Способ молекулярно-генетической паспортизации древесины популяций ели сибирской для определения ее географического происхождения Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 A01H1/00 

Область техники

Изобретение относится к области генетики растений, в частности к способу молекулярно-генетической идентификации древесины популяций ели сибирской (Picea obovata Ledeb., Pinaceae), а также представлению полученных данных в виде молекулярно-генетического паспорта древесины популяции. Изобретение позволяет записать в молекулярно-генетическом паспорте древесины ели сибирской идентификационные фрагменты ДНК, определенные при использовании в качестве растительного материала древесины, а также представить данные в виде молекулярно-генетического паспорта, включающего молекулярно-генетическую формулу древесины популяции с указанием частот фрагментов ДНК для определения географическое происхождение древесины, что актуально для контроля легальности заготовки древесины.

Уровень техники

При отслеживании происхождения древесины имеются три критические точки поставки, в цепочке продукции от заготовки древесины до потребителя, в которых могут включены нелегальные материалы. К таким точкам относятся: 1) места штабелевки древесины; 2) склады; 3) пакеты пиломатериалов. Для каждой из этих критических точек должны быть разработаны системы, минимизирующие риск случайного или преднамеренного смешения легальных и нелегальных материалов. Обычно это достигается сочетанием трех подходов: идентификацией продукции, ее разделением и документированием [Птичников и др., 2011].

В настоящее время в России в соответствии с федеральным законом от 28.12.2013 N 415-ФЗ необходимо производить маркирование древесины, однако обязательной маркировке подлежать лишь три ценных лесных породы - ясень, дуб и бук. Маркировка древесины должна производится так, чтобы была возможность нанесения и считывания сведений о маркируемой древесине с использованием технических средств [Забавина, 2015].

Идентификация деревьев по фенотипу очень трудоемкий процесс, поскольку нужно оценить порядка 64 признаков (по системе идентификации, рекомендованной Международной комиссией IUPOV (International Union for the Protection of New Varieties of Plants (https: //www, upov.int/porlal/index.html.en)), также на фенотип деревьев существенное влияние оказывают условия окружающей среды [Тараканов и др., 2021]. Одним из способов идентификации вида неизвестного образца древесины является спектроскопия в ближней инфракрасной области, но данный способ позволяет определить лишь вид древесины, а не идентифицировать место ее произрастания [Хох, Звягинцев, 2020]. Одним из подходов установления места произрастания срубленной древесины является дендрохронологический подход (по годичным кольцам), однако этот метод не всегда позволяет точно определить происхождение древесины [Хох, 2021]. На разных стадиях переработки древесины годичные кольца подвергаются изменениям, что делает идентификацию по ним невозможной.

Оценка объемов нелегально заготовленной древесины в настоящее время оценивается при помощи балансового метода, который сравнивает объем деловой древесины в регионе (включая импорт) с объемом ее потребления (включая экспорт) [Тарасов, 2006]. Помимо этого, был предложен метод, основанный на сопоставлении официальных данных об объемах лесозаготовки в регионе и поступления древесины из других мест с официальными данными об объемах ее потребления и вывоза из региона [Котлобай и др., 2007].

Генетические методы перспективны для определения видовой принадлежности и важны для контроля географического происхождения заготовленной древесины [Degen at et, 2007]. Для идентификации древесины хвойных растений используются разные типы ДНК-маркеров: STS (Sequence Tagged Site) [Paglia, Olivieri, Morgante, 1998] и PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism) [Князева, Хантемирова, 2020], ISSR-(Inter Simple Sequence Repeats) [Arcade et al., 2000], однако наиболее используемыми являются SSR-(Simple Sequence Repeats) [Vendramin, Hansen, 2005]. Наиболее перспективный инструмент для генетического контроля географического происхождения древесины -применение ДНК-маркирования лесообразующих древесных растений [Сбоева и др., 2020]. ISSR-маркеры позволяют провести оценку уровня внутрипопуляционного и межпопуляционного генетического разнообразия, а также определить степень дивергенции популяций [Шейкина и др., 2020], что важно для определения географического происхождения древесины.

