Низкотоксичная фармацевтическая композиция с противоопухолевой активностью в отношении холангиокарциномы Российский патент 2024 года по МПК A61K36/14 A61K36/15 A61K36/23 A61K36/285 A61K36/41 A61K36/48 A61K36/61 A61K47/44 A61P35/00 

Область изобретения

Изобретение относится к области экспериментальной онкологии и медицины, касается создания фармацевтической композиции биологически активных соединений растительного происхождения с противоопухолевой активностью в отношении холангиокарциномы. Изобретение может найти применение в клинической онкологии.

Предшествующий уровень техники

Несмотря на развитие и усовершенствование терапевтических методов, онкологическое заболевание остается одной из основных причин смертности во всем мире. Холангиокарцинома - агрессивный рак гепатобилиарноп системы, связанный с плохим прогнозом и низкой выживаемостью, в первую очередь из-за поздней диагностики и низкой частоты ответа на химиотерапию. Таким образом, существует острая необходимость повышения эффективности терапевтических стратегий, которые могут улучшить результаты лечения пациентов [Rizvi S., Khan S.A., Hallemeier C.L., Kelley R.K., Gores G.J. Cholangiocarcinoma - evolving concepts and therapeutic strategies. // Nat Rev Clin Oncol. - 2018. - Vol. 15. - N 2. - P. 95-111].

В настоящее время наблюдается большой интерес к биоактивным компонентам растительного происхождения в качестве потенциальных химиопрофилактических и терапевтических средств в онкологии как при отдельном применении так и в сочетании с уже известными и постоянно обновляемыми химиотерапевтическими средствами. Химические соединения, полученные из лекарственных растений, например, фенольные соединения (простые фенолы, флавоноиды, фенольные кислоты, дубильные вещества и др.), терпеноиды (моно-, дитерпеноиды, тритерпеновые сапонины и др.), полисахариды проявляют цитотоксический, антипролиферативный эффект в отношении опухолевых клеток. Обладают антиоксидантной, противовоспалительной, антимутагенной активностью [Kubczak М., Szustka A., Rogalińska М. Molecular targets of natural compound with anticancer properties. Int J Mol Sci. - 2021. - Vol. 22. - N 24:13659; Khan A.W., Farooq M., Haseeb M., Choi S. Role of plant-derived active constituents in cancer treatment and their mechanisms of action. Cells. - 2022. - Vol. 13. - N 8. - P. 1326-1330].

Перспективным направлением применения биоактивных компонентов растительного происхождения в онкологии считают рациональное сочетание структурно разнообразных веществ, относящихся к различным классам соединений, и создание на этой основе фармацевтических композиций с улучшенным профилем безопасности [Gupta J., Ahuja A., Gupta R. Green approaches for cancers management: an effective tool for health care. Anticancer Agents Med Chem. 2022, 22 (1): 101-114].

Из уровня техники известны изобретения на основе комбинаций биологически активных соединений, выделенных из растений, в качестве средств профилактики и лечения онкозаболеваний.

В частности, известна фармкомпозиция, в состав которой входят биологически активные соединения, выделенные из экстрактов лекарственных растений: апигенин, арбутин, гиперозид, глицирризиновая кислота, кверцетин, лютеолин, нарингенин, аланин, аспарагиновая кислота, аргинин, глютаминовая кислота, пролин, тирозин, гинзенозид Rb1, гинзенозид Rb2, гинзенозид Rc, гинзенозид Rd, гинзенозид Re, гинзенозид Rq1, аралозид А, аралозид В, аралозид С, элеутерозид А, элеутерозид В, элеутерозид С, элеутерозид Е, салидрозид, розавин, розиридин, родионин, схизандрин, схизантерин при определенных соотношениях [патент RU 2477142 С2, опубл. 10.03.2013]. Данная композиция направлена на предотвращение мутаций ДНК и может быть использована в клинической практике для профилактики и лечения онкологических больных.

Из уровня техники известен патент RU 2747147 С1, опубл. 28.04.2021, который раскрывает фармацевтическую композицию, проявляющую цитотоксичность в отношении клеток карциномы толстой кишки человека. Фармацевтическая композиция представляет собой масляный раствор, содержащий альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен, 1,8-цинеол, сабинен, абиетиновую кислоту, гинзенозиды Re, Rb1, Rg2, флороглюцин, усниновую кислоту и растительное масло.

Однако в литературе отсутствуют сведения, касающиеся фармацевтических композиций на основе биологически активных соединений растений, проявляющих противоопухолевую активность в отношении холангиокарциномы.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено изобретение, является улучшение качественного и количественного состава фармацевтической композиции на основе биоактивных компонентов растений для обеспечения противоопухолевой активности в отношении холангиокарциномы при ее уменьшенной токсичности.

Технический результат достигается тем, что предложена фармацевтическая композиция с противоопухолевой активностью в отношении холангиокарциномы, характеризующаяся тем, что она представляет собой масляный раствор, содержащий гинзенозиды Re, Rb2, Rg2, альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен 1,8-цинеол, сабинен, родионин, кверцетин, лютеолин при следующем содержании компонентов, мг/л:

гинзенозид Re 370-390 гинзенозид Rb2 330-350 гинзенозид Rg2 420-440 альфа-пинен 240-260 бета-пинен 200-220 бета-мирцен 230-250 1,8-цинеол 280-300 сабинен 180-200 родионин 380-400 кверцетин 480-500 лютеолин 440-460 растительное масло остальное

Преимуществом данного изобретения является то, что предложенный комплекс биологически активных соединений растительного происхождения, включающий тритерпеновые сапонины (гинзенозиды Re, Rg2, Rb2), монотерпены (альфа-пиней, бета-пинен, бета-мирцен, 1,8-цинеол, сабинен), флавоноиды (родионин, кверцетин, лютеолин), при заявленном содержании компонентов обладает низкой токсичностью и обеспечивает противоопухолевую эффективность в отношении холангиокарциномы.

