СПОСОБ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКИРОВАНИЯ, ОСНОВАННЫЙ НА МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСАХ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОТИПОВ ИВЫ Российский патент 2017 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики растений, в частности к способу молекулярно-генетической идентификации особей ивы на основе генетических маркеров - микросателлитных локусов. Изобретение позволяет осуществлять надежную и достоверную идентификацию генотипов ивы на индивидуальном уровне и может быть использовано для широкого спектра видов рода Salix, являясь, таким образом, универсальным.

Микросателлитные локусы представляют собой участки дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), содержащие простые короткие тандемно повторяющиеся моно-, ди-, три-, тетра- или пентануклеотидные (нуклеотид - элементарная «буква» в генетическом коде организма) мотивы, которые локализованы в геномах большинства видов эукариот. Отсюда их альтернативные названия - локусы с простыми повторами последовательностей (SSR, от английского Simple Sequence Repeat) или короткие тандемные повторы (STR, от английского Short Tandem Repeats). Микросателлитные маркеры наилучшим образом подходят для идентификации и дискриминации (различения) индивидуальных генотипов, поскольку содержат большое число аллелей (у древесных растений до 10-20 и более на локус), и возможность использовать наборы локусов позволяет получать уникальные генетические «портреты» особей с крайне низкой вероятностью случайного повторения (от 10^-4 до <10^-15 в зависимости от числа локусов и аллелей) (Brown et al., In methods of genome analysis in plants, Ed. P.P. Jauhar, N.-Y., London, Tokyo, 1996, P. 147-159).

В качестве экономических преимуществ использования микросателлитных маркеров можно отметить, что их анализ, основанный на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР), не требует высокого количества и качества матричной ДНК (10-100 нг на реакцию). Благодаря использованию специфических длинных ПЦР-праймеров достигается высокая воспроизводимость результатов микросателлитного анализа. При дальнейшем совершенствовании технологии возможно увеличение производительности анализа путем применения мультиплексных реакций (амплификация нескольких локусов с меченными флуоресцентными метками праймерами в одной пробирке) и автоматизации скрининга.

На данный момент нет запатентованных технических решений по идентификации генотипов ивы, однако известно много запатентованных способов молекулярно-генетической идентификации генотипов других видов растений, основанных на микросателлитных маркерах, преимущественно плодово-ягодных и злаковых культур. Значительно меньше внимания уделено способам молекулярно-генетической идентификации лесных древесных видов растений. Так, известна российская заявка на изобретение № RU2012119341 «Способ молекулярно-генетической идентификации популяций древесных видов растений», наиболее близкая к нашему изобретению, в которой предложен способ молекулярно-генетической идентификации популяций древесных видов растений, характеризующийся тем, что в молекулярно-генетическую формулу и штрихкод, помимо идентификационных фрагментов ДНК разного размера (ISSR), амплифицированных в результате ПЦР, вносят и другие структурные изменения геномов, такие как делеции, дупликации, однонуклеотидные замены (SNP - Single Nucleotide Polymorphism), выявленные при сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей после секвенирования геномной ДНК. Однако возможность использования данного способа для идентификации генотипов ивы не оценивалась, а также не оценивалось использование микросателлитных локусов для генетической идентификации особей ивы. Кроме того, способ основан на использовании ISSR- и IRAP-маркеров, относящихся к мультилокусным маркерам, которые, как правило, имеют неизвестную локализацию в хромосоме и используются для молекулярной паспортизации сортов/пород, исследовании генетического разнообразия, а также для филогенетических исследований (Хлесткина, Вавиловский журнал генетики и селекции, 2013, Т. 17, №4, С. 1044-1054). Именно для достижения этих целей данный способ предложен Боронниковой с соавторами. В предложенном нами способе в основу легло использование монолокусных SSR-маркеров, что позволяет осуществлять идентификацию генотипов на индивидуальном уровне и осуществлять отбор элитных генотипов в селекции. Кроме того, нет необходимости в методе секвенирования, что делает наш способ также экономически более выгодным.

Задачей предлагаемого изобретения является обеспечение достоверной и надежной генетической идентификации генотипов ивы на основе применения высокоизменчивых микросателлитных локусов.