Предлагаемый способ молекулярно-генетической паспортизации древесины ели сибирской на популяционном уровне представляет собой аналитический инструмент, в котором используются идентификационные генетические маркеры ели сибирской, выявляемые в определенных популяциях в естественных насаждениях. При сравнении этих маркеров с молекулярными идентификационными маркерами, полученными после молекулярно-генетического анализа с пробами ДНК, выделенными из древесины неизвестного происхождения, можно установить природную популяцию, в которой ранее произрастали срубленные деревья; а также выявить, соответствует ли место заготовки древесины тому, что указано в документах. Таким образом, можно определить географическое происхождение древесины и установить легальность ее заготовки.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому решению, взятым за прототип, является способ, описанный в патенте РФ на изобретение «Способ молекулярно-генетической идентификации неизвестного образца древесины хвойных растений» (Патент РФ №2760522, МПК А01Н 1/00, опубл. 26.11.2021 в Бюл. №33. 13 с.).

Изложенное в прототипе изобретение относится к способу молекулярно-генетической идентификации неизвестных образцов древесины Larix sibirica Ledeb. и Pinus sylvestris L., который включает в себя: сбор неизвестных образцов древесины; выделение из них проб ДНК; проведение ISSR(Inter Simple Sequence Repeats)-анализа полиморфизма ДНК с использованием ПЦР; отбор наиболее генетически гетерогенных тестируемых проб ДНК; определение (секвенирование) нуклеотидных последовательностей от одного до трех полиморфных локусов у каждого тестируемого вида хвойных растений в регионе исследований; выявление у тестируемых образцов древесины фрагментов ДНК, характерных для рода (родовых), для вида (видовых) и сочетаний полиморфных популяционных ISSR-PCR, а у некоторых популяций и SNP-маркеров; сопоставление (определение тождества) выявленных фрагментов ДНК с установленными ранее идентификационными фрагментами ДНК для природных популяций тестируемых видов в регионе исследований. Изобретение позволяет эффективно идентифицировать неизвестные образцы древесины у Larix sibirica Ledeb. и Pinus sylvestris L. и установить соответствие или его отсутствие фрагментов ДНК срубленных деревьев идентификационным фрагментам ДНК деревьев, произрастающих в природной популяции вида в регионе исследований.

Недостатки прототипа:

1) В прототипе используются другие виды хвойных растений: лиственница сибирская (Larix sibirica Ledeb.) и сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.).

2) В прототипе выявлены эффективные ISSR-праймеры для сосны обыкновенной и лиственницы сибирской, а не для ели сибирской.

3) Не указаны частоты встречаемости идентификационных фрагментов ДНК древесины в популяции.

4) В прототипе предложен полный молекулярно-генетический паспорт популяции, а не краткий генетический паспорт древесины в месте заготовки.

Раскрытие сущности изобретения

Изобретение позволяет записать в молекулярно-генетическом паспорте древесины популяции ели сибирской идентификационные фрагменты ДНК в виде молекулярно-генетической формулы древесины популяции с указанием частот идентификационных фрагментов, определенных при использовании в качестве растительного материала древесины, образцы которой собраны в местах заготовки, что актуально для определения географического происхождения древесины при борьбе с незаконными вырубками леса.

Средства и методы для осуществления заявленного способа

Способ молекулярно-генетической паспортизации древесины популяций ели сибирской для определения ее географического происхождения, включает в себя 6 стадий:

1 стадия - сбор образцов древесины.

Методы стадии 1. Сбор образцов древесины (кернов) у деревьев производится в регионе исследований в местах заготовки древесины (в популяции) испытуемого вида хвойных растений (Picea obovata Ledeb., сем. Pinaceae), в местах складирования после транспортировки в любое время года. В популяциях хвойных растений образцы древесины собираются с не менее, чем 50 деревьев, в идеальном случае, при этом указывается популяция, из которой взяты образцы; далее образцы помещаются в стерильные пакеты и нумеруются по порядку арабскими цифрами. Осуществление способа в случае острой необходимости возможно и на меньшем числе образцов древесины.