Биологически активные соединения, входящие в состав фармацевтической композиции, могут быть выделены из растительного сырья известными физико-химическими методами.

В качестве растительного сырья могут быть использованы плоды можжевельника обыкновенного (Juniperus communis L.), кориандра посевного (Coriandrum sativum L.), листья эвкалипта прутовидного (Eucalyptus viminalis Labill.), трава тимьяна ползучего (Thymus serpyllum L.), почки березы повислой (Betula Pendula Roth.,), различные части сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), корень женьшеня настоящего (Panax ginseng) и другие растения, содержащие активные соединения, входящие в формулу изобретения.

В таблице 1 представлен перечень и характеристика биологически активных соединений заявляемой фармацевтической композиции.

Биологически активные соединения, входящие в состав заявляемой фармацевтической композиции, обладают широким спектром фармакологического действия.

Гинзенозиды Re, Rg2, альфа-пинен, 1,8-цинеол, кверцетин, лютеолин оказывают антипролиферативный эффект, индуцируют апоптоз опухолевых клеток, подавляя экспрессию антиапоптотических белков, например, Bcl-2 и Bcl-xL, и усиливая экспрессию проапоптотических ферментов каспазы-3 и -9 [Gao X.Y., Liu G.C., Zhang J.X. et al. Pharmacological properties of ginsenoside Re. // Front Pharmacol. - 2022. - N 13: 754191; Teekaraman D., Elayapillai S.P., Viswanathan M.P., Jagadeesan A. Quercetin inhibits human metastatic ovarian cancer cell growth and modulates components of the intrinsic apoptotic pathway in PA-1 cell line. // Chem. Biol. Interact. - 2019. - Vol. 300. - P. 91-100; Verma S., Singh A., Kumari A. et al. Natural polyphenolic inhibitors against the antiapoptotic BCL-2. // J Recept Signal Transduct Res. - 2017. - Vol. 37. - №4. - P. 391-400; Jeon H., Jin Y., Myung C.S., Heo K.S. Ginsenoside-Rg2 exerts anti-cancer effects through ROS-mediated AMPK activation associated mitochondrial damage and oxidation in MCF-7 cells. // Arch Pharm Res. - 2021. - Vol. 44. - N. - 7. - P. 702-712].

Кверцетин, лютеолин, гинзенозид Rg2 способны подавлять рост малигнизированных клеток, прерывая клеточный цикл в фазе G0/G1 [Lin С.Н., Chang C.Y., Lee K.R. et al. Flavones inhibit breast cancer proliferation through the Akt/FOXO3a signaling pathway. // BMC Cancer. - 2015. - Vol. 15. - P. 958; Jeon H., Jin Y., Myung C.S., Heo K.S. Ginsenoside-Rg2 exerts anticancer effects through ROS-mediated AMPK activation associated mitochondrial damage and oxidation in MCF-7 cells. // Arch Pharm Res. - 2021. - Vol. 44. - N. - 7. - P. 702-712].

У флавоноидов кверцетина и лютеолина обнаружены антиангиогенные эффекты, связанные с подавлением сосудистых ростовых факторов (VEGF), а также экспрессии матриксных металлопротеиназ 2 и 9 [Yao X., Jiang W., Yu D., Yan Z. Luteolin inhibits proliferation and induces apoptosis of human melanoma cells in vivo and in vitro by suppressing MMP-2 and MMP-9 through the PI3K/AKT pathway. // Food Funct. - 2019. - Vol. 10. - №2. - P. 703-712].

Кверцетин уменьшает повреждение ДНК in vitro при воздействии генотоксичных агентов; ингибирует синтез шаперона Hsp70 in vitro, индуцируя апоптоз [Li Н., Chen С. Quercetin Has Antimetastatic Effects on Gastric Cancer Cells via the Interruption of uPA/uPAR Function by Modulating NF-kappab, PKC-delta, ERK1/2, and AMPKalpha. // Integr Cancer Ther. - 2018. - Vol. 17. - №2. - P. 511-523; Storniolo A., Raciti M., Cucina A. et al. Quercetin affects Hsp70ARE1α mediated protection from death induced by endoplasmic reticulum stress. // Oxid Med Cell Longev. - 2015. - 2015. - P. 645157].

Для большинства соединений (гинзенозиды Re, Rb2, Rg2, кверцетин, лютеолин, альфа/бета-пинены, бета-мирцен, 1,8-цинеол, сабинен), входящих в состав заявляемой фармацевтической композиции показаны противовоспалительные свойства в исследованиях in vivo и in vitro. Механизм противовоспалительной активности включает ингибирование экспрессии фактора транскрипции NF-κВ, блокировку медиаторов воспаления, таких как ИЛ-6, ИЛ-8, фактор некроза опухоли-α, и провоспалительных ферментов, в частности, циклооксигеназы-2 [Su F., Xue Y., Wang Y. et al. Protective Effect of Ginsenosides Rg1 and Re on Lipopolysaccharide-Induced Sepsis by Competitive Binding to Toll-like Receptor 4. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2015. - Vol. 59. - N 9. - P. 5654-5663; Jain H., Dhingra N., Narsinghani Т., Sharma R. Insights into the mechanism of natural terpenoids as NF-κВ inhibitors: an overview on their anticancer potential. // Exp. Oncol. - 2016. - Vol. 38. - N 3. - P. 158-168; Lee C.W., Song K.H., Kim Y.S., Kim H.P. Ginsenosides from Korean Red Ginseng ameliorate lung inflammatory responses: inhibition of the MAPKs/NF-κB/c-Fos pathways. // J Ginseng Res. - 2018. - Vol. 42. - N. 4. - P. 476-484].

