СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕВОФЛОКСАЦИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО СЕНСОРА НА ОСНОВЕ ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННОГО ФУЛЛЕРЕНА И ВОССТАНОВЛЕННОГО ОКСИДА ГРАФЕНА Российский патент 2024 года по МПК G01N27/48 

Изобретение относится к области аналитической химии, и может быть использовано в лабораторных исследованиях по определению левофлоксацина в биологических жидкостях и продуктах питания.

Антибиотики - важнейшая группа лекарственных соединений, применяемая для лечения и профилактики инфекционных заболеваний не только у людей, но и у крупного рогатого скота и птиц в сельскохозяйственной промышленности. Злоупотребление антибактериальными препаратами приводит к их накоплению в продуктах питания животного происхождения, что вызывает аллергическую гиперчувствительность у людей, а в некоторых случаях и прямые токсичные эффекты. Следовательно, возникает потребность в разработке чувствительных и селективных методик определения антибактериальных препаратов, как средств контроля за их содержанием.

Левофлоксацин - антибиотик, относящийся к группе фторхинолонов III поколения, широко применяемый в сельском хозяйстве и ветеринарии. Фторхинолоны, и левофлоксацин в частности, обладают высокой токсичностью, максимальный допустимый уровень фторхинолонов в продуктах питания составляет 100-500 мкг/кг.

Существуют различные методы определения фторхинолонов в реальных объектах. Одним из основных является иммуноферментный анализ, характеризующийся высокой селективностью и надежностью, однако требует специфичных условий проведения (строгий температурный режим и стерильность), сложной пробоподготовки, а также обладает высокой стоимостью реагентов. Хорошо себя зарекомендовали биосенсоры с применением ферментов, антител, аптамеров и клеток, но применение биологических материалов сопровождается схожими с иммуноферментным анализом недостатками [Gaudin V. Advances in biosensor development for the screening of antibiotic residues in food products of animal origin - A comprehensive review // Biosens. Bioelectron. 2017. V. 90. P. 363. DOI: 10.1016/j.bios.2016.12.005].

Наиболее популярным методом определения фторхинолонов является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с различными детекторами. Так, например, в работе [Kardani F., Mirzajani R., Tamsilian Y., Kiasat A. The residual determination of 39 antibiotics in meat and dairy products using solid-phase microextraction based on deep eutectic solvents@UMCM-1 metal-organic framework /molecularly imprinted polymers with HPLC-UV // Food Chem. Adv. 2023. V. 2. P. 100173. DOI: 10.1016/j.focha.2022.100173] предложено определение 39 антибиотиков методом ВЭЖХ-УФ с применением твердофазной микроэкстракции с помощью глубоких эвтектических растворителей. Определение проводится с помощью системы ВЭЖХ (KNAUER), оснащенной УФ-детектором (Smartline Detector 2600), двойным насосом (Smartline Pump 1000), дегазатором и инжекторным клапаном (model D 14163 Berlin). Антибиотики разделяются на колонке Eurospher 100-5 C₁₈ (4.6 мм × 250 мм, размер частиц 5 мкм) при 40°C, скорость прохождения раствора 0.5 мл/мин. Объем пробы 100 мкл, длина волны 280 и 275 нм. В качестве подвижной фазы используется 0.2% раствор муравьиной кислоты в воде и метанол. Время анализа составляет около часа.

Несмотря на возможность определения различных соединений с высокой точностью, ВЭЖХ обладает и рядом существенных недостатков, таких как сложная пробоподготовка, включающая стадию экстракции с использованием токсичных соединений, а также высокая стоимость оборудования.

Технический результат заявленного изобретения - обеспечение высокой чувствительности и селективности при определении левофлоксацина в реальных образцах с сокращением времени проведения анализа.

