ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ ОСНОВНЫМИ ВОЗБУДИТЕЛЯМИ ПАТОГЕНОВ Российский патент 2024 года по МПК A61K31/43 A61K31/439 A61K31/545 A61P31/04 

Изобретение относится к антибактериальным композициям и может найти применение для лечения бактериальных инфекций, вызванных основными полирезистентными грамотрицательными патогенами, включая штаммы, продуцирующие варианты ESBL типов TEM, SHV и CTX-M: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Acinetobacter baumanii.

Грамотрицательные бактерии, как ферментирующие (Enterobacteriaceae), так и неферментирующие, в том числе резистентных к карбапенемам (КР) Pseudomonas aeruginosa, КР-Acinetobacter baumannii, и особенно цефалоспорин- и КР-Enterobacteriaceae (КРЕ) третьего поколения представляют собой особую проблему, являясь одной из наиболее важных причин внутрибольничных инфекций, а для некоторых Enterobacteriaceae также важной причиной внебольничных инфекций.

Среди многочисленных видов штаммов КРЕ выявлено глобальное распространение продуцентов карбапенемазы Klebsiella pneumoniae (KPС), металло-β-лактамазы Нью-Дели (NDM) и ферментов, подобных оксациллиназе (OXA)-48, среди изолятов K. pneumoniae, как наиболее важная проблема резистентности, поскольку заражение этими штаммами обычно приводит к задержке введения соответствующих антибиотиков, а также к высоким показателям заболеваемости и летальности, в то время как колонизация КРЕ обычно связана с высокой тяжестью заболевания [S. S. Jean, S. C. Hsueh, W. Sen Lee and P. R. Hsueh, Cefiderocol: a promising antibiotic against multidrug-resistant Gram-negative bacteria, Expert Rev. Anti-Infect. Ther., 2019, 17, 307 —309; Black CA, So W, Dallas SS, Gawrys G, Benavides R, Aguilar S, et al. Predominance of Non-carbapenemase Producing Carbapenem-Resistant Enterobacterales in South Texas. Frontiers in Microbiology. 2021;11:362].

Монотерапия цефепимом использовалась в течение десятилетий для лечения бактериальных инфекций. Клиническое применение доказывает его эффективности, безопасности и переносимости, в том числе при высоких дозах для лечения чувствительных грамотрицательных инфекций. В качестве основного компонента терапии BL/BLI цефепим также обладает некоторыми преимуществами по сравнению с другими цефалоспоринами (цефоперазоном, цефтазидимом). Следует отметить, что он устойчив к гидролизу многими β-лактамазами класса C (AmpC) и, неся нейтральный (цвиттерионный) заряд, менее подвержен влиянию проницаемости (порин) и механизмов устойчивости, опосредованных оттоком. Потенциал цефепима очевиден из недавних исследований, оценивающих его активность в сочетании с тазобактамом, энметазобактамом, зидебактамом, авибактамом и накубактамом в качестве BLI. Все они демонстрируют in vitro активность в отношении грамотрицательных МЛУ, которые продуцируют БЛРС и/или карбапенемазы, сравнимую комбинацией цефепим/сульбактам [Wareham DW, Abdul Momin MHF, Phee LM et al. Cefepime/sulbactam as an en-hanced antimicrobial combination therapy for the treatment of MDR Gram-negative infections. J Antimicrob Chemother 2020; 75: 135–9/].

Сульбактам, который используется в клинической практике в комбинации с ампициллином, цефоперазоном или цефтриаксоном, обладает некоторой собственной антибактериальной активностью в отношении видов Acinetobacter и других патогенов. К сожалению, этот ингибитор неэффективен в отношении карбапенем-гидролизующих β-лактамаз класса D.

Авибактам является превосходным ингибитором ферментов классов A и C и некоторых ферментов класса D, таких как OXA-48, его эффективность против бактериальных патогенов, содержащих OXA-23 и OXA-24/40, гидролизующих карбапенемы β-лактамаз класса D ферменты, широко распространенные в клинически значимых грамотрицательных видах, таких как P. aeruginosa и A. baumannii, низки. Поэтому неудивительно, что в настоящее время предпринимаются большие усилия по поиску аналогов на основе авибактама с расширенным спектром действия. [C González-Bello, D Rodríguez, M Pernas, Á Rodríguez, E Colchón, β-Lactamase in-hibitors to restore the efficacy of antibiotics against superbugs Journal of medicinal chemistry 2019, 63 (5), 1859-1881.].

Таким образом, очевидно, что современное здравоохранение остро нуждается в препаратах, преодолевающих устойчивость, связанную с продукцией бета-лактамаз. Применение антибактериальных препаратов из таких групп, как аминогликозиды и фторхинолоны, не может решить указанную проблему, так как в результате различных генетических процессов штаммы, продуцирующие бета-лактамазы, в подавляющем большинстве случаев обладают ассоциированной устойчивостью и к перечисленным антибактериальным препаратам.

