Способ определения жизнеспособности пыльцы in vitro у видов и сортов CLARKIA PURSH Российский патент 2024 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к области селекции, семеноводства и биотехнологии растений, может быть использовано в декоративном садоводстве и цветоводстве.

В настоящее время пыльцевая селекция широко применяется как экспресс-метод для оценки реакции генотипов на различные абиотические стресс-факторы, токсические вещества и патогены, для оценки устойчивости разных видов растений к высоким и низким температурам [1].

Основными компонентами обычно используемых сред для проращивания пыльцы являются сахароза и борная кислота.

Известен способ проращивания пыльцы межвидовых гибридов томата (SU 1470247 A1, 1989), включающий посев пыльцы на искусственную питательную среду, содержащую сахарозу, борную кислоту и дистиллированную воду, проращивание в течение 3-х часов при температуре 25-27°С.

В этом способе в состав среды включена сахароза, которая способствует увеличению интенсивности дыхания пыльцы, а также он более сложен за счет точности подбора длины световой волны, требуемой для ускорения проращивания пыльцевых зерен.

Наиболее близким по технологической сущности заявленному является способ определения жизнеспособности пыльцы сурепицы путем проращивания in-vitro (CN 104480184 B). Этот способ включает жидкую среду для культивирования in vitro пыльцы сурепицы (Brassica rapa subsp. сampestris), которая включает следующие компоненты: 50%-ный раствор ПЭГ 6000, 15%-ный раствор сахарозы, 0,2 мг гиббереллинов и 1 мг витамина B₁. Пыльца культивируется в условиях освещенности, при температуре 35°С. Способ определения жизнеспособности пыльцы сурепицы включает морфологическое наблюдение под микроскопом, окрашивание пыльцевых зерен и культивирование in vitro.

Недостатком данного способа является отсутствие методики культивирования пыльцы у однолетних цветочно-декоративных растений, включая род Clarkia Pursh семейства Onagraceae Juss. и состав среды, в котором рост пыльцевых трубок может стимулировать, как добавление фитогормонов - гиббереллинов, так и витамина В₁, а сахароза участвует в метаболизме растительных клеток. Сложность представляет выявление степени активности пыльцевых зерен путем окрашивания, которое осуществляется с использованием красящего реагента и оценивается по изменению цвета. Окрашивание может быть сопряжено с непредсказуемой реакцией разных генотипов на токсическое действие красителя-ксенобиотика, а также есть вероятность окрашивания некоторой части стерильной пыльцы, что влияет на точность опыта.

Задачей настоящего способа является разработка способа определения жизнеспособности пыльцы in vitro у видов и сортов Clarkia Pursh - однолетних цветочно-декоративных растений семейства Onagraceae Juss., включающего культивирование пыльцы в капле среды, содержащей синтетическое осмотически активное вещество - полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000 (ПЭГ 6000) в концентрации 30% и добавлением в среду микроэлементов, в следующих концентрациях: борной кислоты H₃BO₃ - 10 мг / 100 мл, нитрата кальция CaNO₃ - 30 мг /100 мл, сульфата магния MgSO₄ - 20 мг / 100 мл, нитрата калия KNO₃ - 10 мг / 100 мл.

Способ включает следующие этапы:

1) Сбор пыльцы с цветков кларкии. Пыльца собирается с каждого вида и (или) сорта кларкии - отдельно, не допуская смешивания образцов. Для сбора пыльцы выбираются только здоровые и сильные растения, без следов повреждений болезнями и вредителями; в фазе полного цветения (50-75% раскрытых цветков);

2) Культивирование пыльцы in vitro и оценка скорости роста пыльцевых трубок: производится на чистом предметном стекле, в капле среды с ПЭГ 6000 в чашке Петри, при постоянной температуре 25°С в течение 4-х часов и проводится первичный контроль показателей жизнеспособности и энергетической активности (энергии прорастания) пыльцевых зерен с итоговым контролем через 24-е часа (табл.1, фиг.1). Пыльцу равномерно высевают на чистое предметное стекло и капают каплю жидкой среды, содержащей ПЭГ 6000 в концентрации 30% с добавлением микроэлементов и тщательно перемешивают; затем предметное стекло с культивируемой пыльцой кладут на слой увлажненной фильтровальной бумаги в чашку Петри; закрытую чашку Петри с культивируемой пыльцой ставят в термостат для поддержания постоянной температуры 25°C;