Поставленная задача достигается за счет использования набора эффективных и стабильных молекулярных маркеров, позволяющих выявить высокий уровень полиморфизма ДНК и получить четко воспроизводимые результаты.

Схема применения разработанного способа идентификации приведена на фиг. 1. Основным ее функциональным компонентом является набор протестированных пар праймеров для ПЦР-амплификации микросателлитных локусов.

Предлагаемый способ реализуют следующим образом:

1. Производят отбор растительного материала для ДНК-анализа. В качестве материала используют вегетативные ткани листьев или почек.

2. Осуществляют выделение ДНК из растительной ткани по стандартным методам с использованием цетилтриметиламмониумбромида (СТАВ) (Devey et al., Theor. Appl. Genet, 1996, V. 92, P. 673-679, Doyle J.J., Doyle J.L., Focus, 1990, V. 12, P. 12-15).

3. Проводят ПЦР-амплификацию со специфичными праймерами для микросателлитных локусов (табл. 1). Используют 14 пар праймеров и следующие режимы амплификации: для большинства микросателлитных локусов серии SB, а также локуса Sa54B применяют режим ПЦР (табл. 2), включающий предварительную денатурацию ДНК при 94°С в течение 3 мин и 35 циклов, состоящих из 30 с денатурации при 94°С, отжига при 50°С и элонгации 1 мин 30 с при 72°С. Завершающую элонгацию проводят 15 мин при температуре 72°С с последующим охлаждением реакционной смеси до 4°С. Для локуса SB38 режим ПЦР включает предварительную денатурацию ДНК при 94°С в течение 3 мин и 35 циклов, состоящих из 30 с денатурации при 94°С, отжига при 48°С и элонгации 1 мин 30 с при 72°С. Завершающую элонгацию проводят 15 мин при температуре 72°С. Программу завершают охлаждением реакционной смеси до 4°С.

4. Проводят фрагментный анализ ПЦР-продуктов (амплификатов) с помощью электрофореза в вертикальных блоках 6% полиакриламидного геля (ПААГ) в трис-ЭДТА-боратной буферной системе. После электрофореза гели окрашивают в водном растворе бромистого этидия и визуализируют в УФ-свете.

5. Графические изображения гелей (электрофореграммы) перехватывают с помощью фото- или видеосистемы гель-документации, сохраняют на магнитных носителях информации и обрабатывают в графических редакторах. Размер амплифицированных фрагментов определяют с помощью соответствующего программного обеспечения. В качестве стандартного маркера длины используют ДНК плазмиды pBR322 Е. coli, обработанную эндонуклеазой рестрикции HpaII, или аналогичный маркер молекулярного веса для фрагментного анализа в диапазоне 50-300 пар нуклеотидов (п.н.).

6. Проводят составление таблицы многолокусных генотипов по микросателлитным локусам. Длины амплифицированных фрагментов микросателлитных локусов (в парах оснований) заносят в электронную таблицу MS Excel, по два столбца на локус (табл. 3). В случае отсутствия генотипа по какому-либо локусу (пропуск данных) указывают «0».

7. Осуществляют сравнение полученных генотипов с генотипами исходных растений с целью установления идентичности особей (визульно или с помощью свободно распространяемой надстройки для MS Excel - GenAlEx - текущей версии 6.5 или более поздней) (Peakall, Smouse, Mol. Ecol. Notes, 2006, V. 6, P. 288-295; Peakall, Smouse, Bioinformatics, 2012, V. 28, P. 2537-2539).

8. Проводят оценку вероятности встречаемости мультилокусных генотипов и случайного совпадения неродственных или родственных генотипов.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является надежная, статистически достоверная идентификация генотипов ивы, при этом действие изобретения распространяется на все виды ивы, произрастающие на территории РФ, в том числе на наиболее распространенные виды: Salix alba L., S. bebbiana, S. babilonica, S. daphnoides, S. kangensis, S. caspica, S. elegantissima, S. caprea, S.fragilis, S. lanata, S. acutifolia, S. repens, S. viminalis, S. purpurea, S. pentandra, S. rorida, S. aurita, S. tenuifolia, S. Integra, S. udensis, а также на другие виды рода Salix.

