КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ИНГИБИТОР ПРОТЕАЗЫ, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК A61K38/17 A61K38/28 A61K38/55 A61K38/56 A61K9/48 A61P3/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[001] В настоящей заявке предложены пероральные композиции для введения терапевтических белков, которые содержат рекомбинантный ингибитор протеазы, демонстрирующие улучшенную устойчивую активность.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[002] Лекарства на основе белков/пептидов обычно подвергаются деградации в желудочно-кишечном тракте и/или не всасываются эффективно в кровоток из тонкого кишечника в биоактивной форме. Разработаны составы для перорального введения лекарств на белковой основе, таких как инсулин, эксенатид, другие гормоны и т.д.

[003] Ингибиторы трипсина и химотрипсина, полученные из сои (Glycine max), легко доступны и считаются безопасными для потребления человеком. Один из примеров такого ингибитора получил название SBTI (соевый ингибитор трипсина), который состоит из KTI (ингибитор трипсина Кунитца), который ингибирует трипсин, и BBI (ингибитор Боумена-Бирка), который ингибирует трипсин и химотрипсин. Известны различные коммерческие источники SBTI, и улучшенные способы выделения активных компонентов описаны, например, в публикации международной патентной заявки РСТ под номером WO/2013/114369, которая в полном объеме включена в настоящую заявку посредством ссылки.

[004] Был достигнут огромный прогресс и перспективы с точки зрения обеспечения технологической платформы для пероральной доставки терапевтических средств на основе пептидов, в частности, для терапевтических средств, направленных на метаболические состояния, и, учитывая это, трудно представить себе возможность их дальнейшего улучшения относительно существующего уровня техники.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[005] Теперь же неожиданно было показано, что стабильные пероральные композиции, включающие лекарственное средство на основе пептида/белка, усилитель/стабилизатор, омега-3 жирные кислоты и ингибитор(ы) протеазы, для которых уде продемонстрировано, что они обеспечивают устойчивую эффективность в пероральном препарате, могут быть улучшены, если ингибитор протеазы получен из рекомбинантного источника.

[006] SBTI, химически выделенный для получения отдельных препаратов чистых KTI и BBI, соответственно, имеющих известные количества BBI и KTI, известной чистоты и активности при включении в пероральные препараты, применяли для получения пероральных препаратов, содержащих терапевтические белки, которые эффективны при лечении известных болезней. Например, в публикации международной патентной заявки РСТ под номером WO/2013/114369, которая в полном объеме включена в настоящую заявку посредством ссылки, разработаны улучшенные способы очистки SBTI, в которых каждый продукт готовили в соответствии со своими собственными спецификациями до достижения высоких уровней активности, а уровни высокомолекулярных (MW) загрязняющих веществ свели к минимуму и достигли промышленного выхода препаратов высокой чистоты.

[007] Теперь же неожиданно обнаружили, что, когда ингибиторы протеаз готовили / получали из рекомбинантных гетерологичных средств получения, несмотря на общие этапы последующей очистки химически очищенных и рекомбинантно экспрессируемых протеазам, результирующая активность белка/пептида была выше и сохранялась в течение более длительного периода времени, когда в качестве исходного источника для получения протеазы применяли рекомбинантный источник.

[008] Настоящее изобретение обеспечивает пероральную фармацевтическую композицию, включающую терапевтический пептид или терапевтический белок до 100 килодальтон, хелатор двухвалентных катионов и выделенный рекомбинантно экспрессированный BBI.

[009] В некоторых вариантах реализации рекомбинантно экспрессируемый BBI имеет нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, или в некоторых вариантах реализации рекомбинантно экспрессируемый BBI имеет нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 97% идентичности с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, или в некоторых вариантах реализации рекомбинантно экспрессируемый BBI имеет нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 99% идентичности с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации рекомбинантно экспрессируемый BBI имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1.

[0010] В некоторых вариантах реализации рекомбинантно экспрессируемый BBI экспрессируется в дрожжевой системе экспрессии, которая, в некоторых вариантах реализации, представлена в системе экспрессии дрожжей Pichia pastoris.

[0011] В некоторых вариантах реализации рекомбинантно экспрессируемый BBI экспрессируется в гетер о логичной системе экспрессии, где кодирующая его нуклеотидная последовательность оптимизирована для применения кодонов в организме, применяемом в качестве такой гетер о логичной системы экспрессии.

[0012] В некоторых вариантах реализации состав дополнительно включает ингибитор трипсина, отличный от указанного BBI, которым в некоторых вариантах реализации является КТО, который в некоторых вариантах реализации химически очищен и, в некоторых вариантах реализации, экспрессируется рекомбинантно.