Технический результат достигается способом определения левофлоксацина с помощью вольтамперометрического сенсора в продуктах питания животного происхождения и биологических жидкостях, включающим полировку поверхности рабочего стеклоуглеродного электрода деагломерированной суспензией Al₂O₃, нанесение капельным методом на поверхность электрода дисперсии оксида графена в диметилформамиде объемом 0.6 мкл с концентрацией оксида графена 4 мг/мл, электрохимическое восстановление в фосфатном буферном растворе с pH 6.86 при потенциале -0.8 В в течение 130 с, высушивание под инфракрасной лампой в течении 90 с, нанесение капельным методом на поверхность электрода, покрытую электровосстановленным оксидом графена, раствора S-N,N’-бис(1-фенилэтил)малонамида фуллерена либо S-2-хлоро-N-(1-фенилэтил)ацетамида фуллерена в толуоле объемом 1.5 мкл с концентрацией растворенного вещества 0.25 мг/мл, высушивание под инфракрасной лампой в течении 30 с, погружение модифицированного электрода в раствор исследуемого образца, разбавленного гидрофталатным буферным раствором с pH 4.01, регистрацию аналитического сигнала левофлоксацина в диапазоне потенциалов от 1.00 до 1.01 В в режиме дифференциально-импульсной вольтамперометрии с параметрами: диапазон потенциалов от 0.6 до 1.5 В, амплитуда 0.075 В, время модуляции 0.075 с, скорость сканирования 30 мВ/с, определение концентрации левофлоксацина по предварительно построенному на основе экспериментов градуировочному графику.

Используемые модифицированные вольтамперометрические сенсоры СУЭ/вОГ/S-C60AA и СУЭ/вОГ/S-C60MA характеризуются не только экспрессностью проведения анализа, но и относительно невысокой стоимостью. Также применение вольтамперометрических сенсоров в анализе реальных объектов сложного состава позволяет нивелировать значительное влияние матрицы эндогенных веществ без предварительного выделения и разделения определяемых веществ.

Чувствительный слой используемого сенсора состоит из восстановленного оксида графена и функционализированного фуллерена. Оксид графена широко используется в качестве углеродсодержащей подложки, улучшающей аналитические характеристики сенсора за счет своей высокой проводимости и электрокаталитических свойств. Функционализация фуллерена по реакции Бингеля-Хирша позволяет получать селекторы с различными функциональными группами и конфигурацией. Подбор функциональных групп, генерирующих различные межмолекулярные взаимодействия с аналитом (π-π стекинг между ароматическими фрагментами, электростатические взаимодействия между кислотными и основными группами, водородные связи, гидрофобные взаимодействия, и др.) позволяет добиться максимальной селективности. В исследовании [Zagitova L.R., Abramov I.A., Zagitov V.V., Gainanova S.I., Maistrenko V.N. Effect of the chiral blocks of functionalized fullerene on levofloxacin enantioselective voltammetric sensing // J. Electroanal. Chem. 2023. V. 940. P. 117508. DOI: 10.1016/j.jelechem.2023.117508] показано, что лучшими аналитическими характеристиками при определении левофлоксацина обладают сенсоры с использованием S-N,N’-бис(1-фенилэтил)малонамида фуллерена (S-C60AA) и S-2-хлоро-N-(1-фенилэтил)ацетамида фуллерена (S-C60MA).

Получение чувствительного слоя проводится послойным нанесением оксида графена и функционализированного фуллерена. Сначала на поверхность стеклоуглеродного электрода (СУЭ), предварительно отполированного деагломерированной суспензией Al₂O₃ (0.3 мкм), капельным методом наносится дисперсия оксида графена (ОГ) в диметилформамиде (0.6 мкл, 4 мг/мл), затем высушивается под ИК-лампой, и далее электрохимически восстанавливается в фосфатном буфере (0.05 М KH₂PO₄/Na₂HPO₄, pH 6.86) при потенциале -0.8 В в течение 130 с, повторно высушивается под ИК-лампой, после капельным методом наносится раствор S-N,N’-бис(1-фенилэтил)малонамида фуллерена либо S-2-хлоро-N-(1-фенилэтил)ацетамида фуллерена в толуоле (1.5 мкл, 0.25 мг/мл), затем высушивается под ИК-лампой.

Определение левофлоксацина проводится методом дифференциально-импульсной вольтамперометрии (ДИВ, диапазон потенциалов от 0.6 В до 1.5 В, амплитуда 0.075 В, время модуляции 0.075 с, скорость сканирования 30 мВ/с) с использованием трехэлектродной ячейки и потенциостата Corrtest CS100 в буферном растворе гидрофталата калия (0.05 М KHC₈H₄O₄, pH 4.01). Аналитический сигнал левофлоксацина наблюдается при потенциале от 1.00 до 1.01 В. Среднее время измерения, с учетом получения чувствительного слоя, составляет 8 минут.