Вещества, входящие в формулу изобретения, такие как мирцен, цинеол, гинзенозиды Rb2 и Rg2, флавоноиды родионин, кверцетин, лютеолин проявляют антиоксидантную активность. Их антиоксидантный потенциал может быть связан с различными механизмами, включая разрушение пероксидов и хелатирование ионов металлов, которые катализируют процесс окисления; активацию ядерного эритроид-связанного транскрипционного фактора Nrf2, стимулирующего экспрессию антиоксидантных ферментов глутатиона, каталазы и глутатионпероксидазы [Ciftci О., Ozdemir I., Tanyildizi S., Yildiz S., Oguzturk H. Antioxidative effects of curcumin, β-myrcene and 1,8-cineole against 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced oxidative stress in rats liver. Toxicol Ind Health 2011; 27(5):447-53; Shaukat A., Yang C, Yang Y., Guo Y.F. et al. Ginsenoside Rb 1: A novel therapeutic agent in Staphylococcusaureus-induced Acute Lung Injury with special reference to Oxidative stress and Apoptosis. // Microb Pathog. 2020 12; 143:104109; Chen C.F., Chiou W.F., Zhang J.T. Comparison of the pharmacological effects of Panax ginseng and Panax quinquefolium. // Acta Pharmacol. Sin. - 2008. - Vol. 29. - N. 9. - P. 1103-1108; Shanmugam M.K., Lee J.H., Chai E.Z. et al. Cancer prevention and therapy through the modulation of transcription factors by bioactive natural compounds. // Semin Cancer Biol. - 2016. - Vol. 40-41. - P. 35-47].

По имеющимся у авторов сведениям, совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, неизвестна и не следует из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «Новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения - предложенная совокупность признаков, не следует для специалиста явным образом из известного уровня техники, и в публикациях на дату подачи отсутствуют данные о достижении упомянутого полученного технического результата, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «Изобретательский уровень».

Реализация изобретения не представляет трудностей, основана на известных базовых исследовательских процессах, которые к настоящему времени хорошо разработаны и широко применяются. Предложение удовлетворяет критерию «промышленная применимость».

Краткое описание чертежей

Настоящее изобретение поясняется фиг. 1-11.

На фиг. 1 представлена динамика объема холангиокарциномы РС-1 при трансдермальном воздействии заявленной фармацевтической композиции (далее по тексту - ФармК) с составом по примеру 3, соответственно ФармК3, начиная с 72 ч после прививки опухоли.

На фиг. 2 показаны микрофотографии среза холангиокарциномы. Окраска гематоксилином-эозином. А (Ув. 64), Б (Ув. 246), В (Ув. 246) - на 14 день после трансдермального воздействия ФармК3, начатого через 72 часа после прививкии опухоли; Г (Ув. 246) - в этот же срок у контрольных животных.

На фиг. 3 представлена динамика объема холангиокарциномы РС-1 при трансдермальном воздействии ФармК3, начиная с 20 дня после прививки опухоли (на развившуюся опухоль).

На фиг. 4 показаны микрофотографии среза холангиокарциномы. Окраска гематоксилином-эозином. А (Ув. 64), Б (Ув. 246), В (Ув. 246) - на 14 день после трансдермального воздействия ФармК3, начатого на 20 день после прививки опухоли (на развившуюся опухоль); Г (Ув. 246) - в этот же срок у контрольных животных.

На фиг. 5 представлены микрофотографии печени (а) и почки (б) крысы через 14 дней после перорального введения ФармК3 в дозе 5 мл/кг.

На фиг. 6 показаны микрофотографии легких крысы через 14 дней после перорального введения ФармК3 в дозе 5 мл/кг.

На фиг. 7 отражены микрофотографии миокарда крысы через 14 дней после перорального введения ФармК3 в дозе 5 мл/кг.

На фиг. 8 показаны микрофотографии селезенки крысы через 14 дней после перорального введения ФармК3 в дозе 5 мл/кг.

На фиг. 9 представлены микрофотографии печени (а) и почки (б) крысы через 14 дней после перорального введения ФармК3 в дозе 20 мл/кг.

На фиг. 10 показаны микрофотографии легких крысы через 14 дней после перорального введения ФармК3 в дозе 20 мл/кг.

На фиг. 11 отражены микрофотографии миокарда (а) и селезенки (б) крысы через 14 дней после перорального введения ФармК3 в дозе 20 мл/кг.

Варианты осуществления изобретения

Для подтверждения возможности осуществления изобретения представлены примеры №№1-3 различного состава заявляемой ФармК, и примеры №№4-6 проведенных исследований по оценке биологической (противоопухолевой) активности в отношении холангиокарциномы РС-1 и острой токсичности.