Одним из направлений преодоления устойчивости, связанной с продукций бета-лактамаз, является разработка комбинированных препаратов, включающих бета-лактамные антибиотики и необратимые ингибиторы бета-лактамаз.

Но наличие новых ингибиторов не означает автоматически легкого и всегда успешного лечения по нескольким причинам: большинство доступных новых препаратов обладают субоптимальной активностью против резистентных к карбапенемам Acinetobacter baumannii (CRAB); активность новых ингибиторов β-лактам/β-лактамаз (BL-BLI) против КРЕ зависит от типа карбапенемазы, придающей устойчивость к карбапенемам; появляться резистентность к новым комбинациям [Shields RK, Chen L, Cheng S, Chavda KD, Press EG, Snyder A, et al. Emergence of ceftazidime-avibactam resistance due to plasmid-borne blaKPC-3 Mutations during Treatment of Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae Infections. Antimicrob Agents Chemother. (2017) 61: e02097–16. doi: 10.1128/AAC.02097-16.; Sun D, Rubio-Aparicio D, Nelson K, Dudley MN, Lomovskaya O. Meropenem-vaborbactam resistance selection, resistance prevention, and molecular mecha-nisms in mutants of KPC-producing Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother. (2017) 61:e01694–17. doi: 10.1128/AAC.01694-17].

Вышеизложенное вынуждает клиницистов рассматривать подходы к лечению, основанные на комбинациях препаратов с новыми ингибиторами, и/или заново открывать старые препараты [M. Bassetti, J. Garau, Current and future perspectives in the treatment of multidrug-resistant Gram-negative infections, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Volume 76, Issue Supplement_4, November 2021, Pages iv23–iv37].

В настоящее время на практике широко применяется ряд комбинаций полусинтетических пенициллинов с ингибиторами бета-лактамаз («ингибитор-защищенные» пенициллины - амоксициллин/клавулановая кислота, амоксициллин/сульбактам, ампициллин/сульбактам, тикарциллин/клавулановая кислота и пиперациллин/тазобактам), известна также комбинация цефалоспорина III поколения цефоперазона с сульбактамом.

Однако для всех перечисленных комбинированных препаратов характерны определенные недостатки. Так комбинированные препараты на основе аминопенициллинов пригодны только для лечения относительно легких внебольничных инфекций, поскольку эти антибиотики обладают относительно узким спектром действия, не включающим многие госпитальные патогены, а уровень их активности невысок. Комбинированные препараты на основе карбоксипенициллинов (тикарциллин/клавуланат) и уреидопенициллинов (пиперациллин/тазобактам), несмотря на широкий спектр действия этих антибиотиков, также оказались недостаточно эффективными из-за высокой чувствительности к гидролизу бета-лактамазами и при высоком уровне продукции этих ферментов ингибиторы не могут полностью защитить антибиотики от разрушения. Кроме этого, клавулановая кислота, входящая в состав препарата тикарциллин/клавуланат, обладает способностью индуцировать синтез хромосомных бета-лактамаз класса С бактериями группы Enterobacter - Serratia - Citrobacter - Morganella, что снижает активность препарата в отношении указанных бактерий.

Наиболее близким аналогом является средством для лечения инфекционных болезней (патент RU2377985, опубл.: 10.01.2010.), вызванных множественно-устойчивыми бактериями, которое представляет собой смесь цефалоспоринового антибиотика цефепима и ингибитора бета-лактамаз сульбактама при их соотношении соответственно от 1:1 до 1:2.

Известная композиция показала эффективность при тяжелых госпитальных (нозокомиальных) инфекциях, вызванных множественно устойчивыми грамотрицательными бактериями семейства Enterobacteriaceae, родов Pseudomonas, Acinetobacter за счет преодоления устойчивости перечисленных бактерий, обусловленной продукцией хромосомных и плазмидных бета-лактамаз класса С, а также плазмидных бета-лактамаз класса А широкого и расширенного спектров.

Согласно прототипу, эффект снижения МПК более выражен при соотношении цефепима и сульбактама 1:1, нежели при соотношении 2:1.

Однако, проведенное авторами настоящего изобретения исследование, показало недостаточную эффективность комбинации цефепима и сульбактама даже в соотношении 1:1 (см. Таблицу 2) на 90% штаммов инфекций Ps. aeruginosa, K. pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Citrobacter spp., Acinetobacter baumanii. В отношении этих бактерий выявлена резистентность этих бактерий к данному антибиотику.

При этом, K. pneumoniae, Acinetobacter baumani и Ps.aeruginosa – лидируют среди возбудителей внутрибольничных инфекций и вместе занимают более 75% выявленных патогенов.

Задачей настоящего изобретения явилось создание новой композиции из известных средств, которая обладала бы максимальной эффективностью в отношении бактериальных инфекций, вызванных основными патогенами, включая те, в отношении которых композиция прототипа не обеспечивает необходимого эффекта.