На фигуре 1 представлены экспериментально определенные дифференциально-импульсные вольтамперограммы (фиг. 1а, 1в) и градуировочные графики (фиг. 1б, 1г) растворов левофлоксацина (буферный раствор гидрофталата калия pH 4.01) в диапазоне концентраций 0.001 - 0.03 мМ с использованием СУЭ/эвОГ/S-C60AA (вставки: в диапазоне 0.03 - 0.5 мМ; а, б) и в диапазоне концентраций 0.001 - 0.06 мМ с использованием СУЭ/эвОГ/S-C60MA (вставки: в диапазоне 0.06 - 0.5 мМ; в, г). Количество измерений = 5, доверительная вероятность = 0.95. I - сила тока, мкА; I_p - ток пика окисления левофлоксацина, мкА; E - потенциал, В; c - концентрация левофлоксацина, мМ; R² - коэффициент детерминации.

Таким образом, подобранные условия позволяют количественно определять левофлоксацин с высокой чувствительностью в диапазоне концентраций 1⋅10^-6 - 3⋅10^-5 М и 3⋅10^-5 - 5⋅10^-4 М с пределом обнаружения и нижней границей определяемых концентраций 3.7×10^-8 и 1.2×10^-7 М соответственно для сенсора СУЭ/вОГ/S-C60AA (фиг. 1а, 1б) и 1⋅10^-6 - 6⋅10^-5 М и 6⋅10^-5 - 5⋅10^-4 М с пределом обнаружения и нижней границей определяемых концентраций 1.8×10^-7 и 6.04×10^-7 М для сенсора СУЭ/вОГ/S-C60MA (фиг. 1в, 1г).

Пример 1. Определение содержания левофлоксацина в биологических жидкостях и таблетированных формах с использованием СУЭ/эвОГ/S-C60AA методом «введено-найдено».

К образцам урины и плазмы крови (2 мл) добавляют известное количество левофлоксацина, а затем разбавляют буферным раствором гидрофталата калия (0.05 М KHC₈H₄O₄, pH 4.01) в 10 раз для получения растворов с концентрациями 4, 15 и 35 мкМ.

Таблетку левофлоксацина измельчают, растворяют в 100 мл буферного раствора гидрофталата калия (0.05 М KHC₈H₄O₄, pH 4.01) и последовательным разбавлением готовят растворы с концентрациями 4, 15 и 35 мкМ.

Полученный раствор переносят в стаканчик вместимостью 20 мл и проводят ДИВ определение левофлоксацина (диапазон потенциалов от 0.6 В до 1.5 В, амплитуда 0.075 В, время модуляции 0.075 с, скорость сканирования 30 мВ/с). Пик окисления левофлоксацина регистрируют в диапазоне от 1.00 до 1.01 В. Концентрацию определяют по градуировочному графику (фиг.1). Результаты дифференциально-импульсного вольтамперометрического определения левофлоксацина с использованием СУЭ/эвОГ/S-C60AA приведены в таблице 1 (количество измерений = 5, доверительная вероятность = 0.95).

Таблица 1

Образец Введено, мкМ Найдено, мкМ Стандартное отклонение s_r, % Степень открытия, % Урина 4 3.8 ± 0.2 2.4 95.9 15 15.2 ± 0.5 1.2 101.2 35 35.8 ± 0.9 1.0 102.3 Плазма крови 4 3.7 ± 0.3 3.5 91.5 15 14.8 ± 0.3 0.8 98.7 35 34.7 ± 0.6 0.7 99.2 Таблетка 4 4.2 ± 0.2 2.2 103.9 15 15.3 ± 0.5 0.4 102.1 35 36.7 ± 1.8 1.7 104.4

Использование предлагаемого способа определения левофлоксацина с помощью сенсора СУЭ/эвОГ/S-C60AA в биологических жидкостях и таблетированных формах позволяет по сравнению с существующими способами снизить время проведения анализа до 20 минут с учетом пробоподготовки, сохраняя при этом высокую точность и селективность определения, что подтверждается небольшим стандартным отклонением 0.4 - 3.5% и близкой к 100% степенью открытия.

Пример 2. Определение содержания левофлоксацина в молоке и мясе с использованием СУЭ/эвОГ/S-C60MA методом «введено-найдено».

Предварительно из анализируемого образца молока отбирают 10 мл, смешивают с 10 мл буферного раствора гидрофталата калия (0.05 М KHC₈H₄O₄, pH 4.01) и вносят добавку левофлоксацина для достижения концентраций 4, 15 и 35 мкМ.

Из анализируемого образца мяса отбирают 10 г, перемешивают с 10 мл буферного раствора гидрофталата калия (0.05 М KHC₈H₄O₄, pH 4.01), термостатируют при 37±1°C в течение 90 мин, затем при 65±1°C в течение 30 мин, после чего центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин. В полученный супернатант вносят добавку левофлоксацина для получения растворов с концентрациями 4, 15 и 35 мкМ.

