Метод ингибирования апоптоза в клетках млекопитающих и композиция для его реализации Российский патент 2024 года по МПК C07K14/00 C12N5/00 

Изобретение относится в одном аспекте к способу предотвращения массовой гибели клеток млекопитающих, в частности апоптотической. В другом аспекте изобретение относится к композиции для предотвращения развития апоптоза в клетках млекопитающих, которая содержит по меньшей мере один пептидный компонент, нацеленный на потенциал-зависимые натриевые каналы на поверхности клеток млекопитающих.

Апоптоз относится к форме запрограммированной гибели клеток, при которой внутренние и внешние факторы запускают серию событий, которые приводят к эффективному уничтожению клетки. Помимо нормального развития тканей и гомеостаза апоптоз также может способствовать многим формам патологической потери клеток. Апоптоз в чрезмерных или недостаточных количествах приводит к нарушению клеточной пластичности и, в конечном счете, к аберрантной структуре и функции ткани. К примеру, чрезмерная апоптотическая гибель клеток в связи с сердечно-сосудистыми, неврологическими и иммунными заболеваниями. В сердечно-сосудистой системе чрезмерный апоптоз связывают с патогенезом сердечной недостаточности, ишемической болезни сердца, артериальной гипертензии и аритмогенной дисплазии правого желудочка [Калинини, Р.Е. Апоптоз в сосудистой патологии: настоящее и будущее / Р.Е. Калинин, И.А. Сучкова, Э.А. Климентова, А.А. Егорова, В.О. Поварова // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2020; 28(1): 79-87].

Аномальный апоптоз также наблюдался на животных моделях поражения при ишемии-реперфузии, атеросклероза, гипоксии, быстрой стимуляции желудочков, индуцированной давлением сердечной перегрузки и инфаркта миокарда. Чрезмерная апоптотическая гибель клеток связана с истощением CD4+ Т-клеток, наблюдаемым при синдроме приобретенного иммунодефицита, при фульминантном гепатите, связанном с инфекцией вирусами гепатита В и С, при некоторых нейродегенеративных [Zille, М. The impact of endothelial cell death in the brain and its role after stroke: A systematic review / M. Zille, M. Ikhsan, Y. Jiang, J. Lampe, J. Wenzel, M. Schwaninger // Cell Stress. 2019; 3(11): 330-347] и гематологических заболеваниях, при поликистозной болезни почек и ишемии [Sun, В. NF-κВ signaling, liver disease and hepatoprotective agents / B. Sun, M. Karin // Oncogen. 2008; 27: 6228-6244].

Одна из ведущих ролей в развитии апоптоза принадлежит ионам натрия, кальция и калия. Ряд ионных каналов открывается на ранних стадиях апоптоза, и блокирование каналов также предотвращает или задерживает апоптотический процесс. Было показано, что апоптотические стимулы, такие как стауроспорин или депривация сыворотки, активируют К+-каналы. Открытие К+-каналов приводит к оттоку ионов К+ и снижению внутриклеточной концентрации К+. Было показано, что пониженная концентрация К+ способствует активации каспаз и связанных с апоптозом нуклеаз [Sizemore, G. Opening large-conductance potassium channels selectively induced cell death of triple-negative breast cancer / G. Sizemore, S. McLaughlin, M. Newman, K. Brundage, A. Ammer, K. Martin, E. Pugacheva, J. Coad, M. D. Mattes, H.-G. Yu // BMC Cancer. 2020; 20: 595]. Следовательно, блокировка К+-каналов предотвращает апоптоз. Открытие каналов Na+, приводящее к увеличению притока Na+ и концентрации Na+ внутри клетки, также запускает апоптоз. Следовательно, блокировка Na+-каналов препятствует апоптозу [Kondratskyi, A. Ion channels in the regulation of apoptosis / A. Kondratskyi, K. Kondratska, R. Skryma, N. Prevarskaya // Biochimica et Biophysica Acta. 2015; 1848(10 Pt B): 2532-46]. Перегрузка кальцием приводит к чрезмерной активации ферментов, которые вызывают фрагментацию ДНК, а Са2+-зависимых цистеиновых протеаз, которые опосредуют расщепление нескольких членов семейства BCL-2 и способствуют высвобождениию цитохрома с [Pinton, P. Calcium and apoptosis: ER-mitochondria Ca2+ transfer in the control of apoptosis / P. Pinton, С.Giorgi, R. Siviero, E. Zecchini, R. Rizzuto // Oncogene. 2008; 27: 6407-6418]. Основной механизм проникновения ионов клетку связан с работой потенциал-зависимых ионных каналов. Поэтому эффективной стратегией снижения массовой гибели млекопитающих в результате апоптоза может служить ингибирование потенциал-зависимых каналов.

Известен способ предотвращения, ингибирования или иного снижения апоптоза клеток у животного или млекопитающего (патент AU2003222681B8, МПК1-7 А61К 31/14; А61К 31/45; А61К 38/17; А61П 25/28, публ. 2003 г.), включающий введение указанному животному или млекопитающему эффективного количества агента, блокирующего ионный канал, на время и в условиях, достаточных для блокирования или иного снижения функции ионный канал.