Техническим результатом является расширение арсенала технических средств антибактериальных композиций для лечения инфекций, вызванных основными патогенами, которая более эффективна в сравнении с прототипом по отношению к стандартным штаммам и клиническим изолятам грамотрицательных патогенов, включая полирезистентные штаммы, продуцирующие варианты ESBL типов TEM, SHV и CTX-M: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa.

Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлена фармацевтическая композиция для лечения бактериальных инфекций, вызванных основными полирезистентными грамотрицательными патогенами, которая представляет собой смесь, включающая цефалоспориновый антибиотик цефепим и ингибитор бета-лактамаз сульбактам, отличающаяся тем, что дополнительно в состав смеси включен ингибитор ферментов авибактам, причем композиция цефепима, сульбактама и авибактама подобрана в соотношении 4:2:1, соответственно.

Допустимо, что композиция предназначена для лечения бактериальных инфекций, вызванных полирезистентными штаммами Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Acinetobacter baumanii и/или Pseudomonas aeruginosa, продуцирующими варианты ESBL типов TEM, SHV и/или CTX-M.

Допустимо, что композиция предназначена для лечения бактериальных инфекций, включающих также инфекции, вызванные семейством Enterobacteriaceae.

Допустимо, что композиция предназначена для лечения бактериальных инфекций, вызванных штаммами грамотрицательных бактерий, продуцирующими бета-лактамазы.

Осуществление изобретения

Чтобы доказать эффективность заявленной композиции с фиксированными концентрациями ингибиторов: цефепим + сульбактам + авибактам (в диапазоне концентраций 4:2:1 и 4:1:1), авторами настоящего изобретения проводилось сравнительное изучение активности комбинации с фиксированными концентрациями ингибиторов: цефепим + сульбактам + авибактам (в диапазоне концентраций 4:2:1 и 4:1:1) в сравнении с ранее изученными антибиотиками и их комбинациями цефепим+авибактам 4:1, цефепим+сульбактам 1:1, цефтазидим+авибактам 4:1, и только цефепим, в отношении стандартных штаммов и клинических изолятов грамотрицательных патогенов, включая штаммы, продуцирующие варианты ESBL типов TEM, SHV и CTX-M: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Acinetobacter baumanii.

Оценку антимикробного действия и степени антибактериальной активности in vitro проводили для микроорганизмов, проявляющих различную степень устойчивости.

Анализ осуществляли в соответствии с Методическими рекомендациями [Методические рекомендации: «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» Версия 2021-01 https://www.antibiotic.ru/files/321/clrec-dsma2021.pdf] и документом CLSI M100 S25 [Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for An-timicrobial Susceptibility Testing, 28th ed.; CLSI Supplement M100; Clinical and La-boratory Standards Institute: Wayne, PA, USA, 2018; ISBN1 978-1-68440-066-9. [Print]; ISBN2 978-1-68440-067-6], методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Активность оценивали по значениям МПК.

Проведенные исследования продемонстрировали высокую активность тройной комбинации цефепима с фиксированными концентрациями ингибиторов сульбактам и авибактам в соотношении 4:2:1 и 4:1:1 в отношении стандартных штаммов и клинических изолятов грамотрицательных патогенов, включая полирезистентные штаммы, продуцирующие варианты ESBL типов TEM, SHV и CTX-M: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa. В отношении A. baumannii, включая штаммы с пониженной чувствительностью к сульбактаму комбинация цефепима с сульбактамом и авибактамом в соотношении 4:2:1 МПК50-90 составили ≤0,015 мкг/мл и 0,125 мкг/мл, соответственно, что превосходит другие сравниваемые антибиотики и комбинации. В отношении K. pneumoniae, исследованные тройные комбинации цефепим + сульбактам + авибактам в соотношении 4:2:1 и 4:1:1 по активности сравнимы с цефепимом в комбинации авибактамом 4:1 и значительно превосходят активность существующей комбинации цефтазидим + авибактам 4:1. В отношении Ps.aeruginosa исследованные тройные комбинации имеют статистически не значимые отличия по активности в сравнении с комбинацией цефтазидим + авибактам 4:1.

Исследуемые препараты

Цефепим 1,0 г.

Производитель: Биосинтез, Россия.

Серия: 201220

Срок годности: до 01.23

Форма: порошок для приготовления раствора для внутривенного и внутримышечного введения.

Состав: Активное вещество: цефепима гидрохлорида моногидрат в пересчете на цефепим – 1г.

Вспомогательное вещество: L-аргинин – 0,73г.

Авибактам натриевая соль (Avibactam Sodium Salt)

Производитель: Hangzhou Huisheng Biotach Pharmaceutical CO., LTD, Китай.

Серия AVB11R200601

Фармакологическая группа: ингибитор бета-лактамаз

Содержание авибактама в расчете на безводное 900 мкг/мг

Дата производства 2020-06-01

Годен до 2022-05-31

Сульбактам натриевая соль. (Sulbactam sodium USP 41)

Производитель: Сучжоу Данрайс Фармасьютикал Кою, Лтд, Китай

Серия 2011304158.