3) Измерение размеров пыльцевых зерен и пыльцевых трубок проводят с использованием микроскопа БИОМЕД 5, микрофотосъемку с использованием цифровой камеры TOUPCAM FM A 050. Подключение камеры к компьютеру осуществляется через порт USB;

4) Размер пыльцевых зерен и пыльцевых трубок измеряется в микронах с использованием окуляр микрометра. В подсчет включается не менее 5 полей зрения, просматривается не менее 100 пыльцевых зерен;

5) Контроль показателей энергетической активности и жизнеспособности пыльцевых зерен и оценка скорости роста пыльцевых трубок.

Определение показателя энергетической активности (энергии прорастания) пыльцевых зерен проводили по методике Я.Г. Оголевец (1961). Энергия прорастания пыльцевых зерен соответствует величине, являющейся произведением процента прорастания пыльцы (жизнеспособность, %) за определенный срок на относительную длину пыльцевой трубки, выраженную в процентах к максимальной длине, полученной в опыте.

Жизнеспособность пыльцы соответствует числу проросших пыльцевых зерен по отношению к их общему числу, выраженному в процентах, в не менее 5-ти просмотренных полях зрения при среднем увеличении микроскопа (100 x). Проросшими считали пыльцевые зерна с длиной пыльцевой трубки равной длине пыльцевого зерна в экваториальной проекции (экваториальный диаметр) и более.

Исследования по определению жизнеспособности пыльцы у различных видов и сортов кларкии имеют очень важное теоретическое и практическое значение для сохранения и использования ресурсов зародышевой плазмы и селекции новых сортов.

Далее приводятся результаты культивирования пыльцы у видов и сортов Clarkia Pursh (средние значения за два последних года), в зависимости от времени культивирования и состава среды: с содержанием ПЭГ 6000 в концентрации 30% и контроля с содержанием сахарозы в концентрации 15% (табл.1).

Таблица 1.

Энергетическая активность и жизнеспособность пыльцевых зерен у видов и сортов Clarkia Pursh, в зависимости от времени культивирования и состава среды

Вид кларкии Время, часы *ПЭГ 6000 - 30 % *Сахароза - 15% (контроль) **Энергия прорастания, % Жизнеспособность, % Длина ПТр, мкм **Энергия прорастания, % Жизнеспособность,
% Длина ПТр, мкм Секция Rhodanthos C. amoena (Lehm.) A. Nelson & J. F. Macbr
Малиновая чаша 4 29,50 ± 1,69 44,30 ± 3,36 90,76 ± 5,20 12,46 ± 1,92 19,37 ± 2,16 38,29 ± 5,91 24 35,50 ± 4,54 59,43 ± 2,63 133,75 ±16,08 25,07 ± 2,45 35,16 ±1,29 63,18 ± 6,17 C. amoena subsp. lindleyi (Douglas) H. F. Lewis & M. R. Lewis Персиковая чаша 4 19,37 ± 2,14 41,7 ± 2,34 75,30 ± 5,86 11,77 ± 0,87 19,07 ± 1,41 27,37 ± 2,01 24 33,79 ± 3,51 54,31 ± 2,55 137,5 ± 13,95 17,35 ± 1,23 28,15 ± 1,36 35,92 ± 3,24 Секция Godetia С. Purpurea (Curtis) A. Nelson & J. F. Macbr.
Лиловая фея 4 43,88 ± 5,13 76,07 ± 4,85 113,44 ± 16,25 28,97 ± 2,61 38,85 ± 3,49 75,25 ± 6,78 24 51,17 ± 4,73 87,86 ± 2,61 178,99 ± 33,85 29,11 ± 1,55 45,68 ± 2,50 99,37 ± 8,06 Секция Phaeostoma C. unguiculata Lindl.
Коралловые рифы 4 37,07 ± 3,20 47,20 ± 1,95 105,20 ± 14,46 20,79± 1,34 28,81 ± 3,29 72,17 ± 3,75 24 38,70 ± 3,89 75,25 ± 4,17 134,11 ± 29,3 20, 91 ± 3,37 41,25 ± 2,48 88,22 ± 18,59 Средние значения 4 32,46 ± 3,04 52,32 ±3,13 96,18 ± 10,44 18,49 ± 1,69 26,52 ± 2,59 53,27 ± 4,61 24 39,79 ± 4,17 69,21 ±2,99 146,09 ± 23,29 23,11 ± 2,15 37,56 ± 1,91 71,67 ± 9,01

*Среда как с ПЭГ 6000, так и с сахарозой включала: борную кислоту H₃BO₃ - 10 мг /100 мл, нитрат кальция Ca(NO₃) - 30 мг /100 мл, сульфат магния MgSO₄ - 20 мг/ 100 мл, нитрат калия KNO₃ - 10 мг / 100 мл.