Зависимость PI и PIsibs от числа используемых локусов (фиг. 2) наглядно демонстрирует, что практически нулевая вероятность случайного совпадения генотипов достигается уже при использовании первых шести локусов. Использование всех 14 локусов намного перекрывает заявленную достоверность и статистическую значимость анализа. Максимально возможная вероятность совпадения генотипов равна 1,3⋅10^-5 (примерно одно совпадение на 75000 сравнений).

Предлагаемое изобретение является промышленно применимым и может быть использовано для идентификации генотипов ивы с целью создания быстрорастущих и высокопродуктивных ивовых плантаций на основе элитных генотипов.

Примеры электрофореграмм, демонстрирующих полиморфизм длин амплифицированных фрагментов микросателлитных локусов, приведены на фиг. 3, 4.

Изобретение иллюстрируют следующие таблицы.

Таблица 1. Микросателлитные локусы ивы и их характеристики.

Таблица 2. Режимы ПЦР микросателлитных локусов ивы.

Таблица 3. Пример формата.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Схема применения способа молекулярного маркирования для идентификации генотипов ивы.

Фиг. 2. Зависимость вероятности случайного совпадения генотипов от числа используемых микросателлитных локусов.

Фиг. 3. Электрофореграмма локуса SB880 тестируемых элитных генотипов ивы. Генотип: 1 - Sir1 (184/151); 2 - Slu (184/166); 3 - S2u (184/151); 4- S5u (166/166); 5- S6u (166/166); 6 - S7u (160/151); 7 - маркер длин фрагментов ДНК; 8 - S11u (166/151); 9 - S12u (160/15 1); 10 - Sh5 (184/166); 11 - Sh6 (166/166); 12 - S9 (199/166); 13 - S14 (184/166); 14 - Scl (184/169).

Фиг. 4. Электрофореграмма локуса SB904 тестируемых элитных генотипов ивы. Генотип: 1 - Sfrl (121/109); 2 - Slu (112/109); 3 - S2u (121/109); 4- S5u (94/94); 5- S6u (94/94); 6 - S7u (109/109); 7 - маркер длин фрагментов ДНК; 8 - S11u (118/118); 9 - S12u (121/112); 10 - Sh5 (109/103); 11 - Sh6 (118/109); 12 - S9 (118/94); 13 - S14 (112/109); 14 - Scl (109/109).

Изобретение относится к области биохимии и генетики растений. Предлагается способ молекулярно-генетической идентификации растений ивы на основе микросателлитных (SSR) маркеров, который включает в себя выделение ДНК из исследуемых образцов, проведение ПЦР, электрофоретическое разделение продуктов амплификации ДНК, документирование результатов ПЦР, определение длин амплифицированных фрагментов ДНК путем сравнения со стандартами молекулярной массы, получение таблицы многолокусных генотипов по микросателлитным локусам и сравнение полученных генотипов с генотипами исходных растений. Способ позволяет установить идентичность особей и оценить вероятность встречаемости мультилокусных генотипов и случайного совпадения неродственных или родственных особей. Изобретение также позволяет осуществлять надежную и достоверную идентификацию генотипов ивы на индивидуальном уровне и может быть использовано для широкого спектра видов рода Salix, являясь, таким образом, универсальным. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл.

1. Способ молекулярно-генетической идентификации генотипов ивы на основе микросателлитных (SSR) маркеров, заключающийся в выделении ДНК из исследуемых образцов, проведении ПЦР, электрофоретическом разделении продуктов амплификации ДНК, документировании результатов ПЦР с помощью системы гель-документации, определении длин амплифицированных фрагментов ДНК путем сравнения со стандартами молекулярной массы, получении таблицы многолокусных генотипов по микросателлитным локусам, сравнении полученных генотипов с генотипами исходных растений с целью установления идентичности особей и оценки вероятности встречаемости мультилокусных генотипов и случайного совпадения неродственных или родственных генотипов, отличающийся тем, что амплификацию ДНК проводят по следующему набору микросателлитных локусов с использованием фланкирующих их праймеров:

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пригоден для идентификации элитных генотипов ивы, культивируемых с помощью микроклонального размножения или иными способами размножения, и любых прочих генотипов ивы на любых стадиях индивидуального развития.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что основан на применении универсального набора генетических маркеров, пригодных для идентификации растений, принадлежащих к различным видам рода Salix.