Фармакологическая группа: ингибитор бета-лактамаз.

Содержание сульбактами в расчете на безводное 911 мкг/мг

Дата производства 27.11.2020

Годен до 26.11.22.

Завицефта (Zavicefta) 2000 мг + 500 мг.

Международное непатентованное наименование: цефтазидим+[авибактам].

Производитель: ЭйСиЭс Добфар С.п.А. Италия

Серия 2002EO

Годен до: 02.2022

Лекарственная форма: порошок для приготовления концентрата для приготовления раствора для инфузий.

Состав: Активные вещества: авибактам натрия 543,5 мг (эквивалентный авибактаму 500,0 мг), цефтазидима пентагидрат 2329,6 мг (эквивалентный цефтазидиму 2000,0 мг).

Вспомогательное вещество: натрия карбонат (безводный) 233,0 мг.

Фармакологическая группа: антибиотик – цефалоспорин + бета-лактамаз ингибитор.

Культуры микроорганизмов

Штаммы микроорганизмов получены из рабочего музея НИИНА и клинических лабораторий. В работе использовано 110 штаммов, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae и неферментирующим грамотрицательным бактериям рода Pseudomonas и Acinetibacter, собранные за последние пять лет из различных клинических лабораторий г. Москвы, а также НИЦЭМ им. Гамалеи.

Культуры микроорганизмов сохраняли в условиях низкой температуры (-75°С) в триптиказо-соевом бульоне с добавлением 10-15% глицерина. Хранение в указанных условиях осуществляли в соответствии с рекомендациями «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» Версия 2021-01 [Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for An-timicrobial Susceptibility Testing, 28th ed.; CLSI Supplement M100; Clinical and La-boratory Standards Institute: Wayne, PA, USA, 2018; ISBN1 978-1-68440-066-9. [Print]; ISBN2 978-1-68440-067-6].

Перед началом эксперимента бактериальные штаммы активировали после криохранения высевом на триптиказо-соевую агаризованную среду, инкубировали при (36±1)°С в течение 16-24 часов.

Приготовление инокулята. Отдельные морфологически однородные колонии суспендировали в стерильном физиологическом растворе и устанавливали мутность суспензии до 0,5 единиц по стандарту McFarland на приборе McFarland Densitometer (Biosan, Латвия), что соответствует 1,5×10⁸ КОЕ/мл для бактериальных культур. Для метода разведения в агаре готовили разведение инокулята 1,5×10⁷ КОЕ/мл, разводя исходный инокулят 1:10.

Изучение МПК проводили микрометодом серийных разведений в бульоне Mueller-Hinton Broth («Beckton, Dickinson», Франция) и в агаре Mueller-Hinton Agar («Himedia», Индия), в соответствии с процедурой, рекомендованной «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» Версия 2021-01. Принцип метода основан на показателе чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Показателем чувствительности является величина МПК (мкг/мл), т. е. минимальной концентрации антимикробных средств, задерживающей видимый рост испытуемого штамма микроорганизма в стандартном опыте.

Определение МПК в бульоне осуществляли в 96-луночных планшетах для иммунологических исследований. При подготовке планшет в первый ряд планшет вносили:

1. Цефепим в концентрации 64 мкг/мл в объеме 100 мл

2. Комбинацию: цефепим 64 мкг/мл + 8 мкг/мл авибактама + 2 мкг/мл сульбактама в объеме 100 мкл

3. Комбинацию: цефепим 64 мкг/мл+8 мкг/мл авибактама+8 мкг/мл сульбактама в объеме 100 мкл.

Далее готовили серии двукратных разведений в объеме 50,0 мкл:

1. Для цефепима только в бульоне.

2. Для комбинации: цефепим 64 мкг/мл + 8 мкг/мл авибактама + 2 мкг/мл сульбактама в бульоне, содержащем 8 мкг/мл авибактама + 2 мкг/мл сульбактама в объеме 50 мкл.

3. Для комбинации: цефепим 64 мкг/мл + 8 мкг/мл авибактама + 8 мкг/мл сульбактама в бульоне, содержащем 8 мкг/мл авибактама + 8 мкг/мл сульбактама в объеме 50 мкл.

В подготовленные разведения вносили 50 мкл инокулята. Таким образом, получали концентрации:

1. Цефепим в диапазоне 32-0,015 мкг/мл

2. Комбинация цефепим + сульбактам 1 + авибактам 4: цефепим в диапазоне 32- 0,015 мкг/мл и фиксированные концентрации: цефепим 32 мкг/мл, сульбактам 1 мкг/мл и авибактам 4 мкг/мл

3. Комбинация цефепим + сульбактам 4 + авибактам 4: цефепим в диапазоне 32- 0,015 мкг/мл и фиксированные концентрации: цефепим 32 мкг/мл, сульбактам 4 мкг/мл и авибактам 4 мкг/мл.

