Способ генетической паспортизации сортов розы эфиромасличной с использованием ISSR-маркеров Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 A01H1/00 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, а именно к способу генетической паспортизации сортов розы эфиромасличной с использованием ISSR-маркеров. Изобретение позволяет эффективно идентифицировать сорта розы эфиромасличной, составлять уникальные генетические формулы сортов и может быть использовано в селекции эфиромасличных культур.

Одним из главных приоритетов отечественного культивирования розы эфиромасличной является выведение сортов, близких по свойствам к болгарским сортам, являющимся мировым эталоном качества. Генетическая идентификация сортов занимает важное место среди селекционных исследований в розоводстве. Сведения о генотипе ценных сортов используются не только в научных целях, но и имеют практическое значение. В частности, на их основании составляются генетические паспорта сортов, используемые для селекции, а также для защиты прав селекционеров.

В настоящий момент пять сортов розы эфиромасличной коллекции ФГБУН «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма» (Золушка, Лада, Лань, Легрина и Радуга) включены в «Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию» (далее - Госреестр). Нормативным документом для проведения сортоиспытания роз с целью внесения в Госреестр, в котором описаны все признаки, характерные для данного рода или вида, является «Методика проведения испытаний на отличимость, однородность и стабильность. Роза (Rosa L.)» Государственной комиссии по испытанию и охране селекционных достижений (RTG/0011/2 от 01.02.2007 г. № 12-06/02 https://gossortrf.ru/metodiki-ispytaniy-na-oos-2/). Однако современные научные достижения позволяют расширить перечень методов для идентификации сортов и сделать ее более точной. В связи с этим, генетический паспорт является надежным дополнением к результатам сортоиспытания по стандартным методикам, что подчеркивает актуальность проведения ДНК-паспортизации.

В основе создания генетического паспорта лежит анализ полиморфизма ДНК с помощью ДНК-маркеров. Наиболее распространенным методом анализа генетического разнообразия является полимеразная цепная реакция и основанные на ней аналитические подходы. Среди них популярен благодаря своей простоте и доступности анализ межмикросателлитных последовательностей - ISSR-анализ.

В связи с отсутствием способов паспортизации Rosa L. были изучены методики по другим культурам. Известен «Способ генетической паспортизации селекционных достижений малины на основе RAPD-маркеров» (Патент RU 2671678 C2; МПК C12Q 1/68; опубл. 06.11.2018 г., бюл. № 31). Недостатком данного способа является отсутствие конкретной формы самого генетического паспорта, поскольку даны сведения только по используемым RAPD-праймерам и полученным с их помощью спектрам, которые представлены на электрофореграмме.

Наиболее близким аналогом изобретения является методика изучения генотипов сортов сирени белорусской селекции с помощью RAPD- и ISSR-анализа (Спиридович Е.В., Молканова О.И., Коротков О.И., Власова А.Б., Юхимук А.Н., Решетников В.Н. Молекулярно-генетические методы в сохранении и изучении генофонда ботанических коллекций: материалы Международной конференции, посвященной 80-летию Центрального ботанического сада Национальной академии наук Беларуси, Минск, 19-22 июня 2012 г. - Минск: ГНУ «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси», 2012. - С. 463-467). В этом способе проводится оценка генетического разнообразия сортов сирени и составлены генетические паспорта сортов на основании выявленных RAPD- и ISSR-маркеров по схеме: отбор образцов сирени; выделение ДНК из листьев, проведение RAPD- и ISSR-ПЦР; разделение продуктов ПЦР методом горизонтального электрофореза в агарозном геле; анализ результатов электрофореза с помощью программного обеспечения; кластеризация образцов с построением RAPD+ISSR дендрограммы, отражающей степень генетического сходства между сортами; составление генетических паспортов с указанием всех маркеров, полученных с помощью конкретных праймеров.

Однако, предлагаемый в известном способе набор праймеров предназначен для паспортизации сортов сирени и может быть неэффективным для использования при паспортизации сортов розы эфиромасличной. К недостаткам способа можно отнести использование RAPD-праймеров, имеющих такой существенный недостаток как низкая температура отжига, приводящая к образованию неспецифичных продуктов, которые могут быть ошибочно приняты за целевой фрагмент. При этом используется всего два ISSR-праймера, что не является достаточным для оценки генетического разнообразия и составления генетического паспорта. Также к недостаткам способа можно отнести использование при выделении ДНК меркаптоэтанола - токсичного вещества с неприятным запахом. Кроме того, в буфер для экстракции добавляется 1% поливинилпирролидона, однако для розы эфиромасличной предпочтительной является концентрация ПВП 2% в виду более высокого содержания загрязняющих веществ в ароматических растениях. Недостатком, хотя и не существенным, в структуре паспорта является отсутствие указания уникальных локусов, присутствующих только в конкретном сорте.

