ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2016 года по МПК A61K38/00 A61P35/00 A61K39/40 

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и касается средств, обладающих противоопухолевым действием.

Циклофилин А (ЦфА) - белок с молекулярной массой 18 кД, находится во всех тканях млекопитающих, располагаясь как в цитозоле, так и в ядре клетки, участвует в процессах внутриклеточного транспорта белков, регуляции клеточной пролиферации и проведении сигнала от рецептора в Т-лимфоцитах (Ping Wang and Joseph Heitman. The cyclophilins. Genome Biology 2005, 6: 226; Fischer G, Bang H, Mech C. Determination of enzymatic catalysis for the cis-trans-isomerization of peptide binding in proline-containing peptides. Biomed. Biochim. Acta. 1984; 43(10):1101-1111; Colgan J, Asmal M, Yu B, Luban J. Cyclophilin Α-deficient mice are resistant to immunosuppression by cyclosporine. Journal of immunology. 2005; 174(10):6030-6038). ЦфА усиливает миграцию стволовых клеток и предшественников из костного мозга на периферию, что позволяет рассматривать данный белок как фактор регенерации (Khromykh LM, Kulikova NL, Anfalova TV, et al. Cyclophilin A produced by thymocytes regulates the migration of murine bone marrow cells. Cell Immunol. 2007; 249(1):46-53). ЦфА участвует в контроле баланса между Т-хелперами первого и второго типов (Colgan, J., Asmal, Μ., Neagu, Μ., Yu, В., Schneidkraut, J., Lee, Y., Sokolskaja, E., Andreotti, Α., Luban, J. Cyclophilin A regulates TCR signal strength in CD4+ Τ cells via a proline-directed conformational switch in Itk. Immunity 2004, 21, 189-201). Указанное свойство ЦфА может препятствовать возникновению иммунного ответа по альтернативному пути, что часто имеет место при опухолевых процессах (Santoni Μ, Massari F, Amantini С, и др. Emerging role of tumor-associated macrophages as therapeutic targets in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunol Immunother. 2013; 62(12):1757-1768).

Известен один из цитокинов - фактор некроза опухолей (ФНО), обладающий противоопухолевым действием. ФНО обладает цитостатическим и цитолитическим эффектом в отношении ряда опухолей (Soma G, Mizuno D. Exogenous and endogenous tumour necrosis factor therapy. Cancer Surv. 1989; 8(4):837-852).

Недостатки ФНО: низкий терапевтический эффект (Lejeune F.J., Ruegg С. Recombinant human tumor necrosis factor: an efficient agent for cancer treatment // Bull. Cancer. 2006. Vol. 93 (8). P. 90-100. Pilati P., Rossi C.R., Mocellin S. Strategies to enhance the anticancer potential of TNF // Front Biosci. 2008; Vol. 13; P. 3181-3193).

Задачей заявляемого изобретения является создание нового средства, обладающего противоопухолевым действием.

Поставленная задача решается тем, что предложено средство, представляющее собой рекомбинантный циклофилин А человека (рчЦфА) в виде раствора в фосфатном буфере и являющееся продуцентом штамма Escherichia coli (BL21(DE3)Gold/pETCYPopti, депонированного во Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика, регистрационный номер В-11983 от 18 июля 2014 года. РчЦфА является аналогом природного цитокина ЦфА, имеет более 95% чистоты, не проявляет видовой специфичности. Уровень эндотоксина в растворе не превышает уровня, допустимого для проведения доклинических испытаний.

Технический результат

Заявляемое средство обладает противоопухолевой активностью.

Исследование противоопухолевой активности заявляемого средства.

Для исследования противоопухолевой активности заявляемого средства были использованы штаммы перевиваемых опухолей: аденокарциномы молочной железы Са755; рака шейки матки (РШМ-5); меланомы В16; карциномы легкого Льюиса (LLC), полученных из банка опухолевых штаммов ФГБНУ ′′РОНЦ им. Н.Н. Блохина′′ и поддерживающихся на мышах соответствующих линий in vivo.

Для прививки опухолей были использованы самки линий мышей в возрасте от 1,5 до 2 мес с начальной массой от 18 до 21 г.

Для прививки аденокарциномы молочной железы Са755 использовали самок мышей гибридов первого поколения линии BDF1(DBA/2×C57BL/6j); для прививки клеток рака шейки матки РШМ-5 были использованы мыши линии СВА; для прививки клеток эпидермальной карциномы легкого Льюиса (LLC) и меланомы В16 были использованы мыши линии C57BL/6j.

В исследованиях использованы опухолевые клетки после 2-4 пассажей in vivo. Прививку опухолевых клеток проводили мышам подкожно в правую подмышечную область по 50 мг опухолевой взвеси с содержанием 5×10⁶ клеток в среде 199 в разведении 1:10. Мышам линии C57BL/6 прививали 300×10³ клеток меланомы В16 в среде 199 в том же разведении.

Группы формировали методом рандомизации по массе тела по 7 мышей в опытных и по 10 мышей в контрольных группах. РчЦфА применяли в дозе 100 мкг/мышь (5 мг/кг) в фосфатном буфере в объеме 0,2 мл подкожно и вводили через 24 часа после прививки опухоли. Мышам контрольных групп вводили только фосфатный буфер в том же объеме и в том же режиме, что и в опытных группах.

