больных бронхиальной астмой составляет 8,9 нг/мл (4,4; 12,8), что значительно ниже, чем у здоровых добровольцев (p < 0,001). Установлено, что уровень асимметричного диметиларгинина имеет зависимость от уровня индекса массы тела пациентов (ИМТ) определяемого по формуле:

ИМТ = (масса тела пациента, кг) / (рост пациента, м) ² (1)

Коэффициент корреляции R по Спирману: -0,45, p<0,001.

Для определения влияния ИМТ, используя метод линейной регрессии, нами получено уравнение регрессии для связи уровня асимметричного диметиларгинина и ИМТ пациента:

Асимметричный диметиларгинин, нг/мл = 195,45 - 5,11 × ИМТ, кг/м² (2)

Для диагностики бронхиальной астмы предложено измерение диагностического коэффициента как разности между полученным уровнем асимметричного диметиларгинина в плазме крови и ожидаемым уровнем асимметричного диметиларгинина, полученным расчётным путём в зависимости от ИМТ пациента, по формуле:

K = Y - (195,45 - 5,11 × X) (3)

где Y - Асимметричный диметиларгинин, нг/мл;

X - ИМТ, кг/м²;

Для определения точек разделения полученного диагностического коэффициента на группы - бронхиальная астма против здоровых добровольцев проведён ROC-анализ (Фиг. 1). На основании ROC-анализа выбрана точка разделения, соответствующая полученному диагностическому коэффициенту К, равному 3,12. На этом уровне точки разделения измеренный показатель чувствительности составляет 96,3%, специфичности - 89,47%, индекс Юдена - 0,86, AUC - 0,93. Таким образом, установлено, что уровень диагностического коэффициента К менее 3,126 соответствует диагнозу бронхиальной астмы у пациента, а уровень К более или равный 3,126 указывает на отсутствие бронхиальной астмы у пациента.

Клинический пример № 1

Пациент N.: определённый в крови уровень асимметричного диметиларгинина составил 104,6 нг/мл, индекс массы тела - 26,0 кг/м². Подставим значение в формулу расчета диагностического коэффициента:

K = 104,6, нг/мл - (195,45 - 5,11 × 26,0, кг/м²) = 42,01.

Уровень диагностического коэффициента К более 3,126, что соответствует отсутствию бронхиальной астмы. Из анамнеза установлено, что у пациента бронхиальная астма отсутствует.

Клинический пример № 2

Пациент N.: определённый в крови уровень асимметричного диметиларгинина составил 9,3 нг/мл, индекс массы тела - 26,6 кг/м². Подставим значение в формулу расчета диагностического коэффициента:

K = 9,3, нг/мл - (195,45 - 5,11 × 26,6, кг/м²) = -50,22.

Уровень диагностического коэффициента К менее 3,126, что соответствует диагнозу бронхиальной астмы. Из анамнеза установлено, что у пациент диагноз бронхиальная астма, смешанная форма, тяжёлое течение, частично контролируемая.

Клинический пример № 3

Пациент L.: определённый в крови уровень асимметричного диметиларгинина составил 88,2 нг/мл, индекс массы тела - 21,6 кг/м². Подставим значение в формулу расчета диагностического коэффициента:

K = 88,2, нг/мл - (195,45 - 5,11 × 21,6, кг/м²) = 3,126.

Уровень диагностического коэффициента К равен 3,126, что соответствует отсутствию бронхиальной астмы. Из анамнеза установлено, что у пациента бронхиальная астма отсутствует.

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для диагностики бронхиальной астмы у пациента с помощью определения концентрации асимметричного диметиларгинина в плазме крови. Осуществляют измерение концентрации асимметричного диметиларгинина в плазме крови методом иммуноферментного анализа и индекса массы тела пациента. Проводят расчёт диагностического коэффициента К по формуле: K = Y – (195,45 – 5,11 × X), где Y – асимметричный диметиларгинин, нг/мл, а X – ИМТ, кг/м². При К менее 3,126 у больного диагностируют бронхиальную астму. Способ обеспечивает возможность доступной и эффективной диагностики бронхиальной астмы за счет определения концентрации асимметричного диметиларгинина в крови и индекса массы тела пациента. 1 ил., 3 пр.

Способ диагностики бронхиальной астмы у пациента с помощью определения концентрации асимметричного диметиларгинина в плазме крови, включающий измерение концентрации асимметричного диметиларгинина в плазме крови методом иммуноферментного анализа и индекса массы тела пациента, характеризующийся тем, что проводят расчёт диагностического коэффициента К по формуле:

K = Y – (195,45 – 5,11 × X),

где Y – Асимметричный диметиларгинин, нг/мл,

а X – ИМТ, кг/м²,

и при К менее 3,126 у больного диагностируют бронхиальную астму.