Для метода двукратных серийных разведений в агаре готовили концентрации антибиотиков и ингибиторов в 10 раз превосходящих максимально исследуемые, затем приготавливали двукратные разведения рабочих растворов. В чашки Петри вносили рабочие растворы только антибиотика или его сочетания с ингибиторами в количестве 2 мл, добавляли 18 мл расплавленный и остуженный до 48-50°С агар и тщательно перемешивали и оставляли до полного застывания. Для контроля роста изучаемых микроорганизмов и референтных штаммов готовили чашки с питательным агаром без антибиотиков и ингибиторов. Приготовленные чашки использовали в тот же день. Для посева использовали репликатор с размером штифтов 3 мм.

Критерием точности полученных результатов при постановке эксперимента служили контрольные штаммы S. aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, для которых определены значения МПК. При соблюдении стандартности условий эксперимента МПК эталонных штаммов не должны выходить за доверительные пределы, представленные в документе [Методические рекомендации: «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» Версия 2021-01 https://www.antibiotic.ru/files/321/clrec-dsma2021.pdf].

Планшеты или чашки с тестируемыми штаммами для определения МПК инкубировали в обычной атмосфере при температуре (36±1)°С в течение 18–24 часов.

Для определения наличия роста планшеты и чашки с посевами просматривали в проходящем свете. Рост культур в присутствии анализируемых образцов сравнивали с «отрицательным контролем», содержащим исходный инокулят. МПК определяется по наименьшей концентрации антибиотика, которая подавляет видимый рост микроорганизмов.

Данные представлены в виде абсолютных значений, диапазона концентраций, а также МПК₅₀, МПК₉₀, для количественного сравнения и анализа тенденций сводных данных рассчитывали среднее геометрическое значение МПК.

Приготовление рабочих растворов исследуемых препаратов

Приготовление растворов цефепима

Основной раствор цефепима с концентрацией 5000 мкг/мл готовили из лекарственной формы с активностью 538,87 мкг/мг (в соответствии с паспортом №20 от 12.2020). Количество вносимого разбавителя, стерильной воды, рассчитывали по формуле (1):

где V- количество вносимого разбавителя (мл).

Для метода разведения в агаре основной раствор цефепима разводили до концентрации 320 мкг/мл, для метода серийных разведений в бульоне приготавливали раствор с содержанием цефепима 64 мкг/мл.

Приготовление растворов авибактама

Для получения основного раствора исследуемого соединения с концентрацией 5000 мкг/мл, навеску растворяли в стерильной дистиллированной воде по формуле (1) с учетом содержания активного вещества 900 мкг/мг (Сертификат анализа от 2022-05-31).

Для получения рабочего раствора основной раствор разводили в питательной среде до необходимой концентрации.

Полученный рабочий раствор использовали при постановке эксперимента.

Приготовление раствора сульбактама

Для получения основного раствора исследуемого соединения с концентрацией 5000 мкг/мл, навеску растворяли в стерильной дистиллированной воде по формуле (1) с учетом содержания активного вещества 911 мкг/мг (Сертификат анализа от 2022-05-31).

Для получения рабочего раствора основной раствор разводили в питательной среде до необходимой концентрации.

Полученный рабочий раствор использовали при постановке эксперимента.

Приготовление растворов 8 мкг/мл авибактам + 2 мкг/мл сульбактам.

Основные растворы авибактама и сульбактама (5000 мкг/мг) вносили в 30 мл питательного бульона в объеме: авибактам 80 мкл, сульбактам 20 мкл, доводили питательным бульоном до 50 мл.

Приготовление растворов цефепим + 8 мкг/мл авибактам + 8 мкг/мл сульбактам.

Основные растворы авибактама и сульбактама (5000 мкг/мг) вносили в 30 мл питательного бульона в объеме: авибактам 80 мкл, сульбактам 80 мкл, доводили питательным бульоном до 50 мл.

Приготовление раствора Завицефта (цефтазидим+авибактам)

Основной раствор Завицефта с концентрацией цефтазидима 2000 мкг/мл готовили из лекарственной формы с активностью цефтазидима 638 мкг/мг (в соответствии с сертификатом анализа от 08 июня 2020 г.). Количество вносимого разбавителя, стерильной воды, рассчитывали по формуле (1).

Для получения рабочего раствора основной раствор цефтазидим+авибактам с концентрацией 2000 мкг/мл по цефтазидиму разводили в питательной среде до концентрации 128 мкг/мл (0,32 мл основного раствора доводили питательной средой до 5 мл), 64 мкг/мл (0,16 мл основного раствора до 5 мл питательного бульона). Полученный рабочий раствор использовали при постановке экспериментов микрометодом серийных разведений в бульоне для определения МПК или для перекрестного титрования.