РчЦфА применяли в двух режимах: 1) ежедневно в течение 7 дней после прививки опухоли и 2) ежедневно в течение 7 дней до и 7 дней после прививки опухоли.

Эффективность рчЦфА оценивали по показателям торможения роста опухолей (ТРО) и увеличению продолжительности жизни (УПЖ) мышей.

ТРО вычисляли по формуле:

ТРО%=(Vk-Vo)/Vk×100,

где Vk и Vo - средний объем опухолей (мм³) в контрольной и опытной группах соответственно.

Объем опухоли определяли после окончания введения заявляемого средства каждые 4 дня.

УПЖ% мышей в опытных группах по сравнению с контрольными группами вычисляли по формуле:

УПЖ% - (СПЖо-СПЖк)/СПЖк×100,

где СПЖо и СПЖк - средняя продолжительность жизни (сутки) в опытных и контрольных группах мышей соответственно.

Эффективность заявляемого средства оценивали в зависимости от величины опухоли и продолжительности жизни мышей опытных групп по сравнению с мышами контрольных групп. Эффективными считали дозы заявляемого средства, при которых ТРО составляло от 50% до 70% в течение 7 дней после окончания введения заявляемого средства или УПЖ мышей более и равное 25%.

Изобретение иллюстрируется табл.1-4.

В табл. 1 представлена противоопухолевая активность рчЦфА у мышей с аденокарциномой молочной железы Са755.

В табл. 2 показана противоопухолевая активность рчЦфА у мышей при раке шейки матки РШМ 5.

В табл. 3 представлена противоопухолевая активность рчЦфА у мышей с меланомой В16.

В табл.4 приведена противоопухолевая активность рчЦфА у мышей с эпидермальной карциномой легкого Льюиса.

При оценке противоопухолевой активности рчЦфА у мышей с аденокарциномой молочной железы Са755 показано, что при введении заявляемого средства в ежедневном режиме 7 дней после прививки отмечено торможение роста опухоли, но достоверных различий с мышами контрольной группы не выявлено. При применении режима введения рчЦфА в течение 7 дней до и 7 дней после прививки опухоли у мышей опытной группы ТРО достоверно различалось от мышей контрольной группы и сохранялось до 21 дня. При этом не было различий в продолжительности жизни опытных и контрольных мышей (табл. 1).

При изучении противоопухолевой активности рчЦфА у мышей при раке шейки матки в режиме 7 дней после прививки опухоли показано, что ТРО составило 52% на 33 день после прививки, а УПЖ было на 30% выше по сравнению с контрольной группой. При введении рчЦфА в режиме 7 дней до и 7 дней после прививки опухоли выявлены достоверные различия с контрольной группой: ТРО составило 50% к 24 дню. При этом отсутствовали достоверные различия в продолжительности жизни опытных и контрольных мышей (табл. 2).

При оценке противоопухолевой активности рчЦфА у мышей с меланомой В16 в режиме 7 дней после прививки опухоли показано, что ТРО у мышей опытной группы соответствовало 59,3% к 31 дню. УПЖ опытных мышей было выше на 35,2% по сравнению с мышами контрольной группы. При введении рчЦфА в режиме 7 дней до и 7 дней после прививки меланомы у мышей опытной группы ТРО к 33 дню составило 72,3%, а УПЖ у мышей опытной группы было на 30,4% выше, чем у мышей контрольной группы (табл. 3).

При изучении противоопухолевой активности рчЦфА у мышей с эпидермальной карциномой легкого Льюиса в режиме 7 дней после прививки опухоли и у мышей, получавших рчЦфА в режиме 7 дней до и 7 дней после прививки опухоли, достоверный уровень ТРО сохранялся до 26 и 22 дней и составил 50,0% и 52,8% соответственно. При этом УПЖ не выявлено (Табл. 4).

Таким образом, показана противоопухолевая активность рчЦфА на изучаемых опухолях у мышей. Для аденокарциномы молочной железы Са755 и рака шейки матки (РШМ 5) наибольшая эффективность выявлена при введении рчЦфА в режиме 7 дней после прививки опухоли; для меланомы В16 и карциномы легкого Льюиса (LLC) противоопухолевый эффект не зависел от режима введения рчЦфА.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к противоопухолевому средству. Противоопухолевое средство, представляющее собой рекомбинантный циклофилин А человека в виде раствора в фосфатном буфере, является продуцентом штамма Escherichia coli (BL21(DE3)Gold/pETCYPopti, депонированного во Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика, регистрационный номер В-11983 от 18 июля 2014 г. Вышеописанное средство обладает выраженной противоопухолевой активностью в отношении аденокарциномы молочной железы Са755, рака шейки матки (РШМ 5), меланомы В16 и карциномы легкого Льюиса (LLC). 4 табл.

Противоопухолевое средство, представляющее собой рекомбинантный циклофилин A человека в виде раствора в фосфатном буфере и являющееся продуцентом штамма Escherichia coli (BL21(DE3)Gold/pETCYPopti, депонированного во Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика, регистрационный номер B-11983 от 18 июля 2014 г.