** Энергетическая активность (энергия прорастания) пыльцевых зерен рассчитывалась по методике: Оголевец, 1961.

Результаты подтвердили, что при использовании среды с содержанием ПЭГ 6000 в концентрации 30% - показатели скорости роста пыльцевой трубки, энергетической активности (энергии прорастания) и жизнеспособности пыльцевых зерен у представителей рода Clarkia Pursh, из трех различных секций значительно превышают эти же показатели, полученные на среде с использованием 15%-ной сахарозы, как после 4-х часов, так и после 24-х часов культивирования:

1) Секция Rhodanthos: у C. amoena (Lehm.) A. Nelson & J. F. Macbr. сорта Малиновая чаша энергетическая активность и жизнеспособность пыльцевых зерен была выше в 2,4-2,3 раза после 4-х часов культивирования и в 1,4-2,4 раза после 24 часов культивирования при этом длина пыльцевых трубок была выше в 2,4-2,1 раза соответственно, чем у контрольных вариантов, культивируемых на среде с содержанием 15%-ной сахарозы. У подвида C. amoena subsp. lindleyi сорта Персиковая чаша показатели энергетической активности и жизнеспособности были выше в 1,7-2,2 раза после 4-х часов культивирования и в 2-1,9 раза после 24-х часов культивирования соответственно, при этом длина пыльцевых трубок была выше в 2,7-3,8 раза, чем у контрольных вариантов;

2) Секция Godetia: у С. purpurea (Lehm.) A. Nelson & J. F. Macbr. сорта Лиловая фея энергетическая активность и жизнеспособность пыльцевых зерен после 4-х часов культивирования выше, чем у контрольного варианта в 1,5-2 раза, а при увеличении времени культивирования до 24-х часов - в 1,8-1,9 раза, при этом длина пыльцевых трубок выше в 1,5-1,8 раза, соответственно.

Необходимо отметить, что среди проанализированных видов и сортов кларкии - С. purpurea Лиловая фея из секции Godetia отличается наиболее высокими показателями энергетической активности и жизнеспособности пыльцевых зерен и более интенсивным ростом пыльцевых трубок.

3) Секция Phaeostoma: у C. unguiculata Lindl. сорта Коралловые рифы энергетическая активность и жизнеспособность пыльцевых зерен после 4-х часов культивирования была выше в 1,8-1,6 раза соответственно, а после 24-х часов культивирования энергетическая активность и жизнеспособность пыльцевых зерен были выше в 1,8 раза, чем у контрольного варианта. Длина пыльцевых трубок была выше в 1,5 раза в обоих сроках культивирования.

Средние значения энергетической активности и жизнеспособности пыльцевых зерен для всех представленных видов и подвида Clarkia Pursh из трех секций на среде с ПЭГ 6000 превышают показатели контроля в 1,8-2,0 раза через 4-е часа и в 1,7-1,8 раза через 24-е часа культивирования. Длина пыльцевых трубок на среде с ПЭГ 6000 после 4-х и 24-х часов культивирования больше в 1,8-2 раза соответственно, чем у контрольных вариантов.

Итак, скорость роста пыльцевых трубок, энергетическая активность и жизнеспособность пыльцевых зерен у исследованных видов и сортов Clarkia Pursh из трех различных секций чувствительны, как к среде культивирования, так и к продолжительности времени культивирования.

Скорость роста пыльцевых трубок и соотношение длины пыльцевой трубки к экваториальному диаметру пыльцевого зерна у видов и сортов Clarkia Pursh в зависимости от времени культивирования и состава среды хорошо продемонстрированы на фигуре 1.

Культивирование пыльцы на среде с содержанием ПЭГ 6000 в концентрации 30% через 4-е часа показало, что длина пыльцевых трубок у всех представленных видов и сортов кларкии превышает экваториальный диаметр пыльцевого зерна, в среднем, в 1,8 раза, а через 24-е часа - в 2 раза, соответственно.