Средства стадии 1. возрастной бурав стерильные бумажные пакеты по числу образцов древесины; пинцеты; 70% спирт для стерилизации инструментов; перчатки; маркер для нумерации пакетов; сумка для хранения образцов древесины.

2 стадия - характеристика популяции ели сибирской с мест заготовки древесины: указание координат места сбора образцов древесины, лесничества; указание мест складирования.

Методы стадии 2. При сборе материала определялась видовая принадлежность деревьев по морфологическим признакам. Во время сбора образцов древесины необходимо зафиксировать координаты места сбора для дальнейшей идентификации географического происхождения древесины, Кроме этого, необходимо указать лесничество, находящееся на данной территории для сверки данных о заготовке древесины. При наличии постоянных мест складирования указать их координаты.

Средства стадии 2. GPS навигатор; план лесничества.

3 стадия - выделение проб ДНК из образцов древесины.

Методы стадии 3. Выделение тотальной ДНК по методике с использованием СТАВ (Cetyl Trimethyammonium Bromide) и PVPP (Polyvinylpolypyrrolidone), в которой оптимизирован процесс осаждения ДНК путем добавления трехмолярного ацетата натрия на этапе осаждения ДНК изопропанолом и инкубированием при -20°С в течении 30 минут.Измерение концентрации выделенной тотальной ДНК и разведение каждой пробы ДНК до концентрации 10 нг/мкл в ТЕ (Tris-EDTA)-буфере.

Средства стадии 3. вортекс-микроцентрифуга FVL-2400 BioSan; твердотельный термостат Т-48 Биоком; спектрофотометр Spectrofotometr™ NanoDrop 2000 («Thermo scientific)), USA), термостат «Binder)); холодильник Hotpoint-Ariston HBM 1201.4.

4 стадия - проведение ISSR (Inter Simple Sequence Кереа18)-анализа полиморфизма ДНК с использованием ПЦР (полимеразной цепной реакции) с пробами ДНК древесины ели сибирской.

Методы стадии 4: ПЦР-анализ проб тотальной ДНК из образцов древесины проводится индивидуально с использованием 4 эффективных ранее установленных для ели сибирской ISSR-праймеров ((AC)₈CG; (CT)₈TG; (CA)₆GT; (AGC)₆G)); проведение электрофореза в агарозном геле; фотографирование гелей; повтор ПЦР.

Средства стадии 4: термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот MyCycler (Bio-Rad); камеры для горизонтального электрофореза для анализа большого количества образцов Sub-Cell 192; бокс для ПЦР работ BioSan UV-Cleaner box-1200 (UVT-S-AR); набор микродозаторов с изменяемым объемом дозирования Pipetman (Gilson), система гель-документации Gel Doc XR (Bio-Rad); камеры для горизонтального электрофореза для анализа большого количества образцов Sub-Cell 192, маркер молекулярной массы (100 bp+1.5+3 Кb DNA Ladder; ООО «СибЭнзим-М», Москва).

5 стадия - установление видовых и популяционных фрагментов ДНК ели сибирской, выявленных в ходе ПЦР-анализа; составление молекулярно-генетических формул для использования в стадии 6.

Методы стадии 5: выявление в ISSR-спектрах, полученных при молекулярно-генетическом анализе тестируемых проб ДНК из образцов древесины, характерных сочетаний видовых фрагментов ДНК (видовых идентификационных фрагментов) и популяционных фрагментов ДНК (идентификационных ISSR-PCR фрагментов популяции). Для составления молекулярно-генетической формулы популяции ели сибирской необходимо выписать в первую очередь видовые, а затем фрагменты ДНК или их сочетания для идентификации популяций.

Средства стадии 5: программа Quantity One («Bio-Rad», USA) системы re ль-документации Gel Doc XR (Bio-Rad); персональный компьютер.

6 стадия - составление краткой формы молекулярно-генетического паспорта древесины популяций ели сибирской, которая содержит только лишь идентификационные фрагменты ДНК с указанием их частоты, представленные в виде формул, необходимые для определения географического происхождения древесины.