Для постановки анализа с меньшей концентрацией рабочий раствор разводили до необходимой экспериментальной концентрации после расчета по формуле (2 и 3). Для определения МПК используется фиксированная концентрация авибактама 4 мг/л. Для этого, готовили серии разведений антибиотиков в бульоне, содержащем авибактама в концентрации 4 мкг/мл.

Точность приготовления растворов антимикробных препаратов оценивали по минимальной подавляющей концентрации контрольных штаммов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для анализа активности в отношении комбинации цефепим+ авибактам + сульбактам отобраны грамотрицательные микроорганизмы, включая изоляты с фенотипической устойчивостью к цефепиму.

Устойчивые к цефепиму изоляты грамотрицательных микроорганизмов представлены в основном штаммами Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa и Klebsiella pneumoniae и реже Escherichia coli.

Оценка активности микрометодом серийных разведений в бульоне показала, что значения МПК контрольных штаммов не выходят за доверительные интервалы критериев чувствительности микроорганизмов к исследуемым препаратам (см. таблицу 1).

Таблица 1.

Контроль качества приготовленных растворов исследуемых препаратов.

Антибиотик МПК контрольный штаммов (мкг/мл) S. aureus
ATCC 29213 E.coli
ATCC 25922 P.aeruginosa ATCC 27853 Цефепим 1-2
(1-4)* 0,03-0,06
(0,015-0,12)* 1-4
(0,5-4)*

*границы чувствительности контрольных штаммов [Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for An-timicrobial Susceptibility Testing, 28th ed.; CLSI Supplement M100; Clinical and La-boratory Standards Institute: Wayne, PA, USA, 2018; ISBN1 978-1-68440-066-9. [Print]; ISBN2 978-1-68440-067-6]

Результаты оценки чувствительности (МПК) бактериальных патогенов (клинических изолятов), использованных в исследовании, приведенные в таблице 2.

Таблица 2.

Активность исследуемых комбинаций антибиотиков к клиническим изолятам.

Значения МПК*
Мкг/мл Цефтазидим +
Авибактам 4:1 Цефепим Цефепим + Авибактам 4:1 Цефепим +
Сульбактам 1:1 Цефепим + Сульбактам + Авибактам 4:1:1 Цефепим+Сульбактам
+Авибактам 4:2:1 P.aeruginosa (N19) Диапазон 0,5-4 1-32 1-8 1-32 1-16 1-8 МПК50 2 8 4 8 8 4 МПК90 4 16 8 16 8 8 K. pneumoniae (N 23) Диапазон ≤0,015-16 1-32 ≤0,015-16 1-16 ≤0,015-4 ≤0,015-0,25 МПК50 0,125 16 0,03 8 0,06 0,03 МПК90 0,5 32 0,25 16 0,125 0,125 E. coli (N18) Диапазон ≤0,015-1 0,03-32 ≤0,015-0,125 0,03-16 ≤0,015-0,25 ≤0,015-0,125 МПК50 0,125 16 ≤0,015 1 0,015 ≤0,015 МПК90 0,25 32 0,06 8 0,06 0,06 Proteus spp (N15) Диапазон ≤0,015-2 0,03-32 ≤0,015-2 0,03-4 ≤0,015-1 ≤0,015-1 МПК50 ≤0,015 0,125 ≤0,015 0,06 ≤0,015 ≤0,015 МПК90 0,25 8 0,125 2 0,125 0,125 Остальные Enterobacteriaceae (N 21)
(Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Citrobacter spp) Диапазон ≤0,015-32 ≤0,015-32 ≤0,015-1 ≤0,015-16 ≤0,015-1 ≤0,015-0,5 МПК50 0,125 0,06 0,03 0,06 0,03 0,03 МПК90 8 16 0,5 16 0,5 0,125 Acinetobacter (N14) Диапазон 4-32 4-≥32 4-≥32 2-8 1-8 ≤0,015-0,25 МПК50 16 8 8 4 4 ≤0,015 МПК90 32 ≥32 16 8 8 0,125

*МПК - минимальная подавляющая концентрация – минимальная концентрация антибиотика, вызывающая Полное подавление роста на средах в стандартных условиях опыта. Измеряется в мкг/мл.

МПК 50 – МПК для 50% исследованных штаммов

МПК 90 - МПК для 90% исследованных штаммов

Чем меньше МПК, тем меньшее количество антибиотика необходимо для подавления бактерии, значит он более эффективен. МПК >8 мкг/мл говорят о резистентности бактерии к данному антибиотику

Результаты показывают, что тройная комбинация цефепима с сульбактамом и авибактамом по влиянию на P.aeruginosa по эффективности не отличается от двойной комбинации цефепим с фиксированной концентрацией авибактама 4:1 и на одно разведение выше, чем для комбинации цефтазидим+авибактам 4:1.

Не выявлено значительных отличий эффективности между комбинациями: цефепим+ авибактам 4:1 и цефепим + сульбактам + авибактам 4:2:1 в отношении клинических изолятов E. coli и Proteus spp.