Пример 1

ФармК1 - масляный раствор, содержащий гинзенозиды Re, Rb2, Rg2, альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен 1,8-цинеол, сабинен, родионин, кверцетин, лютеолин при следующем содержании компонентов, мг/л:

гинзенозид Re 370 гинзенозид Rb2 330 гинзенозид Rg2 420 альфа-пинен 240 бета-пинен 200 бета-мирцен 230 1,8-цинеол 280 сабинен 180 родионин 380 кверцетин 480 лютеолин 440 льняное масло остальное

Входящие в состав ФармК1 вещества в обозначенном выше количестве растворяют в 1 л льняного масла.

Пример 1-1

ФармК1-1 - масляный раствор, содержащий гинзенозиды Re, Rb2, Rg2, альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен 1,8-цинеол, сабинен, родионин, кверцетин, лютеолин при следующем содержании компонентов, мг/л:

гинзенозид Re 370 гинзенозид Rb2 330 гинзенозид Rg2 420 альфа-пинен 240 бета-пинен 200 бета-мирцен 230 1,8-цинеол 280 сабинен 180 родионин 380 кверцетин 480 лютеолин 440 соевое масло остальное

Входящие в состав ФармК1-1 вещества в обозначенном выше количестве растворяют в 1 л соевого масла.

Пример 1-2

ФармК1-2 - масляный раствор, содержащий гинзенозиды Re, Rb2, Rg2, альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен 1,8-цинеол, сабинен, родионин, кверцетин, лютеолин при следующем содержании компонентов, мг/л:

гинзенозид Re 370 гинзенозид Rb2 330 гинзенозид Rg2 420 альфа-пинен 240 бета-пинен 200 бета-мирцен 230 1,8-цинеол 280 сабинен 180 родионин 380 кверцетин 480 лютеолин 440 подсолнечное масло остальное

Входящие в состав ФармК1-2 вещества в обозначенном выше количестве растворяют в 1 л подсолнечного масла.

Пример 2

ФармК2 - масляный раствор, содержащий гинзенозиды Re, Rb2, Rg2, альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен 1,8-цинеол, сабинен, родионин, кверцетин, лютеолин при следующем содержании компонентов, мг/л:

гинзенозид Re 380 гинзенозид Rb2 340 гинзенозид Rg2 430 альфа-пинен 250 бета-пинен 210 бета-мирцен 240 1,8-цинеол 290 сабинен 190 родионин 390 кверцетин 490 лютеолин 450 льняное масло остальное

Входящие в состав ФармК2 вещества в обозначенном выше количестве растворяют в 1 л льняного масла.

Пример 2-1

ФармК2-1 - масляный раствор, содержащий гинзенозиды Re, Rb2, Rg2, альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен 1,8-цинеол, сабинен, родионин, кверцетин, лютеолин при следующем содержании компонентов, мг/л:

гинзенозид Re 380 гинзенозид Rb2 340 гинзенозид Rg2 430 альфа-пинен 250 бета-пинен 210 бета-мирцен 240 1,8-цинеол 290 сабинен 190 родионин 390 кверцетин 490 лютеолин 450 соевое масло остальное

Входящие в состав ФармК2-1 вещества в обозначенном выше количестве растворяют в 1 л соевого масла.

Пример 2-2

ФармК2-2 - масляный раствор, содержащий гинзенозиды Re, Rb2, Rg2, альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен 1,8-цинеол, сабинен, родионин, кверцетин, лютеолин при следующем содержании компонентов, мг/л:

гинзенозид Re 380 гинзенозид Rb2 340 гинзенозид Rg2 430 альфа-пинен 250 бета-пинен 210 бета-мирцен 240 1,8-цинеол 290 сабинен 190 родионин 390 кверцетин 490 лютеолин 450 подсолнечное масло остальное

Входящие в состав ФармК2-2 вещества в обозначенном выше количестве растворяют в 1 л подсолнечного масла.

Пример 3

ФармК3-масляный раствор, содержащий гинзенозиды Re, Rb2, Rg2, альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен 1,8-цинеол, сабинен, родионин, кверцетин, лютеолин при следующем содержании компонентов, мг/л:

гинзенозид Re 390 гинзенозид Rb2 350 гинзенозид Rg2 440 альфа-пинен 260 бета-пинен 220 бета-мирцен 250 1,8-цинеол 300 сабинен 200 родионин 400 кверцетин 500 лютеолин 460 льняное масло остальное

Входящие в состав ФармК3 вещества в обозначенном выше количестве растворяют в 1 л льняного масла.

Пример 3-1

ФармК3-1 - масляный раствор, содержащий гинзенозиды Re, Rb2, Rg2, альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен 1,8-цинеол, сабинен, родионин, кверцетин, лютеолин при следующем содержании компонентов, мг/л:

гинзенозид Re 390 гинзенозид Rb2 350 гинзенозид Rg2 440 бета-пинен 220 бета-мирцен 250 1,8-цинеол 300 сабинен 200 родионин 400 кверцетин 500 лютеолин 460 соевое масло Остальное

Входящие в состав ФармК3-1 вещества в обозначенном выше выше количестве растворяют в 1 л соевого масла.

Пример 3-2

ФармК3-2 - масляный раствор, содержащий гинзенозиды Re, Rb2, Rg2, альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен 1,8-цинеол, сабинен, родионин, кверцетин, лютеолин при следующем содержании компонентов, мг/л:

гинзенозид Re 390 гинзенозид Rb2 350 гинзенозид Rg2 440 альфа-пинен 260 бета-пинен 220 бета-мирцен 250 1,8-цинеол 300 сабинен 200 родионин 400 кверцетин 500 лютеолин 460 подсолнечное масло остальное

Входящие в состав ФармК3-2 вещества в обозначенном выше количестве растворяют в 1 л подсолнечного масла.