Методы стадии 6: Для составления молекулярно-генетического паспорта древесина популяции необходимо внести в паспорт популяции молекулярно-генетические формулы, определенные ранее эффективные ISSR-праймеры ((AC)₈CG; (CT)₈TG; (CA)₆GT; (AGC)₆G)), определить диапазон размеров аллелей (в парах нуклеотидов) и число аллелей для данного вида, число аллелей в выборке, а также записать идентификационные (видовые и популяционные) фрагменты ДНК (ISSR-маркеры) и определить частота встречаемости фрагмента ДНК в популяции. Данные представлены в краткой форме паспорта древесины (фиг. 1).

Фиг. 1 - Молекулярно-генетический паспорт древесины популяции Po_Gn (Picea obovata Ledeb., сем. Pinaceae) из Гаинского лесничества, расположенного в Гаинском районе Пермского края

Средства стадии 6: установленные на стадии 5 идентификационные (видовые и популяционные) фрагменты ДНК и молекулярно-генетические формулы, характерные для древесины популяций ели сибирской в регионе исследований; программы Quantity One («Bio-Rad», USA) системы гель-документации Gel Doc XR (Bio-Rad); персональный компьютер.

Осуществление изобретения

Осуществление изобретения до состояния, в котором его функциональность может быть проверена, заключается в выполнении всех 6 стадий способа молекулярно-генетической паспортизации популяций ели сибирской для определения географического происхождения древесины.

Пример 1. Использование способа молекулярно-генетической паспортизации популяции Ро_Br (Picea obovata Ledeb., сем. Pinaceae) для определения географического происхождения древесины в регионе исследований.

На 1 стадии в летний период (июнь 2022 года) собраны образцы древесины (керны) из Березниковского лесничества, расположенного в Усольском районе Пермского края, расстояние между деревьями составляло около 100-150 м. В выборке были взяты образцы с 31 разного дерева, далее образцы были помещены индивидуально в стерильные пакеты и пронумерованы по порядку арабскими цифрами. При сборе образцов древесины на 2 стадии были зафиксированы координаты места сбора материала, а также определено лесничество (Березниковское), на территории которого произрастает данная популяция. На 3 стадии из каждого образца древесины (31 образец) индивидуально выделены пробы тотальной ДНК по методике для выделения ДНК из древесины. Проведено измерение концентрации каждой выделенной пробы ДНК и ее разведение до концентрации 10 нг/мкл в ТЕ (Tris-EDTA)-буфере. На 4 стадии пробы ДНК из образцов древесины популяции Ро_Br амплифицированы в ПЦР с 4 эффективными ISSR-праймерами ((AC)₈CG; (CT)₈TG; (CA)₆GT; (AGC)₆G)) для древесины P. obovata; проведены электрофорезы в агарозных гелях и их фотографирование. На 5 стадии из 31 пробы ДНК выборки популяции Ро_Br произведен отбор характерных сочетаний видовых фрагментов ДНК (видовых идентификационных фрагментов) и популяционных фрагментов ДНК на основании результатов ПЦР-анализа, проведенного на 4 стадии; представлены в виде молекулярно-генетической формулы. На 6 стадии были обобщены данные, полученные на стадии 1 и стадии 5 в формате молекулярно-генетического паспорта древесины популяции Ро_Br (Picea obovata Ledeb., сем. Pinaceae) из Березниковского лесничества, расположенном в Усольском районе Пермского края.

Таким образом, был составлен молекулярно-генетический паспорт древесины популяции Ро_Br (Picea obovata Ledeb., сем. Pinaceae) из Березниковского лесничества, расположенном в Усольском районе Пермского края (фиг. 2), на основании результатов ПЦР с пробами ДНК, выделенными из древесины с 4 эффективными ISSR-праймерами. В дальнейшем, по данному паспорту можно идентифицировать происхождение древесины из данного места заготовки древесины или популяции.

Пример 2. Использование способа молекулярно-генетической паспортизации популяции Ро_Kr (Picea obovata Ledeb., сем. Pinaceae) для определения географического происхождения древесины в регионе исследований.