Задачей изобретения является разработка способа генетической паспортизации сортов розы эфиромасличной с использованием эффективных ISSR-праймеров, а также оптимизация протокола выделения ДНК для наиболее эффективной работы с материалом розы эфиромасличной.

Поставленная задача решается способом генетической паспортизации сортов розы эфиромасличной с использованием ISSR-маркеров, включающим отбор материала, выделение ДНК, ПЦР-амплификацию с отобранными праймерами, визуализацию результатов ПЦР методом горизонтального электрофореза, статистическую обработку полученных фрагментов, кластеризацию образцов с построением дендрограммы, отражающей их генетическую близость, а также составление генетического паспорта сорта, в котором согласно изобретению амплификацию ДНК проводят с последовательным участием восьми ISSR-праймеров, имеющих индивидуальную температуру отжига. При этом выделение ДНК проводят по модифицированному СТАВ-протоколу с использованием стеблей вместо листьев, двукратной промывкой смесью хлороформ/изоамиловый спирт и добавлением 2% поливинилпирролидона в СТАВ-буфер для экстракции. Генетический паспорт представляет собой совокупность генетических формул сорта, полученных при помощи используемых праймеров и содержащих уникальные полиморфные фрагменты, характерные только для данного сорта.

Преимущества способа определяются решением вышеописанной задачи изобретения.

В заявляемом способе используют исключительно ISSR-праймеры с индивидуально подобранной оптимальной температурой отжига. Увеличение количества применяемых ISSR-праймеров позволяет выявить большее количество уникальных полиморфных локусов, характерных только для данного сорта. Благодаря этому определяется уникальная ISSR-формула, описывающая данный сорт, на основании которой составляется генетический паспорт.

ДНК выделяют из стеблей, а не из листьев, поскольку в листьях эфиромасличных растений содержится большее количество эфирных масел, затрудняющих получение чистой ДНК. При выделении ДНК не используют токсичное вещество меркаптоэтанол, применяемое для очистки от белков, полифенолов и других органических ингибиторов, вместо этого применяют двукратную промывку смесью хлороформ/изоамиловый спирт для лучшей очистки от белков и липидов, а в СТАВ-буфер добавляют 2% ПВП, осаждающий полифенолы.

Способ осуществляют по следующей схеме:

1) Отбор образцов изучаемых сортов.

2) Выделение ДНК любым известным способом.

3) ПЦР-амплификация с восемью отобранными ISSR-праймерами (таблица 1) по известной методике.

Таблица 1 - Характеристика ISSR-праймеров для анализа сортов розы эфиромасличной Праймер Нуклеотидная последовательность праймера (5'→3') Температура отжига, °C ISSR-А34 AGCAGCAGCAGCY 52,0 ISSR-В10 CAGCAGCAGCAGCAG 52,4 ISSR-В13 CAACAACAACAACAA 41,9 ISSR-230/41 AGAGAGAGAGAGAGAGC 58,0 ISSR-807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 52,6 ISSR-812 GAGAGAGAGAGAGAGAA 52,4 ISSR-834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT 56,2 ISSR-840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 48,9

4) Визуализация результатов ПЦР методом горизонтального электрофореза по стандартной методике.

5) Статистическая обработка полученных фрагментов с использованием известного программного обеспечения, кластеризация сортов общепринятым методом по генетической близости и выявление уникальных полиморфных локусов, на основании которых составляется генетический паспорт сорта, представляющий собой совокупность генетических формул сорта, полученных при помощи используемых праймеров и содержащих уникальные маркеры.

Пример осуществления способа

Отбор материала для исследований

Отбирали образцы 10 сортов розы эфиромасличной, произрастающих в полевых условиях: Аура, Белая, Искра, Казанлыкская, Свежен, Золушка, Лада, Лань, Легрина и Радуга (таблица 2).