Данные примеры не являются ограничивающими изобретение.

Растительное масло применяли для получения определенной формы, а не как активный компонент.В качестве растительного масла может быть использовано любое, подходящее в качестве фармацевтически приемлемого, такое как льняное масло, подсолнечное масло, соевое масло, оливковое масло, рапсовое масло, кукурузное масло.

Для всех дальнейших исследований ФармК был выбран состав примера №3 и, соответственно, проведена оценка биологической (противоопухолевой) активности ФармК3 в отношении холангиокарциномы РС-1 и острой токсичности.

Пример 4

Исследование противоопухолевой активности ФармК3.

Исследование было проведено на 24 половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой тела 200±30 г из разведения вивария ЦКП экспериментальной онкологии ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России.

Животных содержали в стандартных условиях вивария (12-часовой световой день, температура воздуха 22-26°С, относительная влажность воздуха 40-75%). Животные получали стандартный комбикорм полнорационный для лабораторных животных и питьевую воду ad libitum.

Исследование проводили на модели перевиваемой опухоли крыс - холангиокарциноме РС-1, руководствуясь «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств» [Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А.Н. Миронова // М.: изд. Гриф и К. - 2012. - гл. 39. - с. 642-656].

Штамм холангиокарциномы РС-1 был получен из Банка опухолевых штаммов ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Штамм холангиокарциномы РС-1 поддерживали стандартными серийными перевивками каждые 30 дней подкожно на самцах крыс породы Wistar. В экспериментах использовали 3-4-й пассажи in vivo. Прививку опухоли выполняли крысам по стандартной методике: подкожно в межлопаточную область вводили по 0,5 мл (50 мг) взвеси опухолевых клеток при разведении 1:3 в среде 199.

Изучение противоопухолевой активности ФармК3 проведено с использованием трансдермального воздействия на перевиваемую холангиокарциному РС-1 с разными сроками начала воздействия после прививки опухоли.

Перед началом экспериментальных исследований крыс случайным образом распределили на 4 группы (по 6 животных в группе, n=6): 2 контрольные и 2 опытные группы.

Крысам всех групп прививали холангиокарциному РС-1. В контрольных группах лечение животных не проводили. В первой опытной группе лечение начинали через 72 ч после прививки опухоли. Во второй опытной группе лечение начинали на 20-й день после прививки опухоли - на развившуюся опухоль, т.е. при среднем объеме опухоли к началу воздействия 500 мм и колебании среднего объема в группе не более 10% [Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А.Н. Миронова // М.: изд. Гриф и К. - 2012.- гл. 39. - с. 642-656].

В опытных группах воздействие проводили ежедневно на протяжении 10 дней. Перед лечением у всех животных удаляли шерстный покров с кожи над опухолью. ФармК3 применяли в виде аппликаций на область развития опухоли на коже в течение 1 часа ежедневно. Затем опухоль промывали водой с помощью ватных палочек и просушивали марлей.

Критерии оценки противоопухолевого эффекта: торможение роста опухоли (ТРО %), динамика объема опухоли.

Объем опухоли (см³) определяли по формуле объема эллипсоида: V=4/37π*a*b*c, где а, b, с - максимальные размеры опухоли по длине, ширине и высоте.

ТРО (%) вычисляли по формуле: ТРО (%)=(Vk-Vo)/Vk×100, где

ТРО - торможение роста опухоли,

Vk - средний объем опухоли в контрольной группе (см³),

Vo - средний объем опухоли в опытной группе (см³).

Противоопухолевый эффект считали минимальным при ТРО≥50% и высоким при ТРО≥70%.

Для гистологического исследования образцы опухоли фиксировали в 10% растворе забуференного нейтрального формалина, подвергали стандартной спиртовой проводке, после чего доводили до парафиновых блоков. Для описания изменений в опухоли срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.

Полученные данные обрабатывали статистически с использованием компьютерной программы SSPS 13.0. Нормальность распределения показателей в группах проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для параметрического распределения в исследуемых группах рассчитывали среднее арифметическое (М) и стандартное отклонение (δ). Для сравнения полученных в исследовании показателей с их параметрическим распределением, но без равенства дисперсий, использовали тест Крамера-Уэлча (Т), в котором разность средних арифметических двух выборок делится на натуральную оценку среднего квадратического отклонения этой разности. Различия между сравниваемыми группами считались статистически достоверными при р<0,05.

Результаты представлены на фиг. 1-4 и в таблице 2.

В таблице 2 представлена противоопухолевая активность ФармК3 при разных режимах трансдермального воздействия на холангиокарциному PC-1 у крыс.

При изученных режимах лечения местно-раздражающего эффекта и изменения массы тела животных после воздействия ФармК3 не наблюдали.

Как следует из результатов, в группе с трансдермальным воздействием ФармК3 через 72 часа после прививки опухоли на 8 день после окончания воздействия (21 день после прививки опухоли) торможения роста опухолей не наблюдали. Средний объем опухоли не отличался от показателя в контрольной группе (Фиг. 1). На 12 день после окончания воздействия (25 день после прививки опухоли) ТРО составило 38-39%. На 14 день после окончания воздействия ФармК3 (27 день после прививки опухоли) отмечали статистически значимое значение ТРО, которое составило 55,8% при р<0,05 (Табл. 2). При этом средний вес опухоли был на 49% меньше, чем в контрольной группе (5,44±1,53 г и 10,68±3,8 г, соответственно). Гибели крыс не наблюдали в течение 14 дней после окончания лечения.