На 1 стадии в летний период (июль 2022 года) собраны образцы древесины (керны) из Красновишерского лесничества, расположенного в Красновишерском районе Пермского края, расстояние между деревьями составляло около 100-150 м. В выборке были взяты образцы с 31 разного дерева, далее образцы были помещены индивидуально в стерильные пакеты и пронумерованы по порядку арабскими цифрами. При сборе образцов древесины на 2 стадии были зафиксированы координаты места сбора материала, а также определено лесничество (Красновишерское), на территории которого произрастает популяция Ро_Kr. На 3 стадии из каждого образца древесины (31 образец) индивидуально выделены пробы тотальной ДНК по методике для выделения ДНК из древесины. Проведено измерение концентрации каждой выделенной пробы ДНК и ее разведение до концентрации 10 нг/мкл в ТЕ (Tris-EDTA)-буфере. На 4 стадии пробы ДНК из образцов древесины популяции Ро_Kr амплифицированы в ПЦР с 4 эффективными ISSR-праймерами ((AC)₈CG; (CT)₈TG; (CA)₆GT; (AGC)₆G)) для древесины ели сибирской; проведены электрофорезы в агарозных гелях и их фотографирование. На 5 стадии из 31 пробы ДНК выборки популяции Ро_Kr произведен отбор характерных сочетаний видовых фрагментов ДНК (видовых идентификационных фрагментов) и популяционных фрагментов ДНК на основании результатов ПЦР-анализа, проведенного на 4 стадии; представлены в виде молекулярно-генетической формулы. На 6 стадии были обобщены данные, полученные на стадии 1 и стадии 5 в формате молекулярно-генетического паспорта популяции Ро_Kr (Picea obovata Ledeb., сем. Pinaceae) из Красновишерского лесничества, расположенного в Красновишерском районе Пермского края.

Таким образом, был составлен молекулярно-генетический паспорт древесины популяции Ро_Kr (Picea obovata Ledeb., сем. Pinaceae) из Красновишерского лесничества, расположенном в Красновишерском районе Пермского края (фиг. 3), на основании результатов ПЦР с пробами ДНК, выделенными из древесины с 4 эффективными ISSR-праймерами. В дальнейшем по данному паспорту можно идентифицировать происхождение древесины из данного региона исследований.

Заявка на изобретение является результатом работ, выполненных в рамках научного проекта Международной исследовательской группы № С-27/776 от 31 марта 2022 г при финансовой поддержке Правительства Пермского края.

Литература.

1. Птичников А.В., Курицын А.С., Мартынюк 3., Куракин Р. Системы отслеживания происхождения древесины в России: опыт лесопромышленных компаний и органов управления лесами // Аналитический отчет. М.: WWF России. - 2011. - 116 с.

2. Забавила А.Ю. Применение спутниковых навигационных систем при осуществлении наблюдения как одного из видов оперативно-разыскных мероприятий // Актуальные вопросы права, образования и психологии. - 2015. - С. 141-149.

3. Тараканов В.В., Паленова М.М., Паркина О.В., Роговцев Р.В., Третьякова Р.А. Лесная селекция в России: достижения, проблемы, приоритеты (обзор) // Лесохозяйственная информация. - 2021. - №. 1. - С. 100-143.

4. Хох А.Н. Особенности идентификации "схожих" древесных пород с помощью хемометрических алгоритмов // Вопросы криминологии, криминалистики и судебной экспертизы. - 2020. - №2(48). - С. 64-72.

5. Хох А.Н. Идентификация места произрастания срубленной древесины: Проблемы и перспективы // Legea si Viata. - 2021. - С. 205-210.

6. Тарасов М.Е. Отслеживание происхождения древесины, поставляемой "Метсялиитто" // Устойчивое лесопользование. - 2006. - №. 2. - С. 9-12.

7. Котлобай А.А., Лопина О.Д., Харченков Ю., Брюханов А.В., Щеголев А., Смирнов Д. Оценка объемов древесины сомнительного происхождения и анализ практики внедрения систем отслеживания происхождения древесины в ряде многолесных регионов северо-запада, Сибири и Дальнего Востока России // Устойчивое лесопользование. - 2007. - №1. - С. 47-48.