Культивирование на среде с содержанием сахарозы в концентрации 15 % через 4-е часа показало очень слабую скорость роста пыльцевых трубок у представителей секции Rhodanthos: C. amoena Малиновая чаша и подвида C. amoena subsp. lindleyi Персиковая чаша - длина пыльцевых трубок у них была меньше 1/2 экваториального диаметра пыльцевого зерна, а через 24-е часа - их длина достигала, в среднем 75% от экваториального диаметра. У представителей секции Godetia: С. purpurea Лиловая фея и секции Phaeostoma: C. unguiculata Коралловые рифы через 4-е часа культивирования длина пыльцевых трубок была меньше экваториального диаметра пыльцевого зерна на 10 %, а через 24-е часа культивирования превышала его только в 1,2 раза.

Таким образом, заявленный способ обладает преимуществом для контроля жизнеспособности и энергетической активности пыльцевых зерен, скорости роста пыльцевых трубок, в простоте приготовления среды для культивирования пыльцы и подсчета длины пыльцевых трубок и может использоваться при селекции видов и сортов цветочно-декоративных культур рода Clarkia Pursh семейства Onagraceae Juss.

Источники

1. Фотев Ю. В. Оценка холодостойкости коллекционных образцов момордики (Momordica charantia L.) по прорастанию пыльцы при низкой температуре in vitro. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 2022;183(3): 39-47. DOI: 10.30901/2227-8834-2022-3-39-47.

2. Авторское свидетельство № 1470247 A1, СССР, МПК A01H 1/04. Способ проращивания пыльцы межвидовых гибридов томатов: № 4256068: заявл. 16.04.1987: опубл. 07.04.1989 / В. А. Лях, А. Н. Кравченко, Е. Н. Дрючина, В. К. Бурилков; заявитель Институт Экологической генетики АН МССР.

3. CN 104480184 B. The germination in vitro of turnip type rape pollen cultivates the method measuring Pollen Activity. URL: https://patents.google.com/patent/CN104480184B/en?oq=CN+104480184+B&peid=60c774764d158%3A2f3%3Aa5ca29d.

4. Оголевец Я. Г. О самостерильности Ирисов // Бюллетень ГБС. - Вып. 40, 1961.- С. 77-85.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ определения жизнеспособности пыльцы in vitro у видов и сортов Clarkia Pursh, при котором собранную пыльцу каждого вида или сорта культивируют в два этапа, при этом на первом этапе ее сеют на предметное стекло в каплю жидкой среды, содержащей осмотически активное вещество – полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000 – в концентрации 30% и микроэлементы в следующих концентрациях – борная кислота H₃BO₃ – 10 мг / 100 мл, нитрат кальция CaNO₃ – 30 мг /100 мл, сульфат магния MgSO₄ – 20 мг / 100 мл, нитрат калия KNO₃ – 10 мг / 100 мл, выдерживают 4 часа при постоянной температуре 25°С, а на втором этапе пыльцу выдерживают в данной среде 24 часа, после каждого этапа осуществляют контроль энергетической активности и жизнеспособности пыльцевых зерен под микроскопом и скорости роста пыльцевых трубок, отражающих активность и физиологические качества пыльцы. Изобретение позволяет определить жизнеспособность пыльцы in vitro у видов и сортов Clarkia Pursh. 1 ил., 1 табл.

Способ определения жизнеспособности пыльцы in vitro у видов и сортов Clarkia Pursh, при котором собранную пыльцу каждого вида или сорта культивируют в два этапа, при этом на первом этапе ее сеют на предметное стекло в каплю жидкой среды, содержащей осмотически активное вещество – полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000 – в концентрации 30% и микроэлементы в следующих концентрациях – борная кислота H₃BO₃ – 10 мг / 100 мл, нитрат кальция CaNO₃ – 30 мг /100 мл, сульфат магния MgSO₄ – 20 мг / 100 мл, нитрат калия KNO₃ – 10 мг / 100 мл, выдерживают 4 часа при постоянной температуре 25°С, а на втором этапе пыльцу выдерживают в данной среде 24 часа, после каждого этапа осуществляют контроль энергетической активности и жизнеспособности пыльцевых зерен под микроскопом и скорости роста пыльцевых трубок, отражающих активность и физиологические качества пыльцы.