Средство, обладающее апоптоз-ингибирующей активностью Российский патент 2019 года по МПК A61K31/19 A61P9/10 A61P35/00 A61P37/04 

Описание патента на изобретение RU2677877C1

Изобретение относится к области медицины и биологии и представляет собой новое средство, обладающее апоптоз-ингибирующей (антиапоптотической) активностью. Средство может быть использовано для коррекции состояний связанных с повышением уровня апоптоза клеток (окислительный стресс, ишемические повреждения), а также в качестве ингибитора апоптоза в культурах клеток in vitro.

Апоптоз является вариантом программируемой гибели клетки, как правило, вызываемой неблагоприятными внешними факторами или внутренними нарушениями в работе клетки не совместимые с нормальным функционированием. Следствием апоптоза является фрагментация клетки, а также ее ядра и ее элиминация фагоцитами без развития воспалительной реакции.

В некоторых ситуациях активация апоптоза приводит к нежелательным последствиям, в частности повышению гибели клеток при работе с клеточными культурами In vitro. При некоторых патологических состояниях также возрастает уровень апоптоза, например, при окислительном стрессе (повышении уровня свободно-радикального окисления), вызванного химическими, физическими, воспалительными или ишемическими факторами.

В настоящее время, известно средство, способствующее экспрессии белка bcl-2, средство, ингибирующее апоптоз, и средство, предотвращающее повреждение ДНК эпидермальных клеток ультрафиолетом [1]. Данное средство содержит растворимый в воде и этаноле экстракт солодки в качестве активного ингредиента. Однако, использование растительного компонента значительно усложняет процедуру получения и стандартизации активного вещества.

Известны композиции, ингибирующие апоптоз, способы очистки композиций и их применение [2], где в качестве основного действующего компонента применяют растительный порошок из растений семейств leguminosae, solanum, allium, семян гороха и сои. Недостатком метода является сложный процесс многостадийной обработки и экстракции с использованием различных растворителей и последующей очистки.

Для ингибирования апоптоза в популяции клеток Т-лимфоцитов используется антагонист-лиганд RAR-γ или агонист-лиганд RAR-α [3]. Данное средство предназначено для лечения заболеваний, связанных с избыточной скоростью апоптоза, в том числе, синдрома иммунодефицита, вызванного вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) или отторжения трансплантата. Также известны ингибиторы апоптоза и их применение (2247), на основе антиапоптозных фрагментов белка DAXX, которые получают из 17-24 последовательных аминокислот белка DAXX, включающих KKSRKEKKQTGSGPLG, а также их пептидомиметики и конъюгаты с проникающим в клетки пептидом. Однако, данный подход включает сложный процесс получения активного субстрата.

Целью заявленного изобретения является расширение арсенала средств, обладающих апоптоз-ингибирующей активностью.

Поставленная цель достигается применением соли лития и пировиноградной кислоты (пирувата лития) C3H3O3Li в качестве ингибитора апоптоза. Различные соли лития имеют широкое применение в психиатрии в качестве нормотимиков (стабилизаторов настроения) [4]. Ранее было известно применение пирувата лития для профилактики и лечения нейродегенеративной патологии и сосудистой деменции [5], где для лечения и профилактики нейродегенеративных заболеваний и сосудистой деменции предложены средства, содержащие органические соли лития.

Однако соли лития, в частности, пируват лития до настоящего времени не использовался в качестве ингибитора апоптоза. Антиапоптотические свойства пирувата лития впервые обнаружены и доказаны экспериментально. Сочетание психостабилизирующих, нейропротекторных, антиоксидантных свойств пирувата лития с его вновь выявленными антиапоптотическими свойствами перспективно для практического применения, в частности в клеточной биологии и медицине, включая, терапию ишемических повреждений, трансплантологию.

Исследование влияния пирувата лития на процесс апоптоза в культуре мононуклеаров периферической крови было проведено с использованием набора реактивов «Annexin V & Dead Cell Assay Kit» (Merck Millipore, Германия) на проточном цитометре «Muse Cell Analyzer» (Merck Millipore, Германия). Уровень спонтанного апоптоза определяли на интактной культуре после 24 часов инкубации при 37°С, уровень индуцированного апоптоза определяли после 24 часов инкубации при 37°С при добавлении индуктора апоптоза (гидроперекиси трет-бутила в концентрации 50 мкмоль/л).

Метод определения уровня апоптоза в культуре заключается в дифференцировании живых клеток, клеток в состоянии апоптоза и клеток в состоянии некроза (мертвые клетки) по уровню флуоресценции и виду красителя. Клетки, экспрессирующие на внешней стороне мембраны фосфатидил-серин и связанный с ним аннексии V, меченный флуоресцентной меткой, определяются как апоптотические. При этом различают клетки в ранней стадии апоптоза (early apoptosis, аннексии V-положительные) и в поздней (late apoptosis, аннексии V-положительные/пропидий иодид положительные). Клетки, содержащие только интерколирующий флуоресцентный краситель пропидий иодид, определяются как мертвые (некротические).