Таблица 2 - Образцы коллекции розы эфиромасличной, использованные в исследованиях Образец Биологический статус Образцы из Болгарии Белая сорт (Rosa alba L.) Искра сорт (R. damascena Mill.) Казанлыкская сорт (R. damascena Mill.) Свежен сорт (R. damascena Mill.) Образцы «НИИСХ Крыма» Аура сорт (R. damascena Mill. × R. gallica L.) Золушка сорт (Весна (R. damascena Mill. × R. gallica subsp. eryosyla Kell. var. austriaca Grantz f. panonica Br.) × Крымская красная (R. galica L.)) Лада сорт (Белая (R. alba L.) × Мичуринка (R. damascena Mill.) × R. gallica L.) Лань сорт (Белая (R. alba L.) × Мичуринка (R. damascena Mill.) × R. gallica L.) Легрина сорт (Белая (R. alba L.) × Мичуринка (R. damascena Mill.) × R. gallica L.) Радуга сорт (Весна (R. damascena Mill. × R. gallica subsp. eryosyla Kell. var. austriaca Grantz f. panonica Br.) × Крымская красная (R. gallica L.))

Выделение ДНК

ДНК выделяли модифицированным СТАВ-методом: в качестве материала использовали не листья, а стебли, добавляли в стандартный СТАВ-буфер 2% поливинилпирролидона (ПВП) и проводили двукратную промывку смесью хлороформ/изоамиловый спирт.

100 мг ткани измельчали в ступке с 800 мкл СТАВ-буфера, переносили в пробирки и термостатировали при 65°С 1 час, перемешивая каждые 15 мин. Добавляли равное количество смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), смешивали интенсивным встряхиванием вручную до получения однородной суспензии и центрифугировали 10 мин при 14000g и 4°С. Отбирали верхнюю фазу в новые пробирки и повторяли предыдущий шаг. Переносили верхнюю фазу в новые пробирки, добавляли равный объем охлажденного при -20°С изопропанола и смешивали аккуратным переворачиванием. Оставляли на 30 мин при -20°С и центрифугировали при 1400 g и 4°С в течение 10 мин. Удаляли супернатант, промокали края и крышки пробирок салфеткой. Добавляли 70% этанол, охлажденный при -20°С, в объеме, равном объему изопропанола. Смешивали и центрифугировали 10 мин при 14000g и 4°С. Сливали супернатант, осаждали на вортексе и отбирали остатки спирта наконечником. Высушивали в термостате при 65°С с открытой крышкой в течение 5 мин. Добавляли 100 мкл буфера ТЕ, термостатировали при 65°С 10 мин и встряхивали на вортексе до растворения осадка. Полученный экстракт ДНК хранили при -20°С. Количество и качество выделенной ДНК определяли методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле и на спектрофотометре SPECTROstar Nano («BMG LABTECH», Германия).

ПЦР-амплификация

ПЦР-смесь объемом 20 мкл имела следующий состав: 13,5 мкл деионизированной воды, 2 мкл 1-кратного буфера, 0,4 мкл дНТФ (10 ммоль), 2 мкл праймера (10 пмоль), 0,1 мкл Hot Start Taq ДНК-полимеразы (1000 единиц активности, «Qiagen», Германия) и 2 мкл ДНК (10 нг/мкл). Амплификация проводилась в термоциклере Т-100 («BIORAD», США по следующей программе (таблица 3).

Таблица 3 - Программа ПЦР с ISSR-праймерами для образцов розы эфиромасличной Этап Время Температура, °С Количество циклов Начальная активация
Hot Start Taq
ДНК-полимеразы 15 мин 95 1 Денатурация 30 сек 94 35 Отжиг 30 сек установленная для каждого праймера Элонгация 1 мин 72 Финальная элонгация 10 мин 72 1 Хранение ∞ 4 -

Визуализация результатов ПЦР методом горизонтального электрофореза.

Разделение и визуализацию продуктов ПЦР проводили в 2%-агарозном геле с ТАЕ-буфером и бромистым этидием.

Статистическая обработка результатов, оценка генетической близости сортов и составление генетических паспортов.

По результатам детекции продуктов ISSR-ПЦР присутствие фрагмента обозначали 1, а отсутствие - 0. На фиг 1. изображена электрофореграмма ISSR-спектров десяти сортов розы эфиромасличной, полученных при помощи одного из праймеров ISSR-840 (М - маркер длины ДНК, 14 - вид R. canina L., 15 - Аура, 16 - Белая, 17 - вид R. indica Major, 18 - Искра, 19 - Казанлыкская, 20 - Свежен, 21 - Золушка, 22 - Лада, 23 - Лань, 24 - Легрина, 25 - Радуга, 26 - отрицательный контроль). Виды R. canina L. и R. indica Major добавлены для иллюстрации генетических сходств при кластеризации).