Гистологическое исследование показало, что при трансдермальном воздействии ФармК3, начиная с 72 часов после прививки опухоли, через 14 дней после окончания воздействия наблюдали выраженные некрозы в опухолевой ткани, занимающие от 60 до 90% площади среза. Однако некрозы имели более зональное расположение с чередованием клеток теней с дистрофически измененными клетками опухоли. В опухоли отмечали обширные полости в виде кист как результат более ранних некрозов. Наблюдали кровоизлияния в ткани опухоли (Фиг. 2, А-В). В контрольной группе в опухолевой ткани встречались лишь очаговые некрозы, но большая часть опухоли была сохранна (Фиг. 2, Г).

При трансдермальном воздействии ФармК3 на развившуюся опухоль отмечали эффективное торможение роста, начиная с 6 дня после окончания лечения (ТРО=71%, р<0,05). К 14 дню после лечения противоопухолевый эффект ФармК3 возрос. ТРО составило 79% (р<0,05 по отношению к контролю) (Табл. 2). Средний объем опухоли в опытной группе был в 2 раза меньше, чем в контрольной (Фиг. 3). На 14 день после окончания лечения средний вес опухоли у опытных животных был на 39% меньше, чем в контрольной группе (10,8±3,4 и 17,7±2,0 г, соответственно). Гибель животных не наблюдали в течение 14 дней после окончания воздействия.

При гистологическом исследовании печени животных данной группы через 14 дней после окончания воздействия наблюдали значительные и обширные некрозы опухоли (до 95%) с единичными сохранными клетками под капсулой, прилегающей к мышце. Формирующиеся кисты в ткани опухоли, среди некрозов. Участки некроза не только в виде клеток теней, но и совершенно бесструктурных гомогенных полей (Фиг. 4, А-В). В опухолях мышей контрольной группы наблюдали очаговые некрозы, но большая часть опухоли была сохранна (Рис. 4, Г).

В результате проведенного исследования показано, что ФармК3 при трансдермальном воздействии в виде поверхностных аппликаций оказывает длительный противоопухолевый эффект на развившуюся опухоль в режиме на 1 час ежедневно в течение 10 дней. ТРО=71-79% (р<0,05) с 6 до 14 дня после окончания лечения. Применение ФармК3, начиная с 72 ч после прививки опухоли, вызывало кратковременный минимальный противоопухолевый эффект на 14-й день после окончания лечения (ТРО=56%, р<0,05). Вместе с тем, ФармК3 не оказывал местно-раздражающего и токсического действия в изученных режимах лечения.

Таким образом, результаты проведенного исследования позволяют утверждать, что ФармК3 оказывает длительный выраженный противоопухолевый эффект на развившуюся опухоль и минимальный противоопухолевый эффект при использовании на начальных сроках развития опухолевого процесса.

Примеры 5-6. Исследование острой токсичности ФармК3

Пример 5

Животные: белые беспородные крысы-самки весом 250±25 г из вивария ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России.

Животных содержали в стандартных условиях вивария при температуре 20-25°С в индивидуальных клетках. Животные находились на стандартном пищевом рационе с использованием комбикорма для грызунов.

После однократного перорального введения ФармК3 вели постоянное наблюдение за животными с регистрацией времени наступления первых клинических признаков интоксикации. Вне зависимости от динамики проявления и развития клинических признаков через 15, 30, 60, 120 и 180 мин после введения ФармК3 проводили подробный осмотр всех животных с регистрацией клинических признаков интоксикации и степени их выраженности (слабая, средняя или сильная).

Наблюдения за животными проводили в течение 14 дней. Анализировали общее состояние, двигательную функцию, аппетит, состояние шерстного покрова, дыхание, реакцию на внешние раздражители.

Массу тела определяли до и через 14 дней после однократного перорального введения ФармК3 в разных дозах.

Массовые коэффициенты внутренних органов на 14 день наблюдения определяли по формуле: вес внутреннего органа/вес животного.

Для гистологического исследования образцы внутренних органов животных фиксировали в 10% растворе забуференного нейтрального формалина, подвергали стандартной спиртовой проводке, после чего доводили до парафиновых блоков. Для описания изменений во внутренних органах срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.

Животным контрольной группы (n=6) перорально однократно вводили по 3 мл льняного масла.

Выбор начальной дозы для перорального введения ФармК3 был основан на рекомендациях ГОСТ 32644-2014 [ГОСТ 32644-2014 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека». Межгосударственный стандарт. Дата введения 01.06.2015]. Применяли поэтапный протокол с использованием минимального количества животных на каждом этапе, вещество вводили перорально первой группе подопытных животных в дозе 5 мл/кг.

На первом этапе ФармК3 в дозе 5 мл/кг ввели перорально 3 крысам. Через сутки такую же дозу - 5 мл/кг перорально ввели еще 3 крысам. Эти животные составили первую опытную группу (n=6).

Наблюдение показало, что после однократного перорального введения ФармК3 в дозе 5 мл/кг все животные первой опытной группы были подвижны, признаки интоксикации отсутствовали. Дыхание, сердечнососудистая деятельность, состояние шерстного покрова, кожи и видимых слизистых оболочек, реакция на внешние раздражители соответствовали норме. Ни одно животное не погибло в течение 14 дней.