Недостатками данного способа являются использование химических составляющих в композиции, а также нацеленность на калиевые каналы, поскольку ионы калия участвуют в изменении размера клетки (набухании) при развитии апоптоза. Композиция предотвращает конечный этап гибель клеток, но не влияет на начальное развитие апоптоза.

Известен метод предотвращения вызванной давлением апоптотической гибели нервных клеток (патент US20110223166 А1, МПК А61К 31/405, публ. 2000 г.), включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении по меньшей мере одного соединения, которое прямо или косвенно ингибирует активность ионного канала в нервных клетках и тем самым ингибирует действие давления на клетках. Недостатки метода заключаются в блокировании активируемых растяжением каналов, которые отвечают за изменение размеров клетки при развитии апоптоза.

Ряд исследований показал, что увеличение внутриклеточного Na+ происходит на ранней стадии апоптоза, о чем свидетельствует увеличение проводимости Nav каналов, а также наоборот предотвращение притока Na+ предотвращает апоптоз [Banasiak, K.J. Activation of voltage-sensitive sodium channels during oxygen deprivation leads to apoptotic neuronal death / K.J. Banasiak, О. Burenkova, G.G. Haddad // Neuroscience. 2004; 126 (1): 31-44]. С одной стороны, влияние увеличения проводимости натриевых каналов можно объяснить тем, что ионы Na+ напрямую влияют на каспазы. А с другой, что повышенная внутриклеточная концентрация Na+ приводит к повышенному внутриклеточному Са2+.

Предполагаемое изобретения направлено на решение задачи, связанной со снижением массовую гибель клеток в результате воздействия проапоптотического фактора за счет изменения концентрации ионов натрия в клетке.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что заявляется метод ингибирования апоптоза в клетках млекопитающих, основанный на изменении проводимости потенциал-зависимых натриевых каналов на поверхности клеток млекопитающих и на ингибировании апоптоза в клетках млекопитающих, отличающийся тем, что дополнительно включает в себя инкубацию клеточных культур в течение 3 часов при 37°С и 5% CO2 при наличии в среде для культивации модулятора потенциал-зависимых натриевых каналов.

А также заявляется композиция, включающая по меньшей мере один пептидный компонент, способный связываться с потенциал-зависимыми натриевыми ионными каналами и изменять их проводимость, отличающийся тем, что в качестве пептидного компонента выступают токсины-кноттины из яда членистоногих, моллюсков и других ядовитых животных (под «кноттин» понимается структурная категория токсинов, характеризующая наличием ингибиторного цистинового узла). За счет высоко селективности по отношению к определенному типу каналов, эта группа токсинов способна избирательно связываться с каналами-мишенями и ингибировать их действие.

Использование предлагаемого изобретения обеспечивает следующий технический результат: изменение концентрации ионов натрия в клетках млекопитающих и снижение массовой гибели клеток в результате апоптоза.

Оценку эффективности метода и композиции оценивали следующим образом.

Для анализа использовали клеточную культуру СНО-K1. Клетки выращивали в 48-луночных планшетах до экспоненциальной стадии и воздействовали проапоптотическим пептидом и пептидным модулятором потенциал-зависимых натриевых каналов в концентрации от 10 до 50 нМ в течение 3 часов при 37°С и 5% CO2. По истечению 3 часов фиксировали уровень апоптоза (1 мкМ Yo-Pro 1), митохондриального потенциала (0,5 мкМ TMRE), оксидативного стресса (1 мкМ DCFH DA) и глутатиона (1 мкМ МСВ) с использованием флуоресцентного микроскопа.

Таким образом, предложенное изобретение позволяет снизить массовую гибель клеток в результате воздействия проапоптотического фактора за счет изменения концентрации ионов натрия в клетке.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской федерации (проект FEUF-2022-0008).

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу ингибирования апоптоза в клетках млекопитающих. Указанный способ включает в себя инкубацию клеточных культур в течение 3 часов при 37°С и 5% CO2 при наличии в среде для культивации по крайней мере одного пептидного модулятора, способного связываться с потенциал-зависимыми натриевыми ионными каналами и ингибировать их действие, при этом в качестве пептидного модулятора используют токсины-кноттины из яда членистоногих, моллюсков и других ядовитых животных. Изобретение обеспечивает изменение концентрации ионов натрия в клетках млекопитающих и снижение массовой гибели клеток в результате апоптоза.

Способ ингибирования апоптоза в клетках млекопитающих, причем способ включает в себя инкубацию клеточных культур в течение 3 часов при 37°С и 5% CO2 при наличии в среде для культивации по крайней мере одного пептидного модулятора, способного связываться с потенциал-зависимыми натриевыми ионными каналами и ингибировать их действие, при этом в качестве пептидного модулятора используют токсины-кноттины из яда членистоногих, моллюсков и других ядовитых животных.