Полученный раствор переносят в стаканчик вместимостью 20 мл и проводят дифференциально-импульсное вольтамперометрическое определение левофлоксацина (диапазон потенциалов от 0.6 В до 1.5 В, амплитуда 0.075 В, время модуляции 0.075 с, скорость сканирования 30 мВ/с). Пик окисления левофлоксацина регистрируют в диапазоне от 1.00 до 1.01 В. Концентрацию определяют по градуировочному графику (фиг. 1). Результаты дифференциально-импульсного вольтамперометрического определения левофлоксацина с использованием СУЭ/эвОГ/S-C60MA (количество измерений = 5, доверительная вероятность = 0.95) приведены в таблице 2.

Таблица 2

Образец Введено, мкМ Найдено, мкМ Стандартное отклонение
s_r, % Степень открытия, % Мясо 4 3.6 ± 0.4 3.9 90.0 15 14.9 ± 1.1 2.9 99.1 35 35.6 ± 1.6 1.8 101.8 Молоко 4 3.5 ± 0.7 8.0 87.6 15 15.3 ± 1.2 3.2 102.2 35 35.6 ± 0.6 0.7 101.7

Использование предлагаемого способа определения левофлоксацина с помощью сенсора СУЭ/эвОГ/S-C60MA позволяет снизить время проведения анализа до 20 и 150 минут с учетом пробоподготовки в образцах молока и мяса соответственно. При этом сохраняется высокая точность и селективность определения, что подтверждается значениями стандартного отклонения 0.7 - 8.0% и степени открытия 87.6 - 102.2%

Таким образом, предлагаемый способ позволяет обеспечить высокую чувствительность и селективность при определении левофлоксацина в реальных образцах с сокращением времени проведения анализа.

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в лабораторных исследованиях по определению левофлоксацина в биологических жидкостях и продуктах питания. Сущность изобретения, характеризующего способ определения левофлоксацина в биологических жидкостях и продуктах питания, основана на способности левофлоксацина окисляться в водных растворах на стеклоуглеродном электроде и заключается в переводе левофлоксацина в водный раствор и прямом вольтамперометрическом определении в буферном растворе гидрофталата калия (0.05 М KHC₈H₄O₄, pH 4.01) с регистрацией анодных пиков с помощью дифференциально-импульсной вольтамперометрии (диапазон потенциалов от 0.6 до 1.5 В, амплитуда 0.075 В, время модуляции 0.075 с, скорость сканирования 30 мВ/с). Концентрацию левофлоксацина определяют по высоте пика окисления в диапазоне потенциалов от 1.00 до 1.01 В с помощью градуировочного графика. Изобретение обеспечивает возможность создания чувствительного и экспрессного способа количественного определения левофлоксацина методом дифференциально-импульсной вольтамперометрии в реальных образцах. 1 ил., 2 табл.

Способ определения левофлоксацина вольтамперометрическим сенсором в продуктах питания животного происхождения и биологических жидкостях, включающий полировку поверхности рабочего стеклоуглеродного электрода деагломерированной суспензией Al₂O₃, нанесение капельным методом на поверхность электрода дисперсии оксида графена в диметилформамиде объемом 0.6 мкл с концентрацией оксида графена 4 мг/мл, электрохимическое восстановление в фосфатном буферном растворе с pH 6.86 при потенциале -0.8 В в течение 130 с, высушивание под инфракрасной лампой в течение 90 с, нанесение капельным методом на поверхность электрода, покрытую электровосстановленным оксидом графена, раствора S-N,N’-бис(1-фенилэтил)малонамида фуллерена либо S-2-хлоро-N-(1-фенилэтил)ацетамида фуллерена в толуоле объемом 1.5 мкл с концентрацией растворенного вещества 0.25 мг/мл, высушивание под инфракрасной лампой в течение 30 с, погружение модифицированного электрода в раствор исследуемого образца, разбавленного гидрофталатным буферным раствором с pH 4.01, регистрацию аналитического сигнала левофлоксацина в диапазоне потенциалов от 1.00 до 1.01 В в режиме дифференциально-импульсной вольтамперометрии с параметрами: диапазон потенциалов от 0.6 до 1.5 В, амплитуда 0.075 В, время модуляции 0.075 с, скорость сканирования 30 мВ/с, определение концентрации левофлоксацина по предварительно построенному на основе экспериментов градуировочному графику.