В связи с отсутствием видимых признаков токсичности и в соответствии с рекомендациями руководства Организации Экономического Сотрудничества и Развития (OECD) ((Guidelines for the Testing of Chemicals» на следующем этапе дозу ФармК3 увеличили до 20 мл/кг.

ФармК3 в дозе 20 мл/кг ввели перорально 3 крысам. Затем, учитывая, что ни одно животное не погибло, через сутки такую же дозу препарата ввели еще 3 крысам. Эти животные составили вторую опытную группу (n=6).

В первый час после перорального введения ФармК3 в дозе 20 мл/кг все животные были вялыми, малоподвижными, сонливыми, слабо реагировали на внешние раздражители. Через 6 часов двигательная активность и аппетит восстановились. Через сутки признаки интоксикации отсутствовали. Ни одно животное в группе не погибло в течение 14 дней.

Результаты представлены в табл. 3-4 и на фиг. 5-11.

В таблице 3 представлены значения массы тела крыс до и через 14 дней после перорального введения ФармК3 в разных дозах.

В таблице 4 показаны массовые коэффициенты внутренних органов у крыс через 14 дней после перорального введения ФармК3 в разных дозах.

Масса тела крыс в опытных и контрольной группах не изменилась через 14 дней наблюдения. Не было каких-либо достоверных различий и между опытными и контрольными животными. Масса тела животных во всех группах находилась в пределах нормы для данного вида животных (табл. 3).

При анализе массовых коэффициентов внутренних органов крыс через 14 дней после перорального введения ФармК3 в разных дозах было выявлено только небольшое уменьшение массы сердца в группе животных с пероральным введением ФармК3 в дозе 20 мл/кг (Табл. 4).

При анализе морфологических изменений во внутренних органах крыс через 14 дней после перорального введения ФармК3 в дозе 5 мл/кг получены следующие результаты.

В печени отмечали умеренную дистрофию гепатоцитов, полнокровие синусоидов и сосудов портальных треугольников (Фиг. 5а). В почках наблюдали умеренное полнокровие сосудистых клубочков, набухание эпителия извитых канальцев (Фиг. 5б). В легких отмечали умеренное полнокровие капилляров, участки эмфиземы, есть участки утолщения межальвеолярных перегородок (Фиг. 6а, б). В миокарде наблюдали умеренный отек стромы (Фиг. 7а), очаговые кровоизлияния с развитием феномена сепарации крови в очагах кровоизлияний (Фиг. 7б). Селезенка имела нормальное строение, четко отграниченные фолликулы, в красной пульпе наблюдали небольшое количество пигмента (Фиг. 8а, б). Большинство изменений являются обратимыми.

Анализ гистологических препаратов внутренних органов крыс через 14 дней после перорального введения ФармК3 в дозе 20 мл/кг показал следующие результаты.

В печени в большинстве случаях наблюдали умеренную дистрофию гепатоцитов, редко - участки с выраженной дистрофией гепатоцитов, отмечали полнокровие синусоидов и центральных вен (Фиг. 9а). В почках отмечали умеренное полнокровие сосудистых клубочков. Обращало на себя внимание наличие пигментированных клеток эпителия извитых канальцев (Фиг. 9б). В легких межальвеолярные перегородки были утолщены, наблюдали умеренное полнокровие сосудов межальвеолярных перегородок (Фиг. 10а), в некоторых полях зрения визуализировались участки острой эмфиземы (Фиг. 10б). В миокарде наблюдали выраженный отек стромы, очаговые кровоизлияния (Фиг. 11а). Селезенка имела нормальное строение, фолликулы были четко отграничены, большое количество пигмента в красной пульпе (Фиг. 11б). Селезенка имела нормальное строение, четко отграниченные фолликулы, в красной пульпе наблюдали небольшое количество пигмента. Большинство изменений являются обратимыми.

Пример 6

Животные: белые беспородные мыши-самки весом 35±4 г. Источник - ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России. Животных содержали в стандартных условиях вивария при температуре 20-25°С в индивидуальных клетках. Пищевой режим стандартный, с использованием комбикорма для грызунов.

После однократного перорального введения ФармК3 вели постоянное наблюдение за животными с регистрацией времени наступления первых клинических признаков интоксикации. Вне зависимости от динамики проявления и развития клинических признаков через 15, 30, 60, 120 и 180 мин после введения ФармК3 проводили подробный осмотр всех животных с регистрацией клинических признаков интоксикации и степени их выраженности (слабая, средняя или сильная).

Наблюдения за животными проводили в течение 14 дней. Анализировали общее состояние, двигательную функцию, аппетит, состояние шерстного покрова, дыхание, реакцию на внешние раздражители.

Массу тела определяли до и через 14 дней после однократного перорального введения ФармК3 в разных дозах.

Массовые коэффициенты внутренних органов на 14 день наблюдения определяли по формуле: вес внутреннего органа/вес животного.

Для гистологического исследования образцы внутренних органов животных фиксировали в 10% растворе забуференного нейтрального формалина, подвергали стандартной спиртовой проводке, после чего доводили до парафиновых блоков. Для описания изменений во внутренних органах срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.

Мышам контрольной группы (n=6) перорально однократно ввели по 3 мл льняного масла.

Выбор начальной дозы для однократного перорального введения ФармК3 был основан на рекомендациях ГОСТ 32644-2014 [ГОСТ 32644-2014 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека». Межгосударственный стандарт. Дата введения 01.06.2015].