На фиг. 1 представлены: (а) интактная культура, (б) культура в присутствии гидроперекиси трет-бутила, (в) культура в присутствии пирувата лития, (г) культура в присутствии пируваат лития и гидроперекиси трет-бутила

Пример 1

Для оценки уровня антиапоптотической активности готовили рабочий раствор для чего 100 мг пирувата лития растворяли в 10 мл дистиллированной воды. Полученный раствор исследовали in vitro на клеточной суспензии мононуклеаров периферической крови человека. Клеточную суспензию мононуклеаров выделяют из периферической крови здоровых доноров центрифугированием на градиенте фиколла. Далее отмывают и ресуспендируют в среде RPMI 1640 и вносят в соответствующие лунки планшета. Для оценки уровня спонтанного апоптоза добавляют раствор пирувата лития в суспензию мононуклеаров с расчетом на конечную концентрацию в лунке 1,2 ммоль/л. Для оценки уровня индуцированного апоптоза добавляют в лунки с пируватом лития раствор гидроперекиси трет-бутила с расчетом на конечную концентрацию в лунке 50 мкмоль/л. В качестве отрицательного контроля используют интактную суспензию клеток, в качестве положительного контроля суспензию клеток с добавлением гидроперекиси трет-бутила с расчетом на конечную концентрацию в лунке 50 мкмоль/л. Клетки инкубируют в течение 24 часов при 37°С в среде 5% углекислого газа. Уровень апоптоза в культуре рассчитывался как количество клеток в раннем апоптозе (early apoptosis) и в позднем (late apoptosis) в процентах к общему количеству клеток.

Результаты определения уровня апоптоза представлены в таблице 1 в процентах апоптотических клеток после 24 часов инкубации мононуклеаров при воздействии пируватом лития и без него.

*р<0,001 по сравнению с интакной культурой

**р=0,007 по сравнению с культурой в присутствии гидроперекиси трет-бутила

Как видно из таблицы 1 и фиг. 1, при добавлении пирувата лития достигалось выраженное ингибирование индуцированного апоптоза и сохранение основного пула живых клеток: процент индуцированного апоптоза мононуклеаров периферической крови при инкубации с пируватом лития был статистически значимо ниже по сравнению с культурой, инкубированной с гидроперекисью трет-бутила (t=2,944, df=24, р=0,007).

Список литературы

1. Пат. 2448723 Российская Федерация, МПК А61К, А61Р. Средство, способствующее экспрессии белка BCL-2, средство, ингибирующее апоптоз, и средство, предотвращающее повреждение ДНК эпидермальных клеток ультрафиолетом / Такита Macao (JP); заявитель и патентообладатель НИСИХАРА КО, ЛТД (JP). - №2010152636; заявл. 23.05.2008; опубл. 27.04.2012, Бюл. №12 - 6 с.

2. Заявка №96115127 (RU).

3. Пат. 2191008 Российская Федерация, МПК А61К, А61Р. Антагонист-лиганд RAR-γ или агонист-лиганд RAR-α в качестве ингибитора апоптоза / ФЕШУШ Ласло (HU), СОНДИ Жужа (HU), РАЙХЕРТ Уве (FR); заявитель и патентообладатель САНТР ЭНТЕРНАСЬОНАЛЬ ДЕ РЕШЕРШ ДЕРМАТОЛОДЖИК ГАЛДЕРМА (С.И.Р.Д. ГАЛДЕРМА) (FR). - №98108534; заявл. 08.10.1996; опубл. 20.10.202, Бюл. №29.

4. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в двух частях. Ч1. - 12 изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1986. - С. 127-129).

5. Пат. 2587617 Российская Федерация, МПК А61К, А61Р. Способ профилактики и лечения нейродегенеративной патологии и сосудистой деменции / Громова О.А., Торшин И.Ю.; заявитель и патентообладатель Громова Ольга Алексеевна (RU), Трошин Иван Юрьевич (RU). - №2014152190; заявл. 23.12.2014; опубл. 20.06.2016, Бюл. №17-5 с.

