Способ культивирования лежалой пыльцы табака NIсотIаNа тавасUм L Советский патент 1992 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии и биохимии растений и может быть применено для модельных экспериментов в области молекулярной биологии эмбриогенеза.

Известны способы проращивания свежей пыльцы высших растений на искусственных средах. Наряду с использованием чистых растворов сахарозы, указывается на возможность добавления в среду физиологически активных веществ, стимулирующий эффект воздействия которых стабилизируется борной кислотой Так, при введении в среду для проращивания свежей пыльцы табака крылатого (Nicotiana alata Link, et Otto)2,4-D в концентрации 10 3-107% эффективность прорастания достигала в среднем 27,3% и превышала контроль почти в 2,5 раза Однако конкретные способы проращивания лежалой пыльцы не описаны.

Известен способ культивирования свежей пыльцы табака Nicotiana Tabacum L. выбранный в качестве прототипа, в котором пыльца проращивается на искусственной питательной среде, содержащей 25 мМ MES-KOH,pH5,9, 180-300 мМ сахарозы, 1,6 мМ НзВОз, 3 мМ Са(ЫОз)2, 0.8 мМ MgSO/i, 1 мМ КМОз Добавление гидролизата казеина (+1 мл на 1 мл среды) позволяет продлить культивирование трубок до 48 ч. Однако данные по проращиванию лежалой пыльцы отсутствуют Между тем, при отсутствии благоприятных полевых условий и нехватки

4Ьь О 4D СЛ

холодильного оборудования необходимо использовать старый материал.

Цель изобретения - повышение эффективности прорастания лежалой пыльцы табака Nicotiana tabacum L.

Указанная цель достигается тем, что в известном способе культивирования пыльцы табака Nicotiana tabacum L. на стандартной питательной среде с введением добавки, в качестве последней используют 1,4-бис- 1-(2-этокси-этил)-4-оксипиперидил ,3-бутадиин (БИЭТОБ) в концентрациях 25-100 мкг на 1 мл среды. БИЭТОБ - новое химическое соединение (N° roc. регистрации 8530488), обладающее противоаритми-, ческой активностью. В предлагаемом способе используется пыльца, хранившаяся в течение 12 мес и более.

Пример 1 Перед употреблением БИЭТОБ растворяют в бидистиллирован- ной воде в концентрации 5 мг/мл. стерилизуют холодным способом через мембранный фильтр Mil llpore (размер пор 0,22 мкм). Маточный раствор БИЭТОБа хранят в пробирке в замороженном виде(-18°С) и используют многократно. Стандартную питательную среду без сахарозы готовят в виде 5-кратного исходного раствора и добавляют перед употреблением сахарозу из исходного 30%-ного водного раствора. Оба исходных раствора также хранят на холоде и используют многократно.

5 мг пыльцы N. tabacum (сорта Samsun). хранившийся в течение 12 мес и более при -20 С, культивируют в асептических условиях при 26°С в течение 18 ч в 10 мл стандартной питательной среды, содержащей 25 мМ MES-KOH. рН 5,9, 180 мМ сахарозы, 1,6 мМ НзВ03. 3 мМ Ca(N05y),8 мМ МдЗОц, 1 мМ КМОз с добавлением 1,4-бис- 1-(2-эгок- сиэтил)-4-оксипиперидил-4 -1,3-бутадиина (БИ.ЭТОБ) в концентрациях 25, 50, 100 мкг на 1 мл среды. Данные сведены в табл. 1. По окончании культивирования пыльцевые трубки собирают с помощью фильтрования, промывают водным раствором 10%-ной сахарозы и взвешивают на микроаналитических весах Sartorius МР 2004.

Как следует из табл. 1, добавление БИЭТОБа увеличивает выход биомассы трубок из лежалой пыльцы в среднем на полпорядка - порядок, при этом значение 50 мкг/мл является оптимальной концентрацией.

Пример 2. Пыльцу культивируют, как описано в примере 1. По окончании инкубации трубки фиксировали 4% формальдегида и производят подсчет их числа визуально с помощью микроскопа (объектив Юх/0.32, цена деления 10 мкм) и фотографируют на

черно-белую фотопленку Микрат-200.

Из данных табл. 2 видно, что эффективность прорастания лежалой пыльцы в при- сутствии БИЭТОБа возрастает более чем в 5 раз, что полностью согласуется с данными

примера 1.

Пример 3. Прораставшую, как описано в предыдущих примерах, пыльцу без фиксации формальдегидом гомогенизировали в буфере, содержащем 50 мМ Trls-HCI, рН 7,

6, 25 мМ KCI, 5 мМ MgCI, 3 мМ 2-МЭТ. 250 мМ сахарозы (или 10% глицерина), центрифугируют при 16 000 об/мин в течение 20 мин. Цитоплазматические белки постмито- хондриального супернатанта подвергают

фосфорилированию in vitro. Реакционная смесь состоит из 50 мМ HERES-KOH, рН 7,8. 1 мкМ АТФ, цитоплазматических белков, 20 мкг и 32 Р-АТФ, из расчета 2-5x106 имп/мин на 100 мкл смеси. Реакцию проводят при

28- 30°С в течение 30 мин на термостатиру- емой водяной бане. По окончании инкубации белки осаждают 70% этанола при -20°С в течение ночи и подвергают электрофорезу в ДСН-ПААГ с последующей радиоавтографией. Фосфорилирование 70 кД полипептида имеет место и при наличии БИЭТОБа. и без его добавления в питательную среду для культивирования пыльцы. Сохранение данной посттрансляционной модификации несмотря на новые условия культивирования с дополнительным ингредиентом (БИЭТОБ), служит веским основанием в пользу биохимической полноценности полученных пыльцевых трубок и его тождественности

пыльцевому материалу, культивируемому в известных условиях.

Формула изобретения

Способ культивирования лежалой пыльцы табака Nicotiana tabacum L., включающий помещение пыльцы на искусственную питательную среду со стимулятором роста, отличающийся тем. что. с целью

повышения эффективности прорастания, в качестве стимулятора используют 1,4-бис- 1-(2-этоксиэтил)-4-оксипиперидил-4 -1,3-6 - утадиин в концентрации 25-100 мкг на 1 мл среды.

Таблица

Использование: биотехнология и биохимия растений. Сущность изобретения: пыльцу табака, хранившуюся в течение длительного времени, культивируют на стандартной питательной среде, в которую в качестве стимулятора дополнительно вводят 1,4-бис- 1-{2-этоксиэтил}-4-оксипипери- дил-4 1 3-бутадиин (БИЭТОБ) в концентрации 25-100 мкг на 1 мл среды 2 табл.

Зависимость биомассы пыльцы, прораставшей 18-м на искусственной среде, от концентрации БИЭТОБа

Таблица2 Эффективность прорастания трубок из лежалой пыльцы при добавлении БИЭТОБа