На первом этапе ФармК3 в дозе 5 мл/кг ввели перорально 3 мышам. Через сутки такую же дозу - 5 мл/кг перорально ввели еще 3 мышам. Эти животные составили первую опытную группу (n=6).

Наблюдение показало, что после однократного перорального введения ФармК3 в дозе 5 мл/кг все животные первой опытной группы были подвижны, признаки интоксикации отсутствовали. Дыхание, сердечнососудистая деятельность, состояние шерстного покрова, кожи и видимых слизистых оболочек, реакция на внешние раздражители соответствовали норме. Ни одно животное не погибло в течение 14 дней.

В связи с отсутствием видимых признаков токсичности и в соответствии с рекомендациями руководства Организации Экономического Сотрудничества и Развития (OECD) «Guidelines for the Testing of Chemical s» на следующем этапе дозу ФармК3 увеличили до 20 мл/кг.

ФармК3 в дозе 20 мл/кг ввели 3 мышам. Затем, учитывая, что ни одно животное не погибло, через сутки такую же дозу препарата ввели еще 3 мышам. Эти животные составили вторую опытную группу (n=6).

В первый час после перорального введения ФармК3 в дозе 20 мл/кг у животных отмечали снижение двигательной активности, все мыши были вялыми, малоподвижными, сонливыми, слабо реагировали на внешние раздражители. Через час животные начинали двигаться, умываться, активное перемещение чередовалось с состоянием покоя. Через 6 часов все мыши были активными, подвижными, восстановился аппетит. Через сутки признаков интоксикации не наблюдали. Ни одно животное в группе не погибло в течение 14 суток.

В таблице 5 представлены значения массы тела мышей до и через 14 дней после перорального введения ФармК3 в разных дозах.

В таблице 6 показаны массовые коэффициенты внутренних органов у мышей через 14 дней после перорального введения ФармК3 в разных дозах.

Масса тела мышей в опытных и контрольной группах не изменилась через 14 дней наблюдения. Не было каких-либо достоверных различий и между опытными и контрольными животными. Масса тела животных во всех группах находилась в пределах нормы для данного вида животных (табл. 5).

При анализе массовых коэффициентов внутренних органов мышей через 14 дней после перорального введения ФармК3 в разных дозах было выявлено только небольшое уменьшение массы печени в группе животных с пероральным введением ФармК3 в дозе 20 мл/кг. По остальные показателям различий с контролем не наблюдали (табл. 6).

Морфологические изменения во внутренних органах мышей через 14 дней после однократного перорального введения ФармК3 в дозах 5 или 20 мл/кг были аналогичными, наблюдаемыми у крыс (см. фиг. 5-11 из примера 4). Наблюдали дистрофические изменения клеток в печени и почках, утолщение межальвеолярных перегородок и эмфизему в легких; признаки нарушения кровообращения в виде полнокровия в легких, почках, отека и кровоизлияний в миокарде; накопление пигмента в красной пульпе селезенки. Выраженность изменений была выше при дозе 20 мг/кг. Изменения в основном являлись обратимыми.

По результатам выполненных исследований можно сделать заключение о том, что ФармК3 по своим параметрам острой токсичности, согласно гармонизированной международной системе классификации опасности и маркировки химической продукции (GHS) следует отнести к относительно низкому классу острой токсической опасности - 5 категории острой токсичности. Согласно отечественному ГОСТу 32644-2014 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека» ФармК3 также можно отнести к 5-му классу опасности.

Все изложенное выше подтверждает, что достигнут технический результат, заявленный нами, - разработана фармацевтическая композиция на основе биоактивных компонентов растений с улучшенным качественным и количественным составом компонентов, обеспечивающим ее противоопухолевую активность в отношении холангиокарциномы и низкую токсичность.

Изобретение относится к области медицины, а именно к низкотоксичной фармацевтической композиции с противоопухолевой активностью в отношении холангиокарциномы. Низкотоксичная фармацевтическая композиция с противоопухолевой активностью в отношении холангиокарциномы представляет собой масляный раствор, содержащий гинзенозиды Re, Rb2, Rg2, альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен 1,8-цинеол, сабинен, родионин, кверцетин, лютеолин при следующем содержании компонентов, мг/л: гинзенозид Re – 370-390, гинзенозид Rb2 – 330-350, гинзенозид Rg2 – 420-440, альфа-пинен – 240-260, бета-пинен – 200-220, бета-мирцен – 30-250, 1,8-цинеол – 280-300, сабинен – 180-200, родионин – 380-400, кверцетин – 480-500, лютеолин – 440-460, растительное масло – остальное. Вышеописанная композиция обладает улучшенным качественным и количественным составом, уменьшенной токсичностью и обеспечивает противоопухолевую активность в отношении холангиокарциномы. 11 ил., 6 табл., 6 пр.

Низкотоксичная фармацевтическая композиция с противоопухолевой активностью в отношении холангиокарциномы, отличающаяся тем, что она представляет собой масляный раствор, содержащий гинзенозиды Re, Rb2, Rg2, альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен 1,8-цинеол, сабинен, родионин, кверцетин, лютеолин при следующем содержании компонентов, мг/л:

гинзенозид Re 370-390 гинзенозид Rb2 330-350 гинзенозид Rg2 420-440 альфа-пинен 240-260 бета-пинен 200-220 бета-мирцен 230-250 1,8-цинеол 280-300 сабинен 180-200 родионин 380-400 кверцетин 480-500 лютеолин 440-460 растительное масло остальное