На основании этих данных проводили кластеризацию образцов и оценивали генетическое родство отечественных сортов розы эфиромасличной к болгарским. Установлено, что сорт Золушка генетически близок к болгарским сортам.

Для исследуемых сортов розы эфиромасличной Золушка, Лань, Лада, Легрина и Радуга, включенных в «Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию», были составлены генетические формулы, представляющие собой все амплифицируемые фрагменты (локусы), выявленные при помощи каждого праймера, представленного в таблице 1.

В генетический паспорт включены только те формулы, которые содержат уникальные полиморфные фрагменты, характерные только для данного сорта.

В таблицах 4-8 приведены генетические паспорта исследуемых сортов розы эфиромасличной с указанием уникальных фрагментов (маркеров).

Таблица 4 - Генетический паспорт розы эфиромасличной сорта Золушка коллекции ФГБУН «НИИСХ Крыма» ISSR-230/41₃₁₈ ISSR-230/41₃₈₀ ISSR-230/41₄₃₃ ISSR-230/41₅₁₀ ISSR-807₂₆₀ ISSR-807₃₆₉ ISSR-807₄₆₂ ISSR-807₅₅₃ ISSR-807₆₆₆ ISSR-812₃₄₀ ISSR-812₅₀₈ ISSR-834₃₄₃ ISSR-834₆₁₆ ISSR-834₇₆₂ ISSR-834₁₀₀₈ ISSR-834₁₂₄₈ ISSR-840₂₇₅ ISSR-840₃₈₀ ISSR-840₄₁₀ ISSR-840₅₄₁ ISSR-840₅₉₄ ISSR-840₉₂₈ ISSR-В10₂₇₂ ISSR-В10₃₈₀ ISSR-В10₄₅₅ ISSR-В10₄₉₂ ISSR-В10₅₇₄ ISSR-В10₉₄₆ ISSR-В13₃₀₇ ISSR-В13₄₃₆ ISSR-В13₅₇₉ ISSR-В13₆₉₉ ISSR-В13₈₂₁ ISSR-В13₁₂₂₂ ISSR-34₃₈₄ ISSR-34₄₃₆ ISSR-34₆₁₈

Таблица 5 - Генетический паспорт розы эфиромасличной сорта Лада коллекции ФГБУН «НИИСХ Крыма» ISSR-230/41₄₂₁ ISSR-230/41₄₅₆ ISSR-230/41₅₃₁ ISSR-230/41₇₉₃ ISSR-812₃₁₆ ISSR-812₅₁₇ ISSR-В10₂₇₂ ISSR-В10₃₀₅ ISSR-В10₄₃₀ ISSR-В10₄₇₈ ISSR-В10₇₅₃ ISSR-В10₈₆₀ ISSR-В13₃₀₇ ISSR-В13₅₅₆ ISSR-В13₈₀₁ ISSR-В13₁₁₉₅

Таблица 6 - Генетический паспорт розы эфиромасличной сорта Лань коллекции ФГБУН «НИИСХ Крыма» ISSR-812₃₅₀ ISSR-812₃₈₀ ISSR-812₄₁₁ ISSR-812₅₁₇ ISSR-812₆₁₈ ISSR-834₂₇₄ ISSR-840₃₁₇ ISSR-834₃₃₇ ISSR-834₉₅₉ ISSR-834₁₀₉₅ ISSR-840₂₇₅ ISSR-840₃₁₅ ISSR-840₄₀₄ ISSR-840₆₁₀ ISSR-В10₂₇₂ ISSR-В10₃₀₅ ISSR-В10₄₃₀ ISSR-В10₄₉₂ ISSR-В10₅₆₃ ISSR-В10₈₆₀ ISSR-В13₃₀₇ ISSR-В13₅₉₀ ISSR-В13₈₆₇ ISSR-34₃₈₉ ISSR-34₄₈₄