Похожие патенты RU2677877C1

название год авторы номер документа
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АПОПТОЗ-ИНДУЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ 2017
  • Плотников Евгений Владимирович
  • Лосенков Иннокентий Сергеевич
  • Иванова Светлана Александровна
  • Бохан Николай Александрович
RU2654711C1
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ЦИТОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ 2019
  • Плотников Евгений Владимирович
  • Скорик Нина Алексеевна
  • Плотников Владимир Михайлович
RU2717343C1
СРЕДСТВО И СПОСОБ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК 2012
  • Старикова Елена Григорьевна
  • Таширева Любовь Александровна
  • Рязанцева Наталья Владимировна
  • Новицкий Вячеслав Викторович
  • Васильева Ольга Александровна
RU2488408C1
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИАПОПТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2018
  • Кампе-Немм Елена Артуровна
  • Колобов Александр Александрович
  • Роговская Надежда Юрьевна
  • Бабаков Владимир Николаевич
RU2685428C1
ИНГИБИТОРЫ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ КАК ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ПРИ ЛИМФОМАХ И ЛЕЙКОЗАХ 2012
  • Баранова Анна Вячеславовна
  • Марахонов Андрей Владимирович
  • Скоблов Михаил Юрьевич
  • Бидерман Белла Вениаминовна
  • Никитин Евгений Александрович
  • Судариков Андрей Борисович
RU2533288C2
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АГОНИСТА-ЛИГАНДА, СПЕЦИФИЧНОГО ДЛЯ РЕЦЕПТОРОВ ТИПА RAR-γ, ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ СКОРОСТИ АПОПТОЗА 1996
  • Фешуш Ласло
  • Сонди Жужа
  • Райхерт Уве
RU2188037C2
Способ предотвращения инактивации клеточной гибели, вызываемой цитохромом С 2023
  • Ромодин Леонид Александрович
RU2811126C1
АНТАГОНИСТ-ЛИГАНД RAR-γ ИЛИ АГОНИСТ-ЛИГАНД RAR-α В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРА АПОПТОЗА 1996
  • Фешуш Ласло
  • Сонди Жужа
  • Райхерт Уве
RU2191008C2
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ НЕЙРОПРОТЕКТОРНАЯ, АНТИОКСИДАНТНАЯ, АНТИГИПОКСАНТНАЯ, АНТИАПОПТОТИЧЕСКАЯ И МЕМБРАНОПРОТЕКТОРНАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ 2008
  • Кожока Тимофей Георгиевич
  • Филимонов Владимир Александрович
  • Ясинский Сергей Ярославович
RU2385722C1
ПРИМЕНЕНИЕ ФРАГМЕНТА ДНК ТРАНСКРИБИРУЕМОЙ ОБЛАСТИ РИБОСОМНОГО ПОВТОРА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК К ДЕЙСТВИЮ АГРЕССИВНЫХ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ 2013
  • Костюк Светлана Викторовна
  • Ершова Елизавета Сергеевна
  • Смирнова Татьяна Дмитриевна
  • Каменева Лариса Владимировна
  • Вейко Наталья Николаевна
RU2560270C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 677 877 C1

Реферат патента 2019 года Средство, обладающее апоптоз-ингибирующей активностью

Изобретение относится к области медицины и биологии и представляет собой новое средство, обладающее апоптоз-ингибирующей (антиапоптотической) активностью. Средство может быть использовано для коррекции состояний, связанных с повышением уровня апоптоза клеток (окислительный стресс, ишемические повреждения), а также в качестве ингибитора апоптоза в культурах клеток in vitro. Средство представляет собой кристаллический пируват лития общей формулы C3H3O3Li. Изобретение расширяет арсенал средств, обладающих апоптозингибирующей активностью, и может быть использовано в медицине и биологии. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Формула изобретения RU 2 677 877 C1

Применение пирувата лития общей формулы C3H3O3Li в качестве средства, обладающего апоптоз-ингибирующей активностью.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2019 года RU2677877C1

YOUNG-HEE KANG, Intramitochondrial pyruvate attenuates hydrogen peroxide-induced apoptosis in bovine pulmonary artery endothelium, Molecular and Cellular Biochemistry, January 2001, Volume 216, Issue 1-2, pp
Пишущая машина 1922
  • Блок-Блох Г.К.
SU37A1
HYO JUNG KANG et
al., Calcium-Dependent Prevention of Neuronal Apoptosis by Lithium Ion: Essential Role of Phosphoinositide 3-Kinase and Phospholipase Cγ, Molecular Pharmacology August 2003, 64 (2) 228-234; [Найдено 19.10.2018], найдено из Интернет http://molpharm.aspetjournals.org/content/64/2/228
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНОЙ ПАТОЛОГИИ И СОСУДИСТОЙ ДЕМЕНЦИИ 2014
  • Громова Ольга Алексеевна
  • Торшин Иван Юрьевич
RU2587617C1

RU 2 677 877 C1

Авторы

Плотников Евгений Владимирович

Лосенков Иннокентий Сергеевич

Епимахова Елена Викторовна

Бохан Николай Александрович

Даты

2019-01-22Публикация

2018-03-28Подача