8. Degen В., Fladung М. Use of DNA-markers for tracing illegal logging // Proceedings of the international workshop «Fingerprinting methods for the identification of timber origins)). - 2007. - P. 8-9.

9. Paglia G. P., Olivieri A. M., Morgante M. Towards second-generation STS (sequence-tagged sites) linkage maps in conifers: a genetic map of Norway spruce (Picea abies K.) // Molecular and General Genetics MGG. - 1998. - T. 258. - P. 466-478.

10. Князева С.Г., Хантемирова Е.В. Сравнительный анализ генетической и морфолого-анатомической изменчивости можжевельника обыкновенного (Juniperus communis L.) // Генетика. - 2020. - Т. 56. - №1. - С. 55-66.

11. Arcade A., Anselin F., Faivre Rampant P., Lesage M. C, Paques L. E. & Prat D. Application of AFLP, RAPD and ISSR markers to genetic mapping of European and Japanese larch // Theoretical and Applied Genetics. - 2000. - T. 100. - P. 299-307.

12. Vendramin G. G., Hansen О. K. Molecular markers for characterizing diversity in forest trees // Conservation and management of forest genetic resources in Europe. Arbora Publishers. - 2005. - P. 337-368.

13. Шейкина О.В. Применение молекулярных маркеров в лесном селекционном семеноводстве в России: опыт и перспективы (обзор) // Вестник Поволжского государственного технологического университета. Серия: Лес. Экология. Природопользование. - 2022. - №2. - С. 64-79.

14. Сбоева Я.В., Васильева Ю.С., Чертов Н.В., Пыстогова Н.А., Боронникова С.В. Молекулярно-генетическая идентификация популяций сосны обыкновенной и лиственницы сибирской в Пермском крае на основании полиморфизма ISSR-маркеров // Сибирский лесной журнал. - 2020. - №4. - С. 35-44.

15. Шейкина О.В., Гладков Ю.Ф. Генетическое разнообразие и дифференциация ценопопуляций сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), сформированных в болотных и суходольных экотопах // Вестник Томского государственного университета. Биология. - 2020. - №50. - С. 101-118.

16. Способ молекулярно-генетической идентификации неизвестного образца древесины хвойных растений. Боронникова С.В., Васильева Ю.С, Сбоева Я.В., Чертов Н.В., Пыстогова Н.А., Патент РФ №2760522, МПК А01Н 1/00, опубл. 26.11.2021 в Бюл. №33. 13 с.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу молекулярно-генетической паспортизации древесины популяций ели сибирской Picea obovata Ledeb., сем. Pinaceae. Изобретение позволяет эффективно проводить паспортизацию древесины популяций ели сибирской Picea obovata Ledeb., сем. Pinaceae. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

1. Способ молекулярно-генетической паспортизации древесины популяций ели сибирской Picea obovata Ledeb., сем. Pinaceae, который включает в себя:

- сбор образцов древесины в местах произрастания и заготовки древесины ели сибирской с указанием названия лесничества;

- выделение из собранных образцов древесины проб ДНК;

- проведение ISSR-анализа полиморфизма ДНК методом ПЦР с использованием 4 эффективных праймеров: (AC)8CG, (CT)8TG, (CA)6GT, (AGC)6G;

- выявление характерных для вида и для популяции ели сибирской Picea obovata Ledeb., сем. Pinaceae, сочетаний идентификационных фрагментов ДНК;

- представление полученных данных в виде молекулярно-генетических паспортов древесины ели сибирской Picea obovata Ledeb., сем. Pinaceae, с указанием мест заготовки и идентифицированных фрагментов ДНК.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в молекулярно-генетическом паспорте древесины указываются частоты встречаемости идентификационных фрагментов ДНК.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что молекулярно-генетический паспорт древесины для мест ее заготовки содержит только информацию об идентификационных фрагментах ДНК древесины, представленных в виде формулы.