Таблица 7 - Генетический паспорт розы эфиромасличной сорта Легрина коллекции ФГБУН «НИИСХ Крыма» ISSR-807₂₆₂ ISSR-807₂₉₂ ISSR-807₃₀₀ ISSR-807₄₇₀ ISSR-840₂₇₅ ISSR-840₃₁₅ ISSR-840₄₀₄ ISSR-840₆₀₂ ISSR-В10₂₇₂ ISSR-В10₄₇₈ ISSR-В10₇₂₉ ISSR-В10₈₃₀

Таблица 8 - Генетический паспорт розы эфиромасличной сорта Радуга коллекции ФГБУН «НИИСХ Крыма» ISSR-230/41₃₆₁ ISSR-230/41₄₀₆ ISSR-230/41₄₈₄ ISSR-230/41₇₅₄ ISSR-807₃₇₈ ISSR-807₄₈₄ ISSR-807₅₆₃ ISSR-812₃₅₀ ISSR-812₄₁₁ ISSR-812₅₀₀ ISSR-834₃₃₇ ISSR-834₅₉₈ ISSR-834₇₄₈ ISSR-834₉₈₄ ISSR-840₂₇₅ ISSR-8402₃₇₂ ISSR-840₄₀₄ ISSR-840₈₈₈ ISSR-В10₂₇₂ ISSR-В10₃₀₅ ISSR-В10₃₇₁ ISSR-В10₄₇₈ ISSR-В10₅₄₈ ISSR-В10₇₄₅ ISSR-В10₈₉₇ ISSR-В13₃₁₁ ISSR-В13₈₇₂ ISSR-34₃₈₄ ISSR-34₄₃₆ ISSR-34₁₀₇₀

Преимуществом данной формы паспорта является возможность визуально оценить уникальные генетические характеристики сорта.

Таким образом, заявляемый способ позволяет проводить генетическую паспортизацию сортов розы эфиромасличной.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="primers.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2023-05-25">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023110455</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-04-24</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023110455</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-04-24</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки &quot;Научно-исследовательский институт

сельского хозяйства Крыма&quot;</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federalnoe gosudarstvennoe byudzhetnoe

uchrezhdenie nauki &quot;Nauchno-issledovatelskii institut selskogo

khozyaistva Kryma&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генетической паспортизации

сортов розы эфиромасличной с использованием

ISSR-маркеров</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>13</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q17">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agcagcagcagcy</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cagcagcagcagcag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q19">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caacaacaacaacaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q21">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agagagagagagagagc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agagagagagagagagt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q22">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagagagagagagagaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q23">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agagagagagagagagyt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q24">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagagagagagagagayt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу генетической паспортизации сортов розы эфиромасличной с использованием ISSR-маркеров. Изобретение позволяет эффективно идентифицировать сорта розы эфиромасличной, составлять уникальные генетические формулы сортов и может быть использовано в селекции эфиромасличных культур. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 3 пр.

1. Способ генетической паспортизации сортов розы эфиромасличной с использованием ISSR-праймеров, включающий отбор материала, выделение ДНК, ПЦР-амплификацию с отобранными праймерами, визуализацию результатов ПЦР методом горизонтального электрофореза, статистическую обработку полученных фрагментов, кластеризацию образцов с построением дендрограммы, отражающей их генетическую близость, составление генетического паспорта сорта, отличающийся тем, что амплификацию ДНК проводят с последовательным участием следующих ISSR-праймеров:

Праймер Нуклеотидная последовательность праймера (5'→3') ISSR-А34 AGCAGCAGCAGCY ISSR-В10 CAGCAGCAGCAGCAG ISSR-В13 CAACAACAACAACAA ISSR-230/41 AGAGAGAGAGAGAGAGC ISSR-807 AGAGAGAGAGAGAGAGT ISSR-812 GAGAGAGAGAGAGAGAA ISSR-834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT ISSR-840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют ISSR-праймеры с индивидуально подобранной оптимальной температурой отжига (°C):

ISSR-А34 52,0

ISSR-В10 52,4

ISSR-В13 41,9

ISSR-230/41 58,0

ISSR-807 52,6

ISSR-812 52,4

ISSR-834 56,2

ISSR-840 48,9.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение ДНК проводят по модифицированному СТАВ-протоколу с использованием стеблей вместо листьев, двукратной промывкой смесью хлороформ/изоамиловый спирт и добавлением 2% поливинилпирролидона в СТАВ-буфер для экстракции.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетический паспорт представляет собой совокупность генетических формул сорта, полученных при помощи используемых праймеров и содержащих уникальные полиморфные фрагменты, характерные только для данного сорта.