[0013] В некоторых вариантах реализации терапевтический белок может применяться в лечении субъекта с метаболическим заболеванием или нарушением. В некоторых вариантах реализации терапевтический пептид или терапевтический белок выбран из группы, состоящей из инсулина, гемагглютинина гриппа, нейраминидазы гриппа, глюкагона, интерферона гамма, интерферона бета, интерферона альфа, гормона роста, эритропоэтина, GLP-1 (глюкогонподобного пептида 1), аналога GLP-1, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), ренина, релизинг-фактор а гормона роста, паратиреоидного гормона, тиреотропного гормона, фолликулостимулирующего гормона, кальцитонина, лютеинизирующего гормона, глюкагона, фактора свертывания крови, фактора, препятствующего свертыванию, предсердного натрийуретического фактора, белка сурфактанта A (SP-A), белка сурфактанта В (SP-B), белка сурфактанта С (SP-C), белка сурфактанта D (SP-D), активатора плазминогена, бомбезина, гемопоэтического фактора роста (колоннестимулирующий фактор, множественный), фактора некроза опухоли (TNF), энкефалиназы, RANTES (регулируется при активации, нормальные Т-клетки экспрессируются и секретируются), воспалительного белка макрофагов человека (MIP-1-альфа), сывороточного альбумина, антимюллеровского гормона, релаксина, мышиного гонадотропин-рилизинг гормона, ДНКазы, ингибина, активина, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), нейротрофического фактора, нейротрофина-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), фактора роста нервов, тромбоцитарного фактора роста (PDGF), фактора роста фибробластов, трансформирующего фактора роста (TGF), инсулиноподобного фактора роста-I и -II (IGF-1 и IGF-II), дез(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста-1 (IGFBP-1), IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, фактора роста кератиноцитов, остеоиндуктивного фактора, костного морфогенетического белка (ВМР)-2, ВМР-7, колониестимулирующего фактора (CSF), интерлейкина (IL), супероксиддисмутазы, фактора ускорения распада, члена семейства хемокинов и фактора комплемента. В некоторых вариантах реализации терапевтический пептид или терапевтический белок выбран из группы, состоящей из инсулина и аналога GLP-1. В некоторых вариантах реализации терапевтический пептид или терапевтический белок выбран из группы, состоящей из инсулина и аналога GLP-1, лептина, костного морфогенетического белка, включая ВМР-4, и фактора роста нервов, включая NGF-1.

[0014] В некоторых вариантах реализации терапевтический пептид или терапевтический белок является иммуномодулятором, а в некоторых вариантах реализации терапевтический пептид или терапевтический белок представляет собой Глатирамера ацетат. В некоторых вариантах реализации терапевтический пептид или терапевтический белок обеспечивает аутотолерантность к аллергену или антигену, ассоциированному с аутоиммунным заболеванием.

[0015] В некоторых вариантах реализации терапевтический пептид или терапевтический белок можно применять для лечения, смягчения, прекращения, снижения частоты случаев или тяжести метаболического заболевания или нарушения.

[0016] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложена пероральная фармацевтическая композиция, как описано в настоящей заявке, для применения в качестве лекарственного средства для перорального введения терапевтического пептида или терапевтического белка субъекту.

[0017] В некотором аспекте пероральные фармацевтические композиции по настоящему изобретению предотвращают быструю деградацию терапевтического пептида или терапевтического белка у субъекта, или в некоторых вариантах реализации с перорально вводимых терапевтических пептидов или терапевтических белков у субъекта, или в некоторых вариантах реализации улучшают устойчивую биодоступности перорально вводимых терапевтических пептидов или терапевтических белков у субъекта. Согласно этому аспекту и в некоторых вариантах реализации устойчивая активность или устойчивая биодоступность перорально вводимых терапевтических пептидов или терапевтических белков превышает активность, полученную после применения идентичного в остальном перорального состава, включающего химически очищенный BBI вместо указанного выделенного рекомбинантно экспрессированного BBI.

[0018] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложено применение пероральных фармацевтических композиций, как описано в настоящей заявке, для перорального введения терапевтического белка субъекту. В некоторых вариантах реализации пероральная фармацевтическая композиция предотвращает быструю деградацию указанного терапевтического пептида или терапевтического белка у указанного субъекта. В некоторых вариантах реализации пероральная фармацевтическая композиция улучшает устойчивую активность перорально вводимых терапевтических пептидов или терапевтических белков у указанного субъекта. В некоторых вариантах реализации пероральная фармацевтическая композиция улучшает устойчивую биодоступности перорально вводимых терапевтических пептидов или терапевтических белков у указанного субъекта. В некоторых вариантах реализации применение обеспечивает терапевтически эффективное количество указанного пептида или белка, и при этом указанный BBI, или указанный терапевтический пептид, или терапевтический белок до 100 килодальтон, или их комбинация представлены в указанной композиции в более низкой концентрации, чем могла бы быть терапевтически эффективна в идентичном в остальном пероральном составе, включающем химически очищенный BBI вместо указанного выделенного рекомбинантно экспрессированного BBI, и при указанном применении достигать сопоставимого терапевтического эффекта у указанного субъекта.

[0019] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ перорального введения терапевтического пептида или терапевтического белка субъекту, причем способ включает этап введения субъекту пероральной фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке с пероральным введением терапевтического белка субъекту.

[0020] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ предотвращения деградации перорально вводимых терапевтических пептидов или терапевтических белков субъекту, причем указанный способ включает этап введения субъекту пероральной фармацевтической композиции, как описано в настоящей заявке.

[0021] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ улучшения устойчивой активности перорально вводимых терапевтических пептидов или терапевтических белков субъекту, причем указанный способ включает этап введения субъекту пероральной фармацевтической композиции, как описано в настоящей заявке.

[0022] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ улучшения устойчивой биодоступности перорально вводимых терапевтических пептидов или терапевтических белков субъекту, причем указанный способ включает этап введения субъекту пероральной фармацевтической композиции, как описано в настоящей заявке.

[0023] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ введения субъекту терапевтически эффективного количества пептида или белка в пероральном составе, указанный способ включает получение пероральной фармацевтической композиции, включающей терапевтический пептид или терапевтический белок до 100 килодальтон, хелатор двухвалентных катионов и выделенный рекомбинантно экспрессированный ингибитