БИОРЕАКТОРНАЯ СИСТЕМА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C12M3/02 C12M1/00 

Техническая область

Настоящая заявка относится к биореакторной системе для культивирования клеток, в особенности подходящей для культивирования клеток без клеточных стенок, например, клетки животных, и к способу культивирования клеток с использованием биореакторной системы. Биореакторная система, упомянутая в данной заявке, может обеспечивать культивирование и пролиферацию клеток с высокой степенью выживаемости клеток.

Уровень техники

Продукты, экспрессируемые клетками млекопитающих, заняли абсолютное преимущество в биофармацевтической промышленности и стали основной тенденцией биофармацевтики. Производственная линия и процесс культивирования клеток с биореактором в качестве основного корпуса являются движущей силой оборудования для продвижения технологических инноваций и улучшения процесса крупномасштабного культивирования клеток животных, а также основой для повышения эффективности производства, масштабов производства и качества продукции. К отечественным и зарубежным коммерческим биореакторам клеток животных относятся биореакторы с мешалкой, биореакторы с полыми волокнами, биореакторы с воздушным транспортом и мешочные биореакторы.

С одной стороны, из-за того, что клетки животных не имеют клеточных стенок и чувствительны к среде культивирования, такой как сила сдвига и осмотическое давление, реактор должен иметь высокую эффективность переноса кислорода, хорошие характеристики перемешивания и низкий эффект сдвига. Таким образом, общая проблема биореактора, являющегося ключевым оборудованием для выращивания культур клеток животных, заключается в том, чтобы сделать реактор с низким сдвиговым эффектом, хорошим массопереносом и эффектом перемешивания в соответствии с требованиями роста клеток. Однако в большинстве существующих биореакторов используется нижняя аэрация и механическое перемешивание для подачи кислорода и перемешивания культуральных жидкостей. Возникающее в результате сильное усилие сдвига, высокая концентрация кислородной пены и разрыв их пузырьков вызывают большее повреждение клеток животных, а также большое снижение плотности клеточной культуры.

С другой стороны, разработка биореакторного оборудования и процесс исследования процесса биологической реакции должны быть изучены и протестированы на мелкосерийном оборудовании, после чего постепенно расширены до крупномасштабного оборудования для испытаний в масштабе процесса и коммерческого производства. Однако на практике данные, процессы и законы, полученные в результате научных экспериментов в малых реакторах, не могут дать таких же или лучших результатов в реакторах большой мощности. Следовательно, масштабная конструкция биореактора не может удовлетворить потребности в культуре клеток животных в промышленных масштабах за счет простой амплификации в равных масштабах. В настоящее время методы амплификации, основанные на некоторых закономерностях, установленных опытом эксплуатации существующих биореакторов, носят в основном качественный характер, лишь некоторые простые и грубые количественные понятия, а коэффициент амплификации обычно мал и неточен. Поэтому, прежде чем получить полный теоретический анализ системы, следует разработать и увеличить масштабную конструкцию биореакторов, основываясь на опыте и практических принципах.

Сущность изобретения

Ввиду вышеупомянутых проблем, изобретатель этого приложения использует вычислительную гидродинамику (CFD) для моделирования биореактора в рабочем состоянии, изучения теоретической модели биореактора, которая может удовлетворить потребности культуры различного масштаба, и проверки ее в реальной клеточной культуре. Используя эту теоретическую модель, можно получить биореакторную систему, которая может удовлетворять требованиям культивирования животных клеток и пролиферации в различных масштабах, при этом уровень выживаемости животных клеток можно поддерживать на уровне более 85,0%. CFD относится к использованию численных методов для решения основных уравнений гидродинамики на компьютере с целью прогнозирования поля потока. В настоящее время доступно множество коммерческих программ CFD, таких как FLUENT, CFD-ACE+ (CFDRC), Phoenics, CFX, Star-cd и др. Моделирование поля течения с использованием программного обеспечения CFD хорошо известно специалистам в данной области техники.

С одной стороны, настоящая заявка относится к биореакторной системе для культивирования клеток, в особенности культуры клеток без клеточных стенок, которая включает в себя:

- контейнер, содержащий полый цилиндр диаметром D1 и высотой H1, а также полый круглый конус с верхним диаметром D2, нижним диаметром D3 и высотой H2, при этом полый цилиндр соединен с верхней поверхностью полого круглого конуса, D1=D2;

- осциллятор, устроенный таким образом, чтобы контейнер двигался эксцентрично в соответствии с определенным эксцентриситетом и скоростью вращения;

- вентиляционные средства, предназначенные для подачи кислородсодержащего газа в контейнер из верхней части контейнера, и

- и культуральная среда, которая заливается в контейнер, верхняя поверхность которой подвергается воздействию кислородсодержащего газа,

при этом осциллятор устроен таким образом, чтобы контейнер двигался эксцентрично, так что отношение (S/V) общей площади поверхности культуральной жидкости к объему составляет более 5,65, турбулентная кинетическая энергия составляет более 2,73E-03 м²/с², а скорость сдвига поля течения менее 20,27/с. Общая площадь поверхности жидкости представляет собой сумму площади контакта между культуральной жидкостью и стенкой реактора и площади контакта между верхней поверхностью и газом. В некоторых вариантах осуществления значение S/V, турбулентная кинетическая энергия и скорость сдвига поля потока получаются с помощью моделирования CFD.

Моделирование CFD может быть реализовано с помощью программного обеспечения FLUENT. Значение S/V культуральной среды в стационарном состоянии связано с формой контейнера, объемом V культуральной жидкости, скоростью вращения контейнера и эксцентриситетом R, которые можно получить с помощью моделирования CFD. Скорость сдвига, создаваемая в контейнере, связана с формой, скоростью и эксцентриситетом контейнера, которые можно получить с помощью моделирования CFD. Турбулентная кинетическая энергия в сосуде связана со скоростью вращения и эксцентриситетом сосуда, которые можно получить с помощью моделирования CFD.

Биореакторная система может также включать одноразовый культуральный мешок, расположенный в контейнере для содержания культуральной среды. Одноразовый культуральный мешок имеет многофункциональную крышку, которая соединена с верхней частью культурального мешка для герметизации культурального мешка и снабжена множеством соединительных отверстий, ведущих внутрь одноразового культурального мешка. Одноразовый культуральный мешок может быть гибким культуральным мешком или выполнен из твердого материала и иметь форму, соответствующую контейнеру в развернутом виде. Одноразовый культуральный мешок может быть снабжен устройством для его крепления к контейнеру. Соединительное отверстие на многофункциональной крышке имеет хорошую герметизацию и при необходимости может быть соединено с электродом обнаружения, кабелепроводом и т.д. В некоторых вариантах осуществления соединительные отверстия уплотнены резьбой с хорошей воздухонепроницаемостью. В некоторых вариантах осуществления каждый электрод обнаружения подключается через любое соединительное отверстие для мониторинга параметров окружающей среды, таких как температура, растворенный кислород и рН, в процессе культивирования клеток в режиме реального времени. В некоторых вариантах осуществления катетер подсоединяется через соединительное отверстие для выполнения различных операций, таких как инокуляция клеточной культуры, добавление культуральной среды, отбор проб, извлечение, сбор и вентиляция, чтобы дополнительно оптимизировать условия культивирования и повысить плотность клеточной культуры. В то же время соединительные отверстия многофункциональной накладки, которые можно применять к различным одноразовым культуральным мешкам, используют унифицированные стандартные резьбовые соединения, которые обладают хорошей воздухонепроницаемостью и могут быть гибко выбраны в соответствии с потребностями клеточной культуры. Соединительные отверстия, которые не нужны в конкретном процессе культивирования, могут быть легко заделаны.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 400-4000 мм, D3 составляет 40-400 мм, H1 составляет 100-1500 мм и H2 составляет 40-1200 мм.

В некоторых вариантах осуществления значение D1:D3 или D2:D3 представляет собой любое значение в диапазоне от около 5 до около 16 либо любое значение в диапазоне от 5 до 16. В некоторых вариантах осуществления значение D1:D3 или D2:D3 составляет около 5, около 7,37, около 7,89, около 8,89, около 10,27 или около 15,77. В некоторых вариантах осуществления значения D1:D3 или D2:D3 составляют 5, 7,37, 7,89, 8,89, 10,27 или 15,77. Термин «около» в настоящем описании означает ±20%, ±18%, ±15%, ±12%, ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±10% от указанного значения, а диапазон ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, ±1% или ±0,5% включает в себя конечные точки диапазона и любое значение в пределах диапазона.

В некоторых вариантах осуществления значение D1:H1 или D2:H1 представляет собой любое значение в диапазоне от около 2 до около 5 или любое значение в диапазоне от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления D1:H1 или D2:H1 имеет значение около 2,68, около 3, около 3,55, около 3,74, около 3,66 или около 3,46. В некоторых вариантах осуществления значения D1:H1 или D2:H1 составляют 2,68, 3, 3,55, 3,74, 3,66 или 3,46.

В некоторых вариантах осуществления значение D1:H2 или D2:H2 представляет собой любое значение в диапазоне от около 4 до около 5 или любое значение в диапазоне от 4 до 5. В некоторых вариантах осуществления значение D1:H2 или D2:H2 составляет около 4,08, около 4,94, около 4,95, около 4,87, около 4,20 или около 4,51. В некоторых вариантах осуществления значение D1:H2 или D2:H2 составляет 4,08, 4,94, 4,95, 4,87, 4,20 или 4,51.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют около 400-2997 мм, D3 составляет около 80-190 мм, H1 составляет около 149-867 мм, H2 составляет около 98-664 мм, содержит от около 5 до около 3000 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет около 55-24 об/мин, а эксцентриситет составляет около 30-65 мм. В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 400-2997 мм, D3 - 80-190 мм, H1 - 149-867 мм, H2 - 98-664 мм, содержащие 5-3000 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора 55-24 об/мин, эксцентриситет 30-65 мм.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют около 400 мм, D3 составляет около 80 мм, H1 составляет около 149 мм, H2 составляет около 98 мм, составляет около 5 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет около 55 об/мин, а эксцентриситет составляет около 30 мм. В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 400 мм, D3 - 80 мм, H1 - 149 мм и H2 - 98 мм, содержат около 5 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 55 об/мин, эксцентриситет 30 мм.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют около 840 мм, D3 около 114 мм, H1 около 280 мм, H2 около 170 мм, составляет около 50 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет около 40 об/мин, а эксцентриситет составляет около 40 мм. В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 840 мм, D3 - 114 мм, H1 - 280 мм, H2 - 170 мм, содержат 50 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 40 об/мин, эксцентриситет 40 мм.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют около 840 мм, D3 составляет около 114 мм, H1 составляет около 280 мм, H2 составляет около 170 мм, составляет около 18 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора около 37 - около 39 об/мин, а эксцентриситет около 40 мм. В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 840 мм, D3 - 114 мм, H1 - 280 мм, H2 - 170 мм, содержат 18 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 37 - 39 об/мин, эксцентриситет 40 мм.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют около 840 мм, D3 составляет около 114 мм, H1 составляет около 280 мм, H2 составляет около 170 мм, составляет около 18 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет около 39 об/мин, а эксцентриситет составляет около 40 мм. В одном из вариантов D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 840 мм, D3 - 114 мм, H1 - 280 мм, H2 - 170 мм, содержат 18 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 39 об/мин, эксцентриситет 40 мм.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют около 1500 мм, D3 составляет около 190 мм, H1 составляет около 422 мм, H2 составляет около 303 мм, составляет около 18 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет около 37-39 об/мин, а эксцентриситет составляет около 40 мм. В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1500 мм, D3 - 190 мм, H1 - 422 мм и H2 - 303 мм, содержат 18 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 37-39 об/мин, эксцентриситет 40 мм.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют около 1500 мм, D3 составляет около 190 мм, H1 составляет около 422 мм, H2 составляет около 203 мм, составляет около 200 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет около 30 об/мин, а эксцентриситет составляет около 60 мм. В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1500 мм, D3 - 190 мм, H1 - 422 мм, H2 - 203 мм, содержат 200 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет 60 мм.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют около 1500 мм, D3 составляет около 190 мм, H1 составляет около 422 мм, H2 составляет около 203 мм, составляет около 205 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет около 30 об/мин, а эксцентриситет составляет около 60 мм. В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1500 мм, D3 - 190 мм, H1 - 422 мм, H2 - 203 мм, содержат 205 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет 60 мм.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют около 1500 мм, D3 около 190 мм, H1 около 422 мм, H2 около 203 мм, составляет около 250 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет около 30 об/мин, а эксцентриситет составляет около 60 мм. В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1500 мм, D3 - 190 мм, H1 - 422 мм, H2 - 203 мм, содержат 250 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/ми, эксцентриситет 60 мм.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют около 1690 мм, D3 около 190 мм, H1 около 452 мм, H2 около 347 мм, содержит около 500 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет около 28 об/мин, а эксцентриситет составляет около 65 мм. В некоторых вариантах D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1690 мм, D3 - 190 мм, H1 - 452 мм, H2 - 347 мм, содержат 500 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 28 об/мин, эксцентриситет 65 мм.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют около 1952 мм, D3 около 190 мм, H1 около 533 мм, H2 около 465 мм, содержит около 1200 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет около 25 об/мин, а эксцентриситет составляет около 65 мм. В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1952 мм, D3 - 190 мм, H1 - 533 мм, H2 - 465 мм, содержат 1200 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 25 об/мин, эксцентриситет 65 мм.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют около 1952 мм, D3 около 190 мм, H1 около 533 мм, H2 около 465 мм, содержит около 250 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет около 30 об/мин, а эксцентриситет составляет около 65 мм. В некоторых вариантах D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1952 мм, D3 - 190 мм, H1 - 533 мм, H2 - 465 мм, содержит 250 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет 65 мм.

В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют около 1952 мм, D3 около 190 мм, H1 около 533 мм, H2 около 465 мм, содержит около 330 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет около 30 об/мин, а эксцентриситет составляет около 65 мм. В некоторых вариантах осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1952 мм, D3 - 190 мм, H1 - 533 мм, H2 - 465 мм, содержат 330 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет 65 мм.

В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток осуществляют с использованием биореактора, содержащего около 3000 л культуральной среды, с D1 и D2 около 2997 мм, D3 около 190 мм, H1 около 867 мм, H2 около 664 мм, скорость вращения осциллятора установлена около на 24 об/мин, а эксцентриситет установлен около на 65 мм. В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток осуществляют с использованием биореактора, содержащего 3000 л культуральной среды с D1 и D2 2997 мм, D3 190 мм, H1 867 мм и H2 664 мм, а скорость вращения осциллятора установлена на 24 об/мин. Эксцентриситет установлен на 65 мм.

В одном из вариантов осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 400 мм, D3 - 80 мм, H1 - 149 мм, H2 - 98 мм, составляет 5 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 55 об/мин, эксцентриситет составляет 30 мм, стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD, составляет X, турбулентная кинетическая энергия составляет X м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет X/с. В одном из вариантов осуществления стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD биореакторной системы, составляет 50,48, турбулентная кинетическая энергия составляет 2,73E-03 м²/с², скорость сдвига поля потока составляет 10,18/с.

В одном из вариантов осуществления D1 и D2 сосуда в биореакторной системе составляют 840 мм, D3 - 114 мм, H1 - 280 мм, H2 - 170 мм, содержат 50 л культуральной среды, а скорость вращения осциллятора составляет 40 об/мин, эксцентриситет составляет 40 мм, стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD, составляет X, турбулентная кинетическая энергия равна x м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет X/с. В одном из вариантов осуществления стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD биореакторной системы, составляет 26,61, турбулентная кинетическая энергия составляет 5,29E-03 м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет 7,02/с.

В одном из вариантов осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 840 мм, D3 - 114 мм, H1 - 280 мм, H2 - 170 мм, составляет 18 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 37-39 об/мин, эксцентриситет 40 мм, стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD, составляет X, турбулентная кинетическая энергия равна x м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет X/с. В одном из вариантов осуществления скорость вращения осциллятора в биореакторной системе составляет 37 об/мин, стационарное значение S/V, полученное с помощью моделирования CFD, составляет 43,34, турбулентная кинетическая энергия составляет 4,71E-03 м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет 6,8056/с. В одном из вариантов осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 840 мм, D3 - 114 мм, H1 - 280 мм, H2 - 170 мм, составляет 18 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 39 об/мин, эксцентриситет составляет 40 мм, стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD, составляет X, турбулентная кинетическая энергия составляет X м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет X/с. В одном из вариантов осуществления стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD биореакторной системы, составляет 47,89, турбулентная кинетическая энергия составляет 5,35E-03 м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет 7,1149/с.

В одном из вариантов осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1500 мм, D3 - 190 мм, H1 - 422 мм, H2 - 303 мм, составляет 200 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет составляет 60 мм, стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD, составляет X, турбулентная кинетическая энергия равна x м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет X/с. В одном из вариантов осуществления стационарное значение S/V движения культурального раствора, полученное с помощью моделирования CFD биореакторной системы, составляет 18,46, турбулентная кинетическая энергия составляет 9,91E-03 м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет 5,9707/с. В одном варианте осуществления D1 и D2 сосуда в биореакторной системе составляют 1500 мм, D3 - 190 мм, H1 - 422 мм, H2 - 303 мм, составляет 205 л культуральной среды, а скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет составляет 60 мм, стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD, составляет X, турбулентная кинетическая энергия равна X м²/с², а скорость сдвига поля потока равна X/с. В одном из вариантов стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD биореакторной системы, составляет 18,24, турбулентная кинетическая энергия составляет 9,89E-03 м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет 5,7476/с. В одном из вариантов D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1500 мм, D3 - 190 мм, H1 - 422 мм, H2 - 303 мм, содержат 250 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет составляет 60 мм, стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD, составляет X, турбулентная кинетическая энергия равна X м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет X/с. В одном варианте стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD биореакторной системы, составляет 15,98, турбулентная кинетическая энергия составляет 9,30E-03 м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет 5,4623/с.

В одном из вариантов осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1690 мм, D3 - 190 мм, H1 - 452 мм, H2 - 347 мм, содержат 500 л культуральной среды, а скорость вращения осциллятора составляет 28 об/мин, эксцентриситет составляет 65 мм, стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD, составляет X, турбулентная кинетическая энергия равна X м²/с², а скорость сдвига поля потока равна X/с. В одном из вариантов осуществления стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD биореакторной системы, составляет 10,61, турбулентная кинетическая энергия составляет 7,59E-03 м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет 4,66/с.

В одном из вариантов D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1952 мм, D3 - 190 мм, H1 - 533 мм, H2 - 465 мм, содержат 1200 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 25 об/мин, эксцентриситет составляет 65 мм, стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD, составляет 6,60, турбулентная кинетическая энергия составляет 9,30E-03 м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет 4,42/с. В одном из вариантов D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1952 мм, D3 - 190 мм, H1 - 533 мм, H2 - 465 мм, составляет 250 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет составляет 65 мм, стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD, составляет X, турбулентная кинетическая энергия составляет X м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет X/с. В одном из вариантов стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD биореакторной системы, составляет 20,96, турбулентная кинетическая энергия составляет 1,46E-02 м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет 6,0922/с. В одном варианте осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1952 мм, D3 - 190 мм, H1 - 533 мм, H2 - 465 мм, составляет 330 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет составляет 65 мм, стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD, составляет X, турбулентная кинетическая энергия составляет Х м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет X/с. В одном из вариантов осуществления стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD биореакторной системы, составляет 18,09, турбулентная кинетическая энергия составляет 1,52E-02 м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет 6,3173/с.

В одном из вариантов осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 2997 мм, D3 - 190 мм, H1 - 867 мм, H2 - 664 мм, составляет 3000 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 24 об/мин, эксцентриситет составляет 65 мм, стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD, составляет Х, турбулентная кинетическая энергия составляет Х м2/с2, а скорость сдвига поля потока составляет Х/с. В одном из вариантов осуществления стационарное значение S/V движения культуральной среды, полученное с помощью моделирования CFD биореакторной системы, составляет 5,65, турбулентная кинетическая энергия составляет 2,48E-02 м²/с², а скорость сдвига поля потока составляет 3,98/с.

С другой стороны, настоящая заявка относится к способу культивирования клеток, в особенности клеток без клеточных стенок, с использованием биореакторной системы, включающей в себя:

- контейнер, содержащий полый цилиндр диаметром D1 и высотой H1, а также полый круглый конус с верхним диаметром D2, нижним диаметром D3 и высотой H2, при этом полый цилиндр соединен с верхней поверхностью полого круглого конуса, D1=D2;

- осциллятор, который может быть устроен таким образом, чтобы контейнер двигался эксцентрично в соответствии с определенным эксцентриситетом и скоростью вращения;

- вентиляционные средства, предназначенные для подачи кислородсодержащего газа в контейнер из верхней части контейнера, и

- культуральная среда, которая заливается в контейнер, верхняя поверхность которой подвергается воздействию кислородсодержащего газа,

Методы культивирования клеток включают в себя:

- В зависимости от формы биореакторной системы и объема культуральной среды отношение S/V общей площади поверхности S культуральной среды к объему V культуральной среды, когда эксцентричное движение культуральной среды достигает установившееся состояние рассчитывается с помощью моделирования CFD, а скорость осциллятора и эксцентриситет требуются, когда отношение S/V больше 5,65, турбулентная кинетическая энергия должна быть более 2.73E-03 м²/с², а скорость сдвига поля потока должна быть менее 20,27/с, рассчитанные с помощью моделирования CFD. Общая площадь поверхности жидкости культуральной среды представляет собой сумму площади контакта между культуральной средой и стенкой реактора и площади контакта между культуральной средой и газом; кроме того,

- Добавьте культуральную среду и инокулируйте клетки в биореакторную систему и установите осциллятор в соответствии с расчетной скоростью осциллятора и эксцентриситетом для реализации культивирования клеток.

Моделирование CFD можно выполнять с помощью программного обеспечения FLUENT.

В соответствии с общей рабочей мощностью биореакторной системы скорость вращения осциллятора уменьшается с увеличением объема контейнера. В соответствии с эффективностью работы биореакторной системы эксцентриситет осциллятора увеличивается с увеличением объема контейнера.

Например, для биореакторной системы с максимальным рабочим объемом 5 л скорость вращения осциллятора может быть установлена в диапазоне 45-70 об/мин, а эксцентриситет можно установить около 30 мм; для биореакторной системы с максимальным рабочим объемом 50 л скорость вращения осциллятора может быть установлена в диапазоне 40-60 об/мин, а эксцентриситет - около 40 мм; для биореакторной системы с максимальным рабочим объемом 500 л скорость вращения осциллятора может быть установлена в диапазоне 25-30 об/мин, а эксцентриситет - около 65 мм; для биореакторной системы с максимальным рабочим объемом 1200 л скорость вращения осциллятора может быть установлена в диапазоне 20-30 об/мин, а эксцентриситет - около 65 мм; для биореакторной системы с максимальным рабочим объемом 3000 л скорость вращения осциллятора может быть установлена в диапазоне 24-26 об/мин, а эксцентриситет - около 65 мм.

Биореакторная система может также включать одноразовый культуральный мешок, расположенный в контейнере для содержания культуральной среды. Одноразовый культуральный мешок имеет многофункциональную крышку, которая соединена с верхней частью культурального мешка для герметизации культурального мешка и снабжена множеством соединительных отверстий, ведущих внутрь одноразового культурального мешка. Одноразовый культуральный мешок может быть гибким культуральным мешком или выполнен из твердого материала и иметь форму, соответствующую контейнеру в развернутом виде. Одноразовый культуральный мешок может быть снабжен устройством для его крепления к контейнеру. Соединительное отверстие на многофункциональной крышке имеет хорошую герметизацию и при необходимости может быть соединено с электродом обнаружения, кабелепроводом и т. д. В некоторых вариантах осуществления соединительные отверстия уплотнены резьбой с хорошей воздухонепроницаемостью. В некоторых вариантах осуществления каждый электрод обнаружения подключается через любое соединительное отверстие для мониторинга параметров окружающей среды, таких как температура, растворенный кислород и рН, в процессе культивирования клеток в режиме реального времени. В некоторых вариантах осуществления катетер подсоединяется через соединительное отверстие для выполнения различных операций, таких как инокуляция клеточной культуры, добавление культуральной среды, отбор проб, извлечение, сбор и вентиляция, чтобы дополнительно оптимизировать условия культивирования и повысить плотность клеточной культуры. В то же время соединительные отверстия многофункциональной накладки, которые можно применять к различным одноразовым культуральным мешкам, используют унифицированные стандартные резьбовые соединения, которые обладают хорошей воздухонепроницаемостью и могут быть гибко выбраны в соответствии с потребностями клеточной культуры. Соединительные отверстия, которые не нужны в конкретном процессе культивирования, могут быть легко заделаны.

В одном из вариантов осуществления культивирование клеток проводят с использованием биореактора с D1 и D2 - 400 мм, D3 - 80 мм, H1 - 149 мм, H2 - 98 мм и содержащего 5 л культуральной среды, при скорости вращения осциллятора, установленной на 55 об/мин, эксцентриситет - 30 мм.

В одном из вариантов осуществления культивирование клеток проводят с использованием биореактора с D1 и D2 - 840 мм, D3 - 114 мм, H1 - 280 мм, H2 - 170 мм и содержащего 50 л культуральной среды, при скорости вращения осциллятора, установленной на 40 об/мин, эксцентриситет - 40 мм.

В одном из вариантов осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1500 мм, D3 - 190 мм, H1 - 422 мм и H2 - 303 мм, содержат 18 л культуральной среды, при скорости вращения осциллятора 39 об/мин, эксцентриситет 40 мм.

В одном из вариантов осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1500 мм, D3 - 190 мм, H1 - 422 мм, H2 - 203 мм, составляет 200 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет 60 мм. В одном из вариантов осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1500 мм, D3 - 190 мм, H1 - 422 мм, H2 - 203 мм, составляет 205 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет 60 мм. В одном из вариантов осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1500 мм, D3 - 190 мм, H1 - 422 мм, H2 - 203 мм, составляет 250 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет 60 мм.

В одном из вариантов осуществления культивирование клеток проводят с использованием биореактора с D1 и D2 - 1690 мм, D3 - 190 мм, H1 - 452 мм, H2 - 347 мм и содержащего 500 мкл культуральной среды, при скорости вращения осциллятора, установленной на 28 об/мин, эксцентриситет - 65 мм.

В одном из вариантов осуществления культивирование клеток проводят с использованием биореактора с D1 и D2 - 1952 мм, D3 - 190 мм, H1 - 533 мм, H2 - 465 мм, содержащего 1200 л культуральной среды, при скорости вращения осциллятора 25 об/мин, эксцентриситет - 65 мм.

В одном из вариантов осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1952 мм, D3 - 190 мм, H1 - 533 мм и H2 - 465 мм, содержат 250 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет - 65 мм.

В одном из вариантов осуществления D1 и D2 контейнера в биореакторной системе составляют 1952 мм, D3 - 190 мм, H1 - 533 мм, H2 - 465 мм, содержат 330 л культуральной среды, скорость вращения осциллятора составляет 30 об/мин, эксцентриситет - 65 мм.

В одном из вариантов осуществления культивирование клеток проводят с использованием биореактора с D1 и D2 - 2997 мм, D3 - 190 мм, H1 - 867 мм, H2 - 664 мм, содержащего 3000 л культуральной среды, при скорости осциллятора 24 об/мин, эксцентриситет - 65 мм.

Согласно настоящей заявке в биореакторной системе эксцентричное движение культуральной среды создает меньшую силу сдвига и меньшее повреждение клеток, что в особенности подходит для культивирования клеток без клеточных стенок, например, клеток животных; кроме того, когда стационарное значение S/V и турбулентная кинетическая энергия культуральной среды контролируются в определенном диапазоне во время эксцентрического движения, растворенный кислород и эффективность расширения кислорода высоки, а неравномерное распределение кислорода не вызовает кислородной токсичности при концентрация кислорода слишком высока или когда концентрация кислорода слишком низка, рост и пролиферация клеток ограничены, что может более эффективно поддерживать рост клеток с высокой плотностью. Когда метод в этой заявке используется для культивирования клеток, будь то мелкомасштабное или крупномасштабное культивирование, эффективность роста и пролиферации клеток высока, а уровень выживаемости клеток остается выше 90,0%, 95,0% или даже 99,0%. Особенно, когда одноразовый мешок для культивирования используется в комбинации, это позволяет избежать перекрестного загрязнения, сократить цикл обработки между партиями, не требует использования сложных трубопроводов и других вспомогательных средств, очистки, дезинфекции и проверки, а также значительно повышает эффективность работы.

Описание фигур

На фиг. 1 показано схематическое изображение конструкции контейнера биореакторной системы согласно настоящей заявке.

На фиг. 2 показано схематическое изображение траектории движения любой точки контейнера при эксцентричном движении.

На фиг. 3 показана моделирующая схема изменения уровня свободной жидкости при вращении CUR300L за один цикл при рабочем объеме 300 л и скорости вращения 28 об/мин.

На фиг. 4 показана моделирующая схема изменения уровня свободной жидкости при вращении CUR300L за один цикл при рабочем объеме 300 л и скорости вращения 30 об/мин.

На фиг. 5 показана моделирующая схема изменения уровня свободной жидкости при вращении CUR300L за один цикл при рабочем объеме 175 л и скорости вращения 28 об/мин.

На фиг. 6 показана моделирующая схема изменения уровня свободной жидкости при вращении CUR300L за один цикл при рабочем объеме 175 л и скорости вращения 30 об/мин.

Конкретные варианты осуществления

При культивировании клеток, в особенности клеток без клеточных стенок, например, клеток животных, идеальным условием является то, что реактор будет вызывать небольшое физическое повреждение клеток, и реактор сможет вовремя обеспечить достаточное количество кислорода для поддержки роста и пролиферации клеток. Это требует, чтобы биореакторная система создавала меньшую силу сдвига и обеспечивала более высокую эффективность растворенного кислорода и диффузии кислорода. Целью настоящей заявки является создание биореакторной системы с указанным выше эффектом.

При разработке биореакторного оборудования и исследовании процесса биологической реакции часто необходимо исследовать и тестировать мелкосерийное оборудование, а затем постепенно масштабировать его до крупномасштабного оборудования для масштабного тестирования процесса и коммерческого производства. Однако на практике данные, процессы и законы, полученные в результате научных экспериментов в малых реакторах, не могут дать таких же или лучших результатов в больших реакторах. Масштабная конструкция биореактора не может удовлетворить потребности промышленного масштаба культуры клеток животных за счет простой амплификации в равных масштабах.

Так, изобретатель настоящей заявки смоделировали биореакторы в различных масштабах в рабочих условиях с помощью моделирования вычислительной гидродинамики (CFD), и сосредоточился на 5 типах реакторов с различными объемами, включая CUR2.5L, CUR50L, CUR300L, CUR1200L, CUR3000L. При условии, что осциллятор движется эксцентрично вдоль вертикальной оси, изменение относительного положения культуральной среды, площадь границы раздела газ-жидкость, общая площадь поверхности жидкости, турбулентная кинетическая энергия жидкости, скорость диссипации турбулентной кинетической энергии, интенсивность турбулентности и изменение силы сдвига и т. д. Когда некоторые из комбинаций параметров были всесторонне выбраны и применены к фактической культуре клеток, было обнаружено, что независимо от того, использовалась ли биореакторная система объемом 5 л или 1200 л, можно было реализовать стабильный рост клеток, при этом выживаемость клеток была более 90,0%, 95,0% или даже 99%.

Биореакторная система в этой заявке в основном состоит из контейнера и осциллятора. Контейнер состоит из полого цилиндра в верхней части и полого круглого конуса в нижней части. Контейнер совершает круговое движение с постоянной скоростью вокруг эксцентричного расстояния равного радиуса. Контролируя отношение общей площади поверхности к объему, турбулентной кинетической энергии и скорости сдвига поля потока в определенном диапазоне, можно реализовать стабильный рост клеток и поддерживать выживаемость клеток на высоком уровне.

Осциллятор выполняет «эксцентрическое движение», что означает, что двигатель в осцилляторе приводит в движение шкив, который одновременно вращается через ремень. Шкив и три кривошипа соединены вместе для приведения в движение подвижной платформы. Каждая точка на подвижной платформе совершает круговое движение с постоянной скоростью вокруг эксцентриситета одного и того же радиуса, а траектория движения любой точки на подвижной платформе одинакова. В любой момент времени скорость и ускорение каждой точки одинаковы. Контейнер биореакторной системы закреплен на подвижной платформе осциллятора. Движение контейнера поступательное в горизонтальной плоскости. Достаточно измерить траекторию движения любой точки контейнера, чтобы определить траекторию движения других частей, как показано на фиг. 2.

«Растворенный кислород» означает контакту между верхней поверхностью культуральной среды и кислородсодержащим газом, чтобы ввести газ в культуральную среду, и когда осциллятор приводит в движение контейнер биореакторной системы для совершения эксцентричного движения, чтобы заставить культуральную среду произвести медленное движение, постоянно омывает поверхность контейнера, создает нанорастворимые микропузырьки и перетаскивает газ в культуральную среду. «Кислородная диффузия» относится к переносу кислородсодержащего газа из жидкости внутрь культуральной среды посредством турбулентной диффузии культуральной среды.

«Общая площадь жидкой поверхности» культуральной среды относится к сумме площади контакта между культуральной средой и стенкой реактора и площади контакта между культуральной средой и газом, которая для краткости обозначается как S, и ее отношения к объему культуральной среды называется соотношением S/V. В этой статье площадь контакта между культуральной средой и газом обозначается аббревиатурой А. Верхняя поверхность культуральной среды находится в непосредственном контакте с кислородом, который будет растворять часть кислорода. В то же время скорость газообновления пленки жидкости, налипшей на внутреннюю стенку корпуса реактора, может отличаться от скорости основного тела жидкой фазы, а контакт между вращающейся к этой точке жидкостью и пленкой жидкости может повлиять на состав основного газа. Когда система биореактора находится в эксцентричном движении, культуральная среда будет отклоняться от центральной оси контейнера реактора в разной степени. Чем выше скорость вращения, тем больше центробежная сила, действующая на жидкость, тем более очевидна степень отклонения, тем тоньше сжимается жидкость и тем более вогнута поверхность раздела, контактирующая с воздухом. Таким образом, при эксцентричном движении площадь контакта между культуральной средой и стенкой биореактора и площадь контакта между верхней поверхностью культуральной среды и газом будут увеличиваться в разной степени, так что общая площадь поверхности жидкости и S/V отношение культуральной среды будет увеличиваться в стационарном состоянии движения.

В культуре клеток без клеточных стенок, например, клеток животных, из-за отсутствия клеточной стенки клетки более чувствительны к механической среде в конвекционном поле. Механическое повреждение, вызванное внешней силой, является фактором, который нельзя игнорировать при проектировании и использовании биореакторов клеток животных. В биореакторе силу сдвига, воздействующую на клетки, можно разделить на три категории: сила сдвига поля потока, создаваемая относительным движением внутри культуральной среды. Величина силы сдвига поля потока прямо пропорциональна градиенту скорости и кинематической вязкости культуральной среды; сила сдвига, возникающая при подъеме пузырьков в культуральной среде и разрыве поверхности; сила сдвига, создаваемая столкновением ячеек с внутренней стенкой реактора и взаимным столкновением ячеек.

При выборе биореакторной системы в соответствии с настоящей заявкой, из-за того, что выбран способ переноса кислорода на поверхности, распределитель пузырьков отсутствует, пузырьков мало, поэтому повреждением силы сдвига, вызванным пузырьками, можно пренебречь. Кроме того, биореакторная система по настоящей заявке представляет собой полый цилиндр плюс полую круглую структуру платформы. Когда он совершает эксцентричное движение, стенка биореактора, контактирующая с культуральной средой и клетками в реакторе, очень гладкая, поэтому сила сдвига при столкновении также мала.

Следовательно, сила сдвига в биореакторе по настоящей заявке в основном представляет собой силу сдвига поля потока. Ущерб, наносимый ячейкам силой сдвига поля потока, тесно связан с минимальным размером вихря, создаваемого турбулентностью жидкости. Культуральная среда вращается близко к стенке резервуара, создавая турбулентный вихрь. Большой вихрь постепенно превращается в мелкий вихрь, а мелкий вихрь превращается в более мелкий вихрь. В этом процессе с передачей энергии механическая энергия культуральной среды переходит в тепловую, повышая ее температуру. В процессе постепенного изменения вихря, когда размер вихря близок к размеру ячейки, вихрь передает энергию ячейке, в результате чего происходит разрыв ячейки. При моделировании CFD установлено, что в одном и том же биореакторе средняя сила сдвига или средняя скорость сдвига увеличиваются с увеличением скорости вращения, а объем культуральной среды мало на это влияет; сила сдвига, создаваемая в более крупном биореакторе, может быть меньше. Когда выбрана биореакторная система согласно настоящей заявке, средняя скорость сдвига получается очень низкой, независимо от формы и спецификации контейнера, объема культуральной среды, скорости вращения и эксцентриситета осциллятора, средняя скорость сдвига очень низкая, что на порядок отличается от порога скорости сдвига в воде (391,41 с^-1) для уничтожения раковых клеток китайского хомяка (CHO). Поэтому при настройке биореакторной системы параметр силы сдвига можно специально не учитывать.

Растворенный кислород и эффективность расширения кислорода культуральной среды связаны с площадью поверхности, турбулентной кинетической энергией и турбулентной интенсивностью культуральной среды. Когда эффективность растворенного кислорода и диффузии кислорода достаточно высока для поддержания роста и пролиферации клеток, нет необходимости использовать газы с особенно высокой концентрацией кислорода. Согласно предыдущему опыту, газы с особенно высокой концентрацией кислорода, особенно чистый кислород, склонны вызывать отравление кислородом.

Эффективность растворенного кислорода культуральной среды в основном связана с площадью поверхности культуральной среды, подвергаемой воздействию кислородсодержащего газа. Когда контейнер биореакторной системы находится в эксцентричном движении, верхняя поверхность культуральной среды и контактная поверхность со стенкой контейнера могут находиться в контакте с кислородсодержащим газом. Следовательно, по сравнению с общей площадью поверхности или отношением S/V в статическом состоянии, общая площадь поверхности или отношение S/V в устойчивом состоянии имеет большее эталонное значение. При моделировании CFD было обнаружено, что различные характеристики контейнера, объем культуральной среды и скорость осциллятора будут влиять на отношение S/V в устойчивом состоянии. Вообще говоря, чем больше отношение S/V, тем выше эффективность растворенного кислорода. Когда используется контейнер, созданного согласно настоящей заявке, эффект стабильного роста и пролиферации клеток, а также высокая выживаемость клеток могут быть достигнуты при условии низкого отношения S/V.

Эффективность диффузии кислорода культуральной среды в основном связана с турбулентной кинетической энергией и интенсивностью турбулентности культуральной среды.

Движение мицелл жидкости можно выразить как суперпозицию средней скорости обтекания основного тела и флуктуационной скорости случайных колебаний. Случайное колебание мицелл вызывает турбулентный поток. Подводимая мощность увеличивается с увеличением скорости вращения, что увеличивает долю мицелл жидкости, несущих высокую энергию, и увеличивается количество микровихрей, способных производить эффективное столкновение и передавать энергию, то есть увеличивается среднее значение турбулентной кинетической энергии. Из моделирования CFD, когда рабочий объем остается неизменным, чем выше скорость вращения, тем выше турбулентная кинетическая энергия, поэтому перенос материала и эффект перемешивания в контейнере лучше. Кроме того, случайная флуктуация мицелл вызывает турбулентную диффузию. Флуктуации скорости между мицеллами сильны, и чем сильнее взаимодействие, тем значительнее передача энергии и дисперсия. Следовательно, чем больше интенсивность турбулентности, тем лучше эффект переноса и перемешивания вещества в жидкой фазе. С увеличением скорости вращения интенсивность турбулентности увеличивается. Увеличение скорости вращения увеличивает энергию во входящей жидкости, что приводит к увеличению кинетической энергии мицелл жидкости, ускорению скорости пульсации и соответствующему увеличению интенсивности турбулентности. Турбулентная кинетическая энергия и интенсивность турбулентности в основном связаны со средней скоростью жидкости и скоростью турбулентных пульсаций и имеют определенную положительную корреляцию со скоростью вращения осциллятора. При рассмотрении эффективности кислородного расширения культуральной среды можно рассматривать только один из них.

С помощью моделирования CFD для определенного биореактора можно выбрать соответствующий объем культуральной среды, скорость вращения осциллятора и эксцентриситет, чтобы добиться эффектов небольшого эффекта сдвига и высокой эффективности растворенного кислорода и диффузии кислорода.

Поскольку собственный вес биореактора увеличивается с увеличением объема, исходя из общей рабочей мощности биореакторной системы, для большого реактора можно выбрать меньшую скорость. С другой стороны, учитывая эффективность работы биореактора, эксцентриситет необходимо выбирать в соответствии с объемом биореактора. Вообще говоря, эксцентриситет осциллятора увеличивается с увеличением объема контейнера.

Например, для биореакторной системы с максимальным рабочим объемом 5 л скорость вращения осциллятора может быть установлена в диапазоне 45-70 об/мин, а эксцентриситет можно установить около 30 мм; для биореакторной системы с максимальным рабочим объемом 50 л скорость вращения осциллятора может быть установлена в диапазоне 45-60 об/мин, а эксцентриситет - около 40 мм; для биореакторной системы с максимальным рабочим объемом 500 л скорость вращения осциллятора может быть установлена в диапазоне 25-30 об/мин, а эксцентриситет - около 65 мм; для биореакторной системы с максимальным рабочим объемом 1200 л скорость вращения осциллятора может быть установлена в диапазоне 20-30 об/мин, а эксцентриситет - около 65 мм.

Далее содержание настоящей заявки будет дополнительно объяснено с помощью конкретных примеров, однако настоящая заявка не ограничивается следующими примерами осуществления.

Пример осуществления 1. Эксперимент по компьютерному моделированию биореактора

Характеристики поля течения в сосуде при разных скоростях реакторов с разными рабочими объемами моделировались с помощью программного обеспечения CFD - FLUENT. Исследовано изменение взаимного положения культуральной среды, площадь границы раздела газ-жидкость при условии эксцентричного перемещения осциллятора по вертикальной оси пяти типов реакторных сосудов разного объема, в том числе CUR2.5L, CUR50L, CUR300L, CUR1200L, CUR3000L, общая площадь поверхности жидкости, турбулентная кинетическая энергия жидкости, скорость диссипации турбулентной кинетической энергии, интенсивность турбулентного потока и изменение силы сдвига. Конкретные этапы, способы и результаты изобретения следующие:

1. Создание имитационной модели биореакторной системы

1. Выдвижение гипотезы

Чтобы успешно провести эксперимент и более эффективно контролировать переменные, экспериментальный объект и начальные условия упрощаются перед созданием модели, принимая следующие пункты:

1.1 Контейнер биореакторной системы представляет собой жесткое тело, без складок на поверхности и без деформации при движении;

1.2 Рабочая среда - стандартное атмосферное давление и нормальная температура;

1.3 Физические свойства культуральной среды в контейнере соответствуют свойствам воды.

2. Создание модели

2.1 Геометрические характеристики

Схематическая структура контейнера биореакторной системы показана на фиг.1, а геометрические характеристики приведены в таблице 1.

Таблица 1. Геометрические характеристикки контейнеров в каждой биореакторной системе Спецификация D1, D2 (мм) D3 (мм) H1 (мм) Н2 (мм) CUR2.5L 269 80 81.5 57 CUR50L 840 114 280 170 CUR300L 1500 190 422 303 CUR1200L 1952 190 533 465 CUR3000L 2997 190 867 664

2.2 Скорость, рабочий объем и соответствующий начальный уровень жидкости

В соответствии с оптимальным диапазоном скоростей и рабочим объемом каждой спецификации определяются три вида скорости и три вида рабочего объема каждого реактора спецификации (CUR3000L определяет два вида скорости в условиях полной нагрузки), всего 38 групп данных, конкретные значения приведены в таблице 2.

Таблица 2. Принципиальная схема условий работы, соответствующих объемным реакторам различных спецификаций Спецификация Скорость вращения (об/мин) Рабочий объем (л) Начальный уровень жидкости (м) Возьмем дно цилиндра в качестве z=0 Спецификация Скорость вращения (об/мин) Рабочий объем (л) Начальный уровень жидкости (м) Возьмем дно цилиндра в качестве z=0 CUR2.5L
CUR2.5L
CUR2.5L 45/57/70 0.5 -0.024 CUR300L 25/28/30 175 -0.017 45/57/70 1.5 0.000 CUR300L 25/28/30 300 0.054 45/57/70 2.5 0.018 CUR1200L 20/25/30 150 -0.173 CUR50L 40/50/60 15 -0.05 CUR1200L 20/25/30 675 0.054 CUR50L 40/50/60 32 -0.008 CUR1200L 20/25/30 1200 0.229 CUR50L 40/50/60 50 0.025 CUR3000L 24/26 3000L 0.189 CUR300L 25/28/30 50 -0.130

2.3 Создание сетки

В этом эксперименте используется неструктурированная тетраэдрическая сетка, информация о сетке приведена в таблице 3.

Таблица 3. Информация о неструктурированной тетраэдрической сетке реакторов различных спецификаций Спецификация Максимальный размер сетки (м) Количество узлов (Node) Кол-во сеток (Element) Мин.масса сетки (Min.) Средняя масса сетки (mean) CUR2.5L 0.016 4173 23934 0.3729 0.8407 CUR50L 0.064 2145 12149 0.3138 0.8223 CUR300L 0.128 1336 7500 0.4007 0.8073 CUR1200L 0.128 2803 15966 0.3562 0.8429 CUR3000L 0.256 1314 7334 0.2344 0.8160

2.4 Задание начальных условий поля течения

Для отслеживания границы раздела газа и жидкости использовалась 2-фазная модель VOF, а для модели турбулентности выбрана модель RNG k-ε. Траектория движения биореактора является эксцентричной, а эксцентрические расстояния реакторов CUR2.5L, CUR50L, CUR300L, CUR1200L и CUR3000L составляют 30 мм, 40 мм, 60 мм, 65 мм и 65 мм соответственно. В программном обеспечении FLUENT, использующем технологию динамической сетки сглаживания и многослойности, UDF компилируется для определения движения реактора. Фактором, влияющим на движение резервуара, является угловая скорость ω и эксцентриситет R. Уравнение движения точки на корпусе резервуара имеет вид:

,

где

- Линейная скорость точки в направлении х; - Линейная скорость точки в направлении y;

- Время; - Начальный фазовый угол этой точки (для упрощения расчета эта точка принимается за начальную координату [0, 0, 0] при моделировании реактора).

Возьмем в качестве примера CUR300L, когда скорость составляет 25 об/мин, конкретное содержимое файла UDF выглядит следующим образом:

#include "udf.h"

#include "math.h"

#include "dynamesh_tools.h"

#define rox 0.1571

#define roy -0.1571

#define ome 2.6180

DEFINE_CG_MOTION(tank_rotation_one, dt, vel, omega, time, dtime)

{

vel[0] = rox*cos(ome*time);

vel[1] = roy*sin(ome*time);

vel[2] = 0;

}

2. Результаты эксперимента

1. Взаимное положение и изменение формы жидкости в контейнере при компьютерном моделировании рабочего состояния.

Это моделирование не рассматривает изменения жидкости на начальной стадии, а только квазистационарный процесс, когда форма культуральной среды в реакторе относительно стабильна.

Из моделирующей схемы изменения уровня свободной жидкости реактора, вращающегося за один цикл, когда CUR300L достигает квазистационарного состояния (фиг. 3, фиг. 4, фиг. 5 и фиг. 6), жидкость отклоняется от центральной оси корпус реактора в разной степени. При одном и том же объеме, чем выше скорость вращения, тем больше центробежная сила на жидкости и тем очевиднее степень отклонения; чем выше скорость вращения, тем тоньше сжимается жидкость и тем заметнее углубление границы раздела, контактирующего с газом. Рабочие объемы 300 л и 175 л имеют одинаковую тенденцию изменения. В то же время, наблюдая свободную поверхность в реакторе при вращении, можно также обнаружить, что при достижении квазистационарного состояния процесс изменения формы свободной поверхности в реакторе существенно не изменится.

2. При компьютерном моделировании условий работы общая площадь поверхности жидкости, площадь границы раздела газ-жидкость и их отношение к рабочему объему

Согласно двухмембранной теории двухфазного массопереноса, в реальном процессе скорость обновления газа жидкой мембраны, приклеенной к внутренней стенке корпуса реактора, может отличаться от скорости основного объема жидкой фазы, и контакт между вращающейся к этой точке жидкостью и жидкостной мембраной может повлиять на состав основного газа. Поэтому сумма площади контакта (W) между жидкостью и внутренней стенкой корпуса реактора и площади раздела газ-жидкость (A) выражается как общая площадь поверхности жидкости (S, S =W+A).

Таблица 4. Изменение общей площади поверхности жидкости, площади раздела газ-жидкость и ее отношения к рабочему объему в каждом реакторе рабочего объема при изменении скорости вращения Модель Рабочий объем/л Скорость вращения об/мин Общая площадь поверхности жидкости/м² Поверхность раздела газ-жидкость/м² Общая площадь поверхности жидкости/рабочий объем Площадь поверхности раздела газ-жидкость/
рабочий объем Стат. состояние Дин. состояние Стат. состояние Дин. состояние Стат. состояние Дин. состояние Стат. состояние Дин. состояние CUR2.5L 2.5 60 0.1391 0.1419 0.0580 0.0589 55.64 56.76 23.20 23.56 CUR2.5L 2.5 70 0.1391 0.1553 0.0580 0.0618 55.64 62.12 23.20 24.72 CUR5L 5 55 0.2585 0.2624 0.1217 0.1237 51.70 52.48 24.34 24.74 CUR5L 5 65 0.2585 0.2971 0.1217 0.1281 51.70 59.42 24.34 25.62 CUR50L 50 40 1.2316 1.3304 0.5697 0.5796 24.63 26.61 11.39 11.59 CUR50L 50 55 1.2316 1.4863 0.5697 0.6385 24.63 29.73 11.39 12.77 CUR500L 500 28 5.2369 5.3029 2.2920 2.3103 10.47 10.61 4.58 4.62 CUR500L 500 30 5.2369 5.5070 2.2920 2.3341 10.47 11.01 4.58 4.67 CUR1200L 1200 27 7.8114 7.9005 3.0544 3.0843 6.51 6.58 2.55 2.57 CUR1200L 1200 29 7.8114 7.9610 3.0544 3.1061 6.51 6.63 2.55 2.59 CUR3000L 3000 24 16.7168 16.9434 7.2203 7.2921 5.57 5.65 2.41 2.43 CUR3000L 3000 26 16.7168 17.0518 7.2203 7.3522 5.57 5.68 2.41 2.45

Из таблицы 4 видно, что влияние увеличения скорости вращения на S меняется при разных рабочих объемах. Сравнивая тенденции изменения общей площади поверхности жидкости S и площади поверхности раздела газ-жидкость а различных рабочих объемов различных типов реакторов, обнаруживается, что тенденции изменения этих двух величин в основном согласуются. С увеличением скорости вращения частота вращения жидкости в реакторе увеличивается, а площадь охвата жидкости увеличивается в единицу времени, что увеличивает скорость газожидкостного обновления. Поэтому скорость газожидкостного обновления можно грубо измерить скоростью вращения.

3. Турбулентная кинетическая энергия и скорость диссипации турбулентной кинетической энергии жидкости в реакторе в рабочем состоянии компьютерного моделирования

(1) Турбулентная кинетическая энергия используется для характеристики энергии, заключенной в процессе пульсации мицелл жидкости. Формула выглядит следующим образом:

,

где

- средняя скорость жидкости;

- Интенсивность турбулентности равна отношению среднеквадратичного значения турбулентной флуктуационной скоростик средней скорости .

(2) Скорость диссипации турбулентной кинетической энергии ε используется для измерения скорости потери энергии, вызванной столкновением мицелл и вязкой диссипацией. Формула выглядит следующим образом:

,

где , , - плотность, вязкость и турбулентная вязкость жидкости.

Движение мицелл жидкости можно выразить как суперпозицию средней скорости обтекания основного тела и флуктуационной скорости случайных колебаний. Случайное колебание мицелл вызывает турбулентный поток. Из таблицы 5 видно, что при условии постоянного рабочего объема, чем выше скорость вращения, тем выше турбулентная кинетическая энергия, поэтому эффект переноса и перемешивания материала в реакторе лучше, и увеличивается при изменении градусов.

Подводимая мощность увеличивается с увеличением скорости вращения, что увеличивает долю мицелл жидкости, несущих более высокую энергию, и количество микровихрей, которые могут производить эффективное столкновение и передавать энергию, увеличивается, то есть увеличивается на среднее значение. При этом с увеличением скорости вращения увеличивается площадь сметания жидкости через внутреннюю стенку контейнера в единицу времени, увеличивается возможность газожидкостного контактного обмена, прилегание к стенке и внутреннее вязкое трение жидкости также увеличивается. Увеличение доли высокоэнергетических мицелл приводит к большему количеству столкновений мицелл и передаче энергии, а скорость затухания частоты передачи ускоряется. Таким образом, скорость диссипации турбулентной кинетической энергии ε увеличивается с увеличением скорости вращения.

Связь между коэффициентом переноса кислородной жидкой пленки и скоростью диссипации турбулентной кинетической энергии следующая:

,

где представляет коэффициент диффузии кислорода, и представляют соответственно плотность и вязкость жидкой фазы. Вышеуказанные параметры постоянны в условиях эксперимента, а скорость диссипации турбулентной кинетической энергии ε может быть использована для характеристики силы процесса газожидкостного переноса. Газожидкостный перенос тем сильнее, чем больше ε, примерно, чем больше коэффициент газожидкостного массопереноса.

Таблица 5. Изменение турбулентной кинетической энергии k и скорости диссипации турбулентной кинетической энергии ε в зависимости от скорости вращения в каждом рабочем объеме реактора Спецификация Рабочий объем (л) Скорость вращения (об/мин) Турбулентная кинетическая энергия k Скорость диссипации турбулентной кинетической энергии ε CUR2.5L 0.5 45 3.88E-04 0.0008 0.5 57 1.50E-03 0.0073 0.5 70 3.46E-03 0.0266 1.5 45 7.18E-04 0.0024 1.5 57 1.43E-03 0.0074 1.5 70 3.00E-03 0.0241 2.5 45 4.08E-04 0.0008 2.5 57 1.33E-03 0.0081 2.5 70 2.38E-03 0.0213 CUR50L 15 40 7.65E-03 0.0197 15 50 9.78E-03 0.0326 15 60 1.24E-02 0.0634 32 40 5.41E-03 0.0173 32 50 8.45E-03 0.0310 32 60 1.04E-02 0.0599 50 40 4.67E-03 0.0142 50 50 7.56E-03 0.0200 50 60 8.37E-03 0.0489 CUR300L 50 25 7.52E-03 0.0103 50 28 9.64E-03 0.0159 50 30 1.29E-02 0.0211 175 25 5.03E-03 0.0088 175 28 8.06E-03 0.0156 175 30 9.95E-03 0.0204 300 25 3.50E-03 0.0049 300 28 7.15E-03 0.0150 300 30 9.01E-03 0.0194 CUR1200L 150 20 6.58E-03 0.0102 150 25 9.20E-03 0.0203 150 30 1.63E-02 0.0391 675 20 5.34E-03 0.0101 675 25 8.73E-03 0.0197 675 30 1.42E-02 0.0313 1200 20 5.00E-03 0.0092 1200 25 9.30E-03 0.0151 1200 30 9.94E-03 0.0205 CUR3000L 3000 24 2.48E-02 0.0477 3000 26 3.36E-02 0.0817

4. Интенсивность турбулентности в реакторе в режиме компьютерного моделирования.

С точки зрения микросреды турбулентная диффузия играет ведущую роль. Движение мицелл жидкости можно выразить как суперпозицию средней скорости обтекания основного тела и флуктуационной скорости случайных колебаний. Случайные колебания мицелл жидкости вызывают турбулентную диффузию. Флуктуации скорости между мицеллами тем сильнее, чем сильнее взаимодействие. Передача и рассеивание энергии также более значительны. Следовательно, чем больше интенсивность турбулентности, тем лучше эффект переноса и перемешивания вещества в жидкой фазе.

можно использовать для характеристики интенсивности пульсаций скорости и взаимодействия мицелл жидкости. Флуктуации скорости между мицеллами сильны, и чем сильнее взаимодействие, тем значительнее передача энергии и дисперсия. Следовательно, чем больше интенсивность турбулентности, тем лучше эффект переноса и перемешивания вещества в жидкой фазе. Формула интенсивности турбулентности :

,

где - среднеквадратичное значение турбулентной флуктуационной скорости, а - средняя скорость жидкости. Движение мицелл жидкости можно выразить как суперпозицию средней скорости обтекания основного тела и флуктуационной скорости случайных колебаний. Случайное колебание жидкости вызывает турбулентный поток.

Из таблицы 6 можно сделать вывод, что при условии постоянного рабочего объема с увеличением скорости вращения показывает тенденцию к увеличению. Увеличение скорости вращения увеличивает энергию во входной жидкости, что приводит к увеличению кинетической энергии мицелл жидкости и большей скорости пульсаций, что соответственно повышает интенсивность турбулентности.

Таблица 6. Изменение интенсивности турбулентности I в зависимости от скорости вращения каждого реактора рабочего объема Спецификация Рабочий объем (л) Скорость вращения (об/мин) Интенсивность турбулентности I (%) Спецификация Рабочий объем (л) Скорость вращения (об/мин) Интенсивность турбулентности I (%) CUR2.5L 0.5 45 2.16 CUR50L 15 40 6.76 0.5 57 3.00 15 50 7.65 0.5 70 4.62 15 60 9.46 1.5 45 1.99 32 40 5.67 1.5 57 2.83 32 50 7.19 1.5 70 4.24 32 60 8.91 2.5 45 1.51 50 40 3.00 2.5 57 2.61 50 50 6.21 2.5 70 3.63 50 60 7.61 CUR300L 50 25 5.46 CUR1200L 150 20 4.14 50 28 7.43 150 25 5.62 50 30 9.06 150 30 10.07 175 25 5.38 675 20 5.42 175 28 7.00 675 25 6.92 175 30 7.85 675 30 9.30 300 25 4.55 1200 20 4.43 300 28 6.35 1200 25 5.48 300 30 7.20 1200 30 8.67 CUR3000L 3000 24 11.56 3000 26 13.12

5. Средняя скорость сдвига

За пределами клеточной мембраны животных нет клеточных стенок, поэтому она чувствительна к механической среде в конвекционном поле. Механическое повреждение клеток, вызванное внешней силой, является фактором, который нельзя игнорировать при проектировании и использовании биореактора клеток животных.

В биореакторе силу сдвига, воздействующую на клетки, можно разделить на три категории: сила сдвига поля потока, создаваемая относительным движением внутри культурального раствора, пропорциональна градиенту скорости и кинематической вязкости культурального раствора; сила сдвига, возникающая при подъеме пузырьков в культуральной среде и разрыве поверхности; сила сдвига, создаваемая столкновением ячеек с внутренней стенкой реактора и взаимным столкновением ячеек. Ущерб, наносимый ячейкам силой сдвига поля потока, тесно связан с минимальным размером вихря, создаваемого турбулентностью жидкости. Культуральная среда вращается близко к стенке резервуара, создавая турбулентный вихрь. Большой вихрь постепенно превращается в мелкий вихрь, а мелкий вихрь превращается в более мелкий вихрь. В этом процессе с передачей энергии механическая энергия культуральной среды переходит в тепловую, повышая ее температуру. В процессе постепенного изменения вихря, когда размер вихря близок к размеру ячейки, вихрь передает энергию ячейке, в результате чего происходит разрыв ячейки. В биореакторе согласно настоящей заявке из-за использования поверхностного переноса кислорода распределитель пузырьков отсутствует, поэтому пузырьков мало, поэтому повреждением, вызванным силой сдвига, вызванным пузырьками, можно пренебречь. Поскольку внутренняя стенка резервуара в биореакторе относительно гладкая, сила сдвига при столкновении также относительно мала. С помощью приведенного выше анализа можно обнаружить, что сила сдвига в биореакторе с турбулентным потоком в основном представляет собой силу сдвига в поле потока. Таким образом, определение среднего значения скорости сдвига в реакторе с помощью моделирования имеет важное значение для проектирования биореактора.

Таблица 7. Изменение средней скорости сдвига в зависимости от скорости вращения каждого реактора рабочего объема Спецификация Рабочий объем (л) Скорость вращения (об/мин) Средняя скорость сдвига (с^-1) Спецификация Рабочий объем (л) Скорость вращения (об/мин) Средняя скорость сдвига (с^-1) CUR2.5L 0.5 45 4.9853 CUR50L 15 40 7.9708 0.5 57 10.1582 15 50 8.9876 0.5 70 20.2738 15 60 9.3835 1.5 45 6.2612 32 40 7.2709 1.5 57 10.9229 32 50 8.7364 1.5 70 19.8577 32 60 9.0551 2.5 45 4.0946 50 40 6.9012 2.5 57 10.8802 50 50 8.2140 2.5 70 17.8340 50 60 8.9004 CUR300L 50 25 4.2551 CUR1200L 150 20 3.8602 50 28 5.9395 150 25 6.2380 50 30 6.7627 150 30 6.2714 175 25 3.9559 675 20 3.2128 175 28 5.2161 675 25 5.4725 175 30 5.7067 675 30 5.8422 300 25 3.3894 1200 20 1.3091 300 28 4.8398 1200 25 4.4204 300 30 5.3338 1200 30 4.9002 CUR3000L 3000 24 3.9816 3000 26 4.4238

Из таблицы 7 видно, что средняя скорость сдвига поля течения жидкости культуральной среды в стационарном состоянии ниже 20,27/с.

Средняя скорость сдвига представляет собой объемную интеграцию скорости сдвига по всей площади поля потока, после чего усредняется. Его расчетная формула следующая,

Как видно из таблицы 7, для CUR2.5L при неизменном рабочем объеме средняя скорость сдвига увеличивается с увеличением частоты вращения осциллятора, и изменение рабочего объема сравнительно мало влияет на среднюю скорость сдвига. Средняя скорость сдвига для CUR1200L намного ниже, чем для CUR2.5L. Хотя средняя скорость сдвига становится меньше, повреждение клеток будет меньше, но скорость сдвига и эффект смешивания взаимно ограничивают друг друга, и чем меньше скорость сдвига, тем хуже эффект смешивания.

Возьмем в качестве примера раковые клетки китайского хомяка (CHO), когда сила сдвига превышает 0,392 Па, то есть скорость сдвига в воде превышает 391,41 с^-1, клетки будут повреждены. Из таблицы 7 видно, что средняя скорость сдвига в реакторе намного ниже, чем скорость сдвига, которая повреждает клетки.

3. Краткий итог

В этом эксперименте в качестве объектов моделирования использовались CUR2.5L, CUR50L, CUR300L, CUR1200L и CUR3000L. Динамическая модель сетки, модель RNG -турбулентности в сочетании с моделью VOF использовались для численного анализа поведения потока жидкости в контейнере при 14 скоростях вращения и 13 рабочих объемах (всего 38 рабочих режимов). Результаты показывают, что:

1. При достижении квазистационарного состояния на форму жидкой фазы явно влияет скорость вращения, и степень изгиба уровня жидкости увеличивается с увеличением скорости вращения;

2. Площадь поверхности раздела газ-жидкость не увеличивается линейно с увеличением скорости вращения, а влияние увеличения скорости вращения на общую площадь поверхности жидкости меняется в зависимости от рабочего объема;

3. На номинальные параметры турбулентности жидкой фазы влияют как скорость вращения, так и рабочий объем. Согласно соотношению между и , можно использовать для аппроксимации силы процесса переноса газ-жидкость;

4. Средняя скорость сдвига увеличивается с увеличением скорости вращения. Хотя средняя скорость сдвига становится меньше и повреждение клеток будет меньше, скорость сдвига и эффект смешивания ограничивают друг друга, а меньшая скорость сдвига означает худший эффект смешивания. Средняя скорость сдвига в реакторе намного ниже вредной для клеток.

Пример осуществления 2. Тест производительности смешивания биореакторной системы.

1. Тест производительности смешивания биореактора CUR5L

1. Экспериментальное проектирование

Смоделируйте среду культивирования клеток в биореакторе, измерьте однородность смешивания материалов в биореакторе при разных рабочих объемах и разных скоростях вращения и проверьте производительность смешивания в реакторе.

Модель оборудования: биореактор CUR5L (JYSS, D1=400 мм, D3=80 мм, H1=149 мм, H2=98 мм), рабочий объем 5 л, раствор, используемый для смешивания, представляет собой буфер PBS, а добавляемый реагент представляет собой 1 моль/л NaOH. Инструмент для тестирования: pH-электрод Mettler.

Содержание измерения: после добавления реагента NaOH в биореактор используйте рН-электрод для измерения времени равномерного перемешивания, чтобы определить время, которое требуется для однородного перемешивания материалов, добавленных в контейнер, в процессе встряхивания реактора. При продолжительном времени для имитации практического применения биореактора, добавленный материал может фактически повлиять на способность культивировать клетки.

В данном эксперименте моделировались условия нормальной культуры клеток в реакторе, задавались три скорости вращения 50 об/мин, 55 об/мин и 60 об/мин соответственно, а также три различных рабочих объема: минимальный рабочий объем 2 л, оптимальный рабочий объем 3,5 л и максимальный рабочий объем 5 л.

2. Подготовка к эксперименту

(1) В среде, соответствующей стандартам GMP, готовят 15 л буфера PBS для использования.

(2) В среде, соответствующей стандартам GMP, в качестве экспериментального стандартного раствора готовят 500 мл раствора NaOH с концентрацией 1 моль/л. После конфигурации его запечатывают в бочке для хранения жидкости объемом 500 мл, чтобы предотвратить ухудшение состояния раствора и влияния на точность эксперимента.

3 Датчик pH размещается на границе раздела в верхней части реактора, чтобы отражать эффективность смешивания путем измерения pH жидкости.

3. Этапы эксперимента

3.1 Биореактор CUR5L рабочим объемом 2 л, эксперименты по перемешиванию при 50, 55 и 60 об/мин.

(1) Сначала добавляют 2 л буфера PBS в реактор, контролируют температуру на уровне 25-27°, устанавливают скорость реактора на 50 об/мин для работы реактора с эксцентрическим расстоянием в 30 мм за счет колебательного движения осциллятора.

(2) После выхода реактора на установившийся режим работы начинают вводить в реактор 3 мл раствора NaOH с концентрацией 1 моль/л из центра окружности непосредственно над реактором. Вводят один раз каждые 5 минут, всего 3 раза.

(3) Скорость реактора устанавливают на 55 об/мин и повторяют шаг (2).

(4) Скорость реактора устанавливают на 60 об/мин и повторяют шаг (2).

3.2 Биореактор CUR5L рабочим объемом 3,5 л, эксперименты по перемешиванию при 50, 55 и 60 об/мин.

Этапы в основном такие же, как в 3.1, за исключением того, что буфер PBS, добавляемый в реактор, составляет 3,5 л, а раствор NaOH с концентрацией 1 моль/л, вводимый в реактор каждый раз, составляет 5 мл.

3.3 Биореактор CUR5L рабочим объемом 5 л, эксперименты по перемешиванию при 50, 55 и 60 об/мин.

Этапы в основном такие же, как в 3.1, за исключением того, что буфер PBS, добавляемый в реактор, составляет 5 л, а раствор NaOH с концентрацией 1 моль/л, вводимый в реактор каждый раз, составляет 10 мл.

Используют датчик pH для отслеживания изменения pH в биореакторе в режиме реального времени и наблюдают за временем, которое требуется двум датчикам для достижения одинакового значения pH, затем получают данные изображения датчика и сообщают их, анализируют время, которое требуется для обнаружения однородного смешивания двумя группами датчиков и определяют эффективность перемешивания реактора.

4. Результаты эксперимента

Эталон стабильности pH раствора: если pH стабилен при определенном значении в течение 10 с и диапазон погрешности составляет ±0,01, значение pH считается стабильным. Время, необходимое для стабилизации pH при каждом условии, обобщены в Таблице 8 ниже.

Таблица 8. Время до стабилизации pH CUR5L при различных рабочих объемах и скоростях вращения Рабочий объем (л)
Время смешивания (с)
Скорость вращения (об/мин) 2 л 3,5 л 5 л 50 об/мин 19 16 25 55 об/мин 20 14 19 60 об/мин 14 15 13

2. Тест производительности смешивания биореактора CUR50L

Используется биореактор CUR50L (JYSS, D1=840 мм, D3=114 мм, H1=280 мм, H2=170 мм), скорость вращения устанавливается на три значения скорости вращения: 38 об/мин, 39 об/мин, и 40 об/мин, а минимальный рабочий объем 15 л, оптимальный рабочий объем 30 л, максимальный рабочий объем 50 л. Эксцентриситет установлен на 40 мм, температура регулируется на уровне 25-27°С.

Метод испытания в основном такой же, как описано выше. При рабочем объеме 15 л в реактор добавляют 15 л буфера PBS и каждый раз вводят в реактор 10 мл 1 моль/л раствора NaOH. При рабочем объеме 30 л в реактор добавляют 30 л буфера PBS и каждый раз вводят в реактор 30 мл 1 моль/л раствора NaOH. При рабочем объеме 50 л в реактор добавляют 50 л буфера PBS и каждый раз вводят в реактор 50 мл 1 моль/л раствора NaOH. Результаты обобщены в таблице 9.

Таблица 9. Время стабилизации pH CUR50L при различных рабочих объемах и скоростях вращения Рабочий объем (л)
Время смешивания (с)
Скорость вращения (об/мин) 15 л 30 л 50 л 38 об/мин 50 52 72 39 об/мин 35 34 142 40 об/мин 32 41 101

3. Тест производительности смешивания биореактора CUR500L.

Используется биореактор CUR500L (JYSS, D1=1690 мм, D3=190 мм, H1=452 мм, H2=347 мм), скорость вращения установлена на три значения скорости вращения: 25 об/мин, 27 об/мин, 29 об/мин и минимальный рабочий объем 100 л, оптимальный рабочий объем 300 л, максимальный рабочий объем 500 л. Эксцентриситет установлен на 65 мм, температура регулируется на уровне 25-27°С.

Метод испытания в основном такой же, как описано выше. При рабочем объеме 100 л в реактор добавляют 100 л буфера PBS и каждый раз вводят в реактор 50 мл раствора NaOH с концентрацией 1 моль/л. При рабочем объеме 300 л в реактор добавляют 300 л буфера PBS и каждый раз вводят в реактор 100 мл раствора NaOH с концентрацией 1 моль/л. При рабочем объеме 500 л в реактор добавляют 500 л буфера PBS и каждый раз вводят в реактор 100 мл раствора NaOH с концентрацией 1 моль/л. Результаты обобщены в таблице 10.

Таблица 10. Время стабилизации pH CUR500L при различных рабочих объемах и скоростях вращения Рабочий объем (л)
Время смешивания (с)
Скорость вращения (об/мин) 100 л 300 л 500 л 25 об/мин 86 82 90 25 об/мин 97 62 80 25 об/мин 40 94 70

4. Тест производительности смешивания биореактора CUR1200L.

Используется биореактор CUR1200L (JYSS, D1=1952 мм, D3=190 мм, H1=533 мм, H2=465 мм), скорость вращения установлена на три значения скорости вращения: 23 об/мин, 25 об/мин, 27 об/мин и минимальный рабочий объем 300 л, оптимальный рабочий объем 800 л, максимальный рабочий объем 1200 л. Эксцентриситет установлен на 65 мм, а температура регулируется на уровне 25-27°С.

Метод испытания в основном такой же, как описано выше. При рабочем объеме 300 л в реактор добавляют 300 л буфера PBS и каждый раз вводят в реактор 100 мл 1 моль/л раствора NaOH. При рабочем объеме 800 л в реактор добавляют 800 л буфера PBS и каждый раз вводят в реактор 800 мл 1 моль/л раствора NaOH. При рабочем объеме 1200 л в реактор добавляют 1200 л буфера PBS и каждый раз вводят в реактор 500 мл раствора NaOH с концентрацией 2 моль/л. Результаты обобщены в таблице 11.

Таблица 11. Время стабилизации pH CUR1200L при различных рабочих объемах и скоростях вращения Рабочий объем (л)
Время смешивания (с)
Скорость вращения (об/мин) 300 л 800 л 1200 л 23 об/мин 56 110 679 25 об/мин 49 253 174 27 об/мин 55 257 72

Как показано в таблице 8-таблице 11, эффективность смешивания этого устройства может полностью удовлетворить требования к смешиванию и массопереносу в процессе крупномасштабного культивирования клеток.

Пример осуществления 3. Культивирование клеток MDCK

Культивирование клеток MDCK проводили с использованием биореакторов CUR5L, CUR50L, CUR500L и CUR1200L, использованных в примере осуществления 2. Плотность инокуляции клеток - 1,5×10⁶ клеток/мл, культуральная среда - CD MDCK SFM (DP304, Jianshun Bioscience), температура культивирования - 37°C, значение DO% растворенного кислорода - 35-65.

Реактор CUR5L установлен с рабочим объемом 5 л, скорость вращения 55 об/мин, эксцентриситет 30 мм, скорость подачи кислорода и воздуха установлены на 100 мл/мин и 200 мл/мин соответственно. Реактор CUR50L установлен на рабочий объем 50 л, скорость вращения 40 об/мин, эксцентриситет 40 мм, скорость подачи кислорода и воздуха установлены на 500 мл/мин и 500 мл/мин соответственно. Реактор CUR500L был установлен на рабочий объем 500 л, скорость вращения 28 об/мин, эксцентриситет 65 мм, а скорости подачи кислорода и воздуха установлены на 900 мл/мин и 1000 мл/мин соответственно. Реактор CUR1200L установлен на рабочий объем 1200 л, скорость вращения 25 об/мин, эксцентриситет 65 мм, скорости подачи кислорода и воздуха установлены на 1500 мл/мин и 1500 мл/мин соответственно.

При культивировании клеток в течение 48 часов в реакционную систему за один раз добавляют 2 г/л глюкозы, а концентрация раствора глюкозы составляет 200 г/л. Кроме того, значение рН биореактора устанавливают в диапазоне 7,0~7,4. Когда система обнаружит, что значение pH ниже 7,0, система автоматически добавит NaHCO₃ с концентрацией 7,5%.

Данные о культивировании клеток обобщены в Таблице 12 ниже.

Таблица 12. Данные о культивировании клеток MDCK Спецификация оборудования Время культивирования (ч) Начальный объем культуральной среды (л) Плотность клеток (×10⁶/мл) Выживаемость клеток (%) Общее потребление кислорода (л) CUR5L 0 5 л 1.50 99.2 4.7 24 3.00 99.5 48 5.30 99.2 72 8.20 99.4 CUR50L 0 50 л 1.50 99.4 49 24 2.90 99.3 48 6.00 99.5 72 7.80 99.6 CUR500L 0 500 л 1.50 99.4 438 24 2.40 99.2 48 4.80 99.8 72 7.47 99.6 CUR1200L 0 1200 л 1.50 99.5 2850 24 2.30 99.2 48 5.20 99.6 72 7.30 99.4

Из таблицы 12 видно, что при культивировании клеток, несмотря на постоянное увеличение плотности клеток, выживаемость клеток оставалась выше 99,0%.

Пример осуществления 4. Культивирование клеток СНО

1. Биореактор CUR300L для культивирования клеток CHO

Биореактор CUR300L (JYSS, D1=1500 мм, D3=190 мм, H1=422 мм, H2=303 мм), сконструированный для этой заявки, используется для культивирования клеток СНО в процессе периодического культивирования клеток с подпиткой (Fed-batch). Где скорость вращения реактора 30 об/мин, эксцентриситет 60 мм, начальный объем культуральной среды 200 л, 205 л и 250 л соответственно, температура поддерживается на уровне 37°, а скорость подачи кислорода и воздух устанавливаются на 800 мл/мин и 800 мл/мин соответственно. Исходной культуральной средой является специальная культуральная среда CHO компании Gansu Jianshun Biosciences Co., ltd. на четвертый день культивирования, дополненной культуральной средой является CD Feed002 компании Gansu Jianshun Biosciences Co., ltd.

Плотность инокуляции клеток СНО составляла около 1,0×10⁶/мл, добавляют 5%, 2%, 5% и 2% от текущего рабочего объема CD Feed002 соответственно на 4-й, 6-й, 8-й и 10-й сутки. Когда уровень глюкозы ниже 2,0 г/л, добавляют раствор глюкозы до 8,0 г/л и устанавливают значение pH в диапазоне 7,0~7,2. Когда значение pH ниже 7,0, система автоматически добавит NaHCO₃ с концентрацией 7,5%. Культивирование длится 14 дней. Плотность роста клеток, выживаемость, осмотическое давление, парциальное давление кислорода, парциальное давление углекислого газа и экспрессию белка наблюдают ежедневно. Плотность клеток и их выживаемость во время культивирования записаны в таблице 13.

Таблица 13. Данные о культивировании клеток СНО Время культивирования (ч) Начальный объем культуральной среды (л) Плотность клеток (×10⁶/мл) Выживаемость клеток (%) Начальный объем культуральной среды
(л) Плотность клеток (×10⁶/мл) Выживаемость клеток (%) Начальный объем культуральной среды
(л) Плотность клеток (×10⁶/мл) Выживаемость клеток (%) 0 200 л 0.99 95.9 205 л 0.96 97.8 250 л 1.19 98.7 24 1.36 96.3 1.57 98.7 2.13 98.8 48 3.97 97.0 3.22 98.5 4.28 99.2 72 6.82 98.1 5.94 99.1 7.75 98.8 96 10.70 98.8 9.00 97.8 13.07 99.2 120 14.70 97.2 13.90 98.6 16.45 98.9 144 15.70 97.7 14.60 98.7 19.12 98.9 168 14.30 97.1 14.00 97.7 19.09 98.1 192 14.50 95.6 13.70 98.1 18.58 97.5 216 13.50 96.8 13.20 98.2 16.77 96.8 240 13.30 95.3 12.50 98.5 15.17 94.0 264 11.20 94.2 12.00 97.5 16.02 96.5 288 11.60 95.7 11.60 98.3 14.77 91.5 312 11.40 93.3 11.50 96.1 14.73 96.0 336 11.20 96.6 10.80 96.4 15.49 96.0

На 14-й день объем культивирования достиг 247 л, 256 л и 312 л соответственно, а конечная экспрессия белка достигла 1,133 г/л, 1,594 г/л и 1,311 г/л. В течение всего процесса культивирования максимальная плотность клеток достигала 15,49×10⁶ клеток/мл, при этом клетки всегда имели высокую выживаемость и высокий период экспрессии белка, и результаты были наилучшими.

2. Биореактор CUR1200L для культивирования клеток CHO

Биореактор CUR1200 L (JYSS, D1=1952 мм, D3=190 мм, H1=533 мм, H2=465 мм) используют для культивирования клеток CHO с подпиткой. Скорость реактора установлен на 30 об/мин, рабочий объем составляет 250 л и 330 л, эксцентриситет установлен на 65 мм, а температуру поддерживают на уровне 37°С. Скорость подачи кислорода и воздуха была установлена на уровне 1500 мл/мин и 1500 мл/мин соответственно. Исходной культуральной средой является специальная культуральная среда CHO компании Gansu Jianshun Biosciences Co., ltd. на четвертый день культивирования, дополненной культуральной средой является CD Feed002 компании Gansu Jianshun Biosciences Co., ltd.

Плотность инокуляции составляет около 1×10⁶/мл, на 4, 6, 8 и 10 сутки добавляют 5%, 2%, 5% и 2% от текущего рабочего объема CD Feed002, а при снижении уровня глюкозы ниже 2,0 г/л, добавляют к раствору глюкозы до 8,0 г/л, значение pH установлено в диапазоне 7,0-7,2. Когда значение pH ниже 7,0, система автоматически добавляет NaHCO₃ с концентрацией 7,5%. Культивирование длится 14 дней. Плотность роста клеток, выживаемость, осмотическое давление, парциальное давление кислорода, парциальное давление углекислого газа и экспрессию белка наблюдают ежедневно. Плотность клеток и их выживаемость во время культивирования записаны в таблице 14.

На 14-й день объем культивирования достиг 314 л и 417 л соответственно, а конечная экспрессия белка достигла 1,481 г/л и 1,308 г/л. В течение всего процесса культивирования максимальная плотность клеток достигала 18,51×10⁶/мл, при этом клетки всегда имели высокую выживаемость и высокий период экспрессии белка, и результаты были наилучшими.

Таблица 14. Данные о культивировании клеток CHO Время культивирования (ч) Начальный объем культуральной среды (л) Плотность клеток (×10⁶/мл) Выживаемость клеток (%) Начальный объем культуральной среды (л) Плотность клеток (×10⁶/мл) Выживаемость клеток (%) 0 250 л 1.09 99.1 330 л 1.19 99.2 24 2.11 99.0 2.36 98.6 48 5.51 98.6 4.90 98.9 72 9.12 98.4 9.22 98.9 96 15.25 98.7 14.38 98.9 120 19.71 98.2 20.45 99.2 144 20.01 97.4 23.38 98.9 168 18.47 95.0 24.37 97.9 192 17.26 93.5 21.49 96.3 216 18.45 96.2 20.02 95.5 240 17.42 92.8 18.14 94.6 264 17.32 96.1 19.81 94.4 288 16.50 93.0 18.22 94.7 312 16.83 95.3 18.47 94.7 336 15.40 91.3 18.51 93.6

3. Биореактор CUR50L для культивирования клеток CHO

Биореактор CUR50L, сконструированный для этой заявки (JYSS, D1=1500 мм, D3=190 мм, H1=422 мм, H2=303 мм), используется для культивирования клеток СНО с помощью перфузионного (Perfusion) метода культивирования клеток ATF, где скорость вращения биореактора составляет от 37 об/мин (день 1-8) до 39 об/мин (день 9-20), рабочий объем 18 л, эксцентриситет 40 мм, а температура поддерживается на уровне 37°. Скорости введения кислорода и воздуха установлены 500мл/мин и 500мл/мин соответственно. Исходной культуральной средой является специальная культуральная среда CHO компании Gansu Jianshun Biosciences Co., ltd. на 11-ый день культивирования, дополненной культуральной средой является CD Feed компании Gansu Jianshun Biosciences Co., ltd.

Таблица 15. Данные о культивировании клеток CHO Время культивирования (ч) Извлекаемый/добавляемый объем (л) Плотность клеток (×10⁶/мл) Выживаемость клеток (%) Время культивирования (ч) Извлекаемый/добавляемый объем (л) Плотность клеток (×10⁶/мл) Выживаемость клеток (%) 0 0 1.1 97.8 264 54 70.9 99.2 24 0 1.4 97.4 288 54 84.9 99.1 48 54 2.4 98.6 312 54 84.6 98.3 72 54 3.7 98.3 336 54 86.7 98.6 96 54 5.5 98.1 360 54 88.5 98.7 120 54 8.2 98.4 384 54 89.4 98.7 144 54 12.6 98.9 408 54 90.1 98.9 168 54 18.1 98.6 432 54 82.7 98.7 192 54 34.3 98.8 456 54 76.8 98.6 216 54 43.7 99.2 480 72.2 98.6 240 54 56.6 99.0

Плотность инокуляции около 1×10⁶/мл, отбирают часть культуральной среды через ATF-4 на 12-20-е сутки и добавляют такой же объем культуральной среды. Концентрацию глюкозы в культуральной системе поддерживают на уровне не менее 3,0 г/л, а значение рН устанавливают в пределах 7,0~7,2. Когда значение pH ниже 7,0, система автоматически добавит NaHCO3 с концентрацией 7,5%. Культивирование клеток длится 20 дней. Каждый день наблюдают плотность, выживаемость, диаметр, осмотическое давление, остаточную молочную кислоту и экспрессию белка роста клеток. Плотность клеток и их выживаемость во время культивирования записаны в таблице 15.

На 20-й день объем культивирования при сборе резервуара составил 14 л, а конечная экспрессия белка достигла 27 г, что превзошло ожидания. В течение всего процесса культивирования максимальная плотность клеток достигала 90,1×10⁶/мл, при этом клетки сохраняли высокую степень выживаемости (более 97%).

Из приведенного выше видно, что при использовании биореактора, сконструированного в соответствии с настоящей заявкой, и выборе подходящей скорости вращения и эксцентриситета, культивирование клеток осуществляется успешно, плотность клеток постепенно увеличивается, а выживаемость клеток поддерживается на высоком уровне, например, более 90,0%. Видно, что биореакторная система по данной заявке подходит для культивирования клеток животных с высокой плотностью.

Группа изобретений относится к биореакторной системе для культивирования клеток без клеточных стенок и к способу культивирования клеток с использованием биореакторной системы. Биореакторная система включает: контейнер; осциллятор; вентиляционные средства, предназначенные для подачи кислородсодержащего газа в контейнер из верхней части контейнера, и культуральную среду, заливаемую в контейнер. Контейнер содержит полый цилиндр диаметром D1 и высотой H1, а также полый круглый конус с верхним диаметром D2, нижним диаметром D3 и высотой Н2, при этом полый цилиндр соединен с верхней поверхностью полого круглого конуса, D1=D2. Осциллятор содержит подвижную платформу и двигатель, приводящий в движение платформу. Контейнер закреплен на указанной платформе осциллятора таким образом, чтобы обеспечить возможность эксцентричного движения контейнера с определенным эксцентриситетом и скоростью вращения. Заявленная группа изобретений обеспечивает стабильный рост и пролиферацию клеток, а также высокую выживаемость клеток. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 ил., 15 табл., 4 пр.

1. Биореакторная система для культивирования клеток без клеточных стенок, включающая в себя:

- контейнер, содержащий полый цилиндр диаметром D1 и высотой H1, а также полый круглый конус с верхним диаметром D2, нижним диаметром D3 и высотой Н2, при этом полый цилиндр соединен с верхней поверхностью полого круглого конуса, D1=D2;

- осциллятор, содержащий подвижную платформу и двигатель, приводящий в движение платформу, при этом контейнер закреплен на указанной платформе осциллятора таким образом, чтобы обеспечить возможность эксцентричного движения контейнера с определенным эксцентриситетом и скоростью вращения;

- вентиляционные средства, предназначенные для подачи кислородсодержащего газа в контейнер из верхней части контейнера, и

- культуральная среда, которая заливается в контейнер, верхняя поверхность которой подвергается воздействию кислородсодержащего газа,

при этом осциллятор устроен таким образом, чтобы контейнер двигался эксцентрично, так что отношение (S/V) общей площади поверхности жидкости культуральной среды при стационарном движении к объему составляет более 5,65, турбулентная кинетическая энергия составляет более 2,73Е-03 м²/с², а скорость сдвига поля течения менее 20,27/с, при этом общая площадь поверхности жидкости культуральной среды представляет собой сумму площади контакта между культуральной средой и стенкой реактора и площади контакта между культуральной средой и газом.

2. Биореакторная система по п. 1, отличающаяся тем, что отношение (S/V) общей площади поверхности жидкости культуральной среды при стационарном движении к объему, турбулентная кинетическая энергия и скорость сдвига поля течения рассчитаны посредством CFD-моделирования, причем указанное CFD-моделирование реализовано с помощью программного обеспечения CFD.

3. Биореакторная система по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит одноразовый культуральный мешок для содержания культуральной среды, расположенный в контейнере, который имеет форму, соответствующую контейнеру в развернутом виде.

4. Биореакторная система по п. 3, отличающаяся тем, что одноразовый культуральный мешок содержит многофункциональную накладку, при этом многофункциональная накладка снабжена множеством соединительных отверстий, ведущих внутрь одноразового культурального мешка.

5. Биореакторная система по п. 1, отличающаяся тем, что D1 и D2 контейнера 400-2997 мм, D3 80-190 мм, H1 149-867 мм, Н2 98-664 мм, вмещающая 5-3000 л культуральной жидкости, скорость вращения осциллятора 55-24 об/мин и эксцентриситет 30-65 мм.

6. Биореакторная система по п. 1, отличающаяся тем, что Din D2 контейнера составляет около 400 мм, D3 составляет около 80 мм, H1 составляет около 149 мм, Н2 составляет около 98 мм, составляет около 5 л культуральной жидкости, скорость вращения осциллятора составляет около 55 об/мин, а эксцентриситет составляет около 30 мм, где термин «около» относится к диапазону ±20% значения.

7. Биореакторная система по п. 1, отличающаяся тем, что D1 и D2 контейнера составляют около 840 мм, D3 составляет около 114 мм, H1 составляет около 280 мм, Н2 составляет около 170 мм, составляет около 50 л культуральной жидкости, скорость вращения осциллятора составляет около 40 об/мин, а эксцентриситет составляет около 40 мм, где термин «около» относится к диапазону ±20% значения.

8. Биореакторная система по п. 1, отличающаяся тем, что D1 и D2 контейнера составляют около 1690 мм, D3 составляет около 190 мм, H1 составляет около 452 мм, Н2 составляет около 347 мм, составляет около 500 л культуральной жидкости, скорость вращения осциллятора составляет около 28 об/мин, а эксцентриситет составляет около 65 мм, где термин «около» относится к диапазону ±20% значения.

9. Биореакторная система по п. 1, отличающаяся тем, что D1 и D2 контейнера составляют около 1952 мм, D3 около 190 мм, Н1 около 533 мм, Н2 около 465 мм, составляет около 1200 л культуральной жидкости, скорость вращения осциллятора составляет около 25 об/мин, а эксцентриситет составляет около 65 мм, где термин «около» относится к диапазону ±20% значения.

10. Способ культивирования клеток без клеточных стенок с использованием биореакторной системы по п. 1, в которой D1 и D2 контейнера составляют 400-4000 мм, D3 составляет 40-400 мм, H1 составляет 100-1500 мм, а Н2 составляет 40-1200 мм, при этом согласно способу:

- с помощью моделирования CFD в зависимости от формы биореакторной системы и объема культуральной среды рассчитывают скорость и эксцентриситет осциллятора, необходимые для отношения общей площади поверхности жидкости культуральной среды при стационарном движении к объему жидкости (S/V), должны быть более 5,65, турбулентная кинетическая энергия должна быть более 2.73Е-03 м²/с², а скорость сдвига поля потока должна быть менее 20,27/с; при этом общая площадь поверхности жидкости культуральной среды представляет собой сумму площади контакта между культуральной средой и стенкой реактора и площади контакта между культуральной средой и газом; а также

- добавляют культуральную среду и инокулируют клетки в биореакторную систему и устанавливают осциллятор в соответствии с расчетной скоростью осциллятора и эксцентриситетом для реализации культивирования клеток.