Но при этом тройная комбинация цефепима с сульбактамом и авибактамом в соотношении 4:2:1 обеспечивает эффективность в отношении всех основных патогенов, включая полирезистентные штаммы, продуцирующие варианты ESBL типов TEM, SHV и CTX-M: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa.

Также, из таблицы 2 видно, что решение по прототипу (Цефепим + Сульбактам в соотношении 1:1) малоэффективно в отношении P.aeruginosa, K. pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Citrobacter spp, которые лидируют среди возбудителей внутрибольничных инфекций и вместе занимают более 75% выявленных патогенов. А в отношении E. coli, Acinetobacter композиция по прототипу находится на пределе эффективности.

Аналогичным образом, из таблицы 2 видно, что отдельные композиции Цефтазидим + Авибактам в соотношении 4:1, а также Цефепим + Авибактам в соотношении 4:1 близки по эффективности, но не для всех штаммов Acinetobacter резистентность явно выражена по отношению к обеим композициям. На пределе эффективности композиции по Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Citrobacter spp и P.aeruginosa, соответственно.

Таким образом, отдельные комбинации Цефепим + Авибактам, а также Цефепим + Сульбактам не могут свидетельствовать о комплексной эффективности против основных патогенов, включая полирезистентные штаммы, продуцирующие варианты ESBL типов TEM, SHV и CTX-M: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa.

Подход к выбору оптимального соотношения для композиции Цефепим + Сульбактам + Авибактам основывался на оценке наибольшей эффективности Цефепим + Авибактам в соотношении 4:1. Опытным путем подбор композиции Цефепим + Сульбактам + Авибактам брался изначально в соотношении 4:1:1, затем соотношения меняли и исследовали эффективность каждого.

По результатам исследований выявили оптимальную эффективность при выборе соотношения композиции Цефепим + Сульбактам + Авибакам - 4:2:1, соответственно.

Так, в композиции Цефепим + Сульбактам + Авибактам в соотношении 4:1:1, по P.aeruginosa и Acinetobacter достигается предел эффективности, тогда как в композиции Цефепим + Сульбактам + Авибактам в соотношении 4:2:1, предел эффективности ограничен только по P.aeruginosa.

По остальным штаммам основных патогенов соотношение 4:2:1 показало хорошие результаты эффективности. Определено значительное увеличение чувствительности для изолятов K. pneumoniae и A.baumannii. Тройная комбинация цефепим+ сульбактам + авибактам (4:2:1) в отношении K. pneumoniae превосходило по значениям МПК комбинацию цефепим + сульбактам + авибактам (4:1:1).

A. baumannii проявляет повышенную чувствительность к тройной комбинации с фиксированными концентрациями авибактама и сульбактама 4 мкг/мл (4:2:1), значения МПК₅₀ менее 0,015 мкг/мл, самой низкой концентрации, использованной в исследовании. Однако, тройная комбинация цефепима с фиксированной концентрацией сульбактама 1 мкг/мл (4:1:1) практически не отличается от комбинации цефепим+сульбактам 1:1.

В работе дополнительно исследовали влияние тройных комбинаций для 4-х новых штаммов клинических изолятов K. pneumoniae и P. aeruginosa, устойчивых к карбапенемам. Представленные в таблице 3 результаты оценки чувствительности этих изолятов демонстрируют снижение значений МПК штаммов K. pneumoniae, однако штамм P.aeruginosa не проявляет чувствительности к исследованным комбинациям.

Таблица 3.

Сравнительная активность цефепима и его комбинаций с ингибиторами.

Штамм Цефепим Цефепим/ сульбактам/ авибактам 4:1:1* Цефепим/ сульбактам/ авибактам 4:2:1** K. pneumoniae 12 32 0,25 0,25 16 >32 1 0,5 14 >32 4 1 P.aeruginosa 1 >32 >32 >32

*цефепим + фиксированные концентрации сульбактама 1 мкг/мл + авибактам 4 мкг/мл

** цефепим + фиксированные концентрации сульбактама 4 мкг/мл + авибактам 4 мкг/мл

Анализ чувствительности штаммов, продуцирующих БЛРС показал (см. таблицу 4), что цефепим/сульбактам/авибактам с фиксированной концентрацией 4 мкг/мл лидирует по активности (среднее геометрическое значение МПК составляет 0,037 мкг/мл). Несколько меньшая активность у комбинации цефепима с комбинацией 1 мкг/мл сульбактам/4 мкг/мл авибактам (средняя геометрическая 0,049 мкг/мл). Штамм Klebsiella pneumoniae 123 по чувствительности к этим комбинациям значительно превосходит цефтазидим + 4 мкг/мл авибактам.

В ходе исследований также проверялось дальнейшее изменение соотношений по увеличению доли ингибиторов авибактама и сульбактама.

Данная проверка показала, что в тройной комбинации цефепима с фиксированной концентрацией ингибиторов сульбактам и авибактам увеличение доли ингибиторов резко снижает активность.

Результаты исследований показаны в таблице 5.

Снижение активности тройной комбинации цефепима с фиксированной концентрацией ингибиторов сульбактам и авибактам, когда она меняется от соотношения 4:2:1 в сторону увеличения ингибиторов, по всей видимости, обусловлено снижением процентной доли цефепима.

Из чего сделан вывод о бесперспективности дальнейших исследований изменения соотношения 4:2:1 для комбинации Цефепим + Сульбактам + Авибактам в сторону увеличения ингибиторов.

Таким образом, результаты исследований продемонстрировали высокую активность тройной комбинации цефепима с фиксированной концентрацией ингибиторов сульбактам и авибактам именно в строгом соотношении 4:2:1 по отношению к стандартным штаммам и клиническим изолятам грамотрицательных патогенов, включая полирезистентные штаммы, продуцирующие варианты ESBL типов TEM, SHV и CTX-M: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa.

В отношении A. baumannii, включая штаммы с пониженной чувствительностью к сульбактаму комбинация цефепима с сульбактамом и авибактамом в соотношении 4:2:1 МПК50-90 составили ≤0,015 мкг/мл и 0,125 мкг/мл, соответственно, что значимо превосходит показатели других сравниваемых антибиотиков и комбинаций.

В отношении K. pneumoniae, исследованные комбинации цефепим + сульбактам + авибактам в соотношении 4:2:1 и 4:1:1 по активности сравнимы с цефепимом в комбинации авибактамом 4:1 и значительно превосходят активность существующей комбинации цефтазидим / авибактам 4:1.

В отношении Ps.aeruginosa исследованные тройные комбинации имеют статистически не значимые отличия по активности в сравнении с комбинацией цефтазидим + авибактам 4:1.

Следовательно, композиция цефепима с сульбактамом и авибактамом в соотношении 4:2:1 по совокупности показателей активности против основных возбудителей полирезистентных нозокомиальных инфекций превосходит все известные на сегодня существующие и перспективные комбинации с использованием цефепима, цефепима и авибактама, цефепима и сульбактама.

При этом, активность тройной комбинации цефепима с фиксированной концентрацией ингибиторов сульбактам и авибактам в соотношении 4:2:1 по отношению к стандартным штаммам и клиническим изолятам грамотрицательных, полирезистентных патогенов имеет явно выраженный синергетический эффект, который обеспечивается заявленной в изобретении композицией на существенно большем уровне, чем эффект, который получается от использования отдельных комбинаций цефепим + авибактам и цефепим + сульбактам.

Предложенная в изобретении антибактериальная композиция преимущественно ориентирована для лечения инфекций, вызванных основными грамотрицательными патогенами, включая полирезистентные штаммы, продуцирующие варианты бета-лактамазы ESBL типов TEM, SHV и CTX-M: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa, но и не исключается ее использование против иных штаммов бактерий, особенно семейства Enterobacteriaceae. Формы клинического применения заявленной композиции настоящим изобретением не заявляются, причем допускается применение композиции в форме порошка, лиофилизата, готовых растворов, в твердых лекарственных формах, как то, таблетки и капсулы, и в виде суппозиториев или иных лекарственных формах.

Задача обеспечения стабильности сохранения тройной комбинации цефепима с фиксированной концентрацией ингибиторов сульбактам и авибактам в соотношении 4:2:1 лежит на производителе лекарственных средств и является предметом дальнейших исследований.

Изобретение относится к антибактериальным композициям и может найти применение для лечения бактериальных инфекций, вызванных основными полирезистентными грамотрицательными патогенами. Предложено применение комбинации для лечения бактериальных инфекций, вызванных основными полирезистентными грамотрицательными патогенами Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, и/или Pseudomonas aeruginosa, продуцирующими варианты бета-лактамазы ESBL типов TEM, SHV и/или CTX-M, которая представляет собой смесь, включающую цефалоспориновый антибиотик цефепим, ингибитор бета-лактамаз сульбактам и ингибитор ферментов авибактам в соотношении 4:2:1 (мас.), соответственно. Изобретение обеспечивает повышение эффективности комбинации антибиотиков по отношению к стандартным штаммам и клиническим изолятам грамотрицательных патогенов, включая полирезистентные штаммы, продуцирующие варианты ESBL типов TEM, SHV и CTX-M. 5 табл.

Применение комбинации для лечения бактериальных инфекций, вызванных основными полирезистентными грамотрицательными патогенами Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, и/или Pseudomonas aeruginosa, продуцирующими варианты бета-лактамазы ESBL типов TEM, SHV и/или CTX-M, которая представляет собой смесь, включающую цефалоспориновый антибиотик цефепим, ингибитор бета-лактамаз сульбактам и ингибитор ферментов авибактам в соотношении 4:2:1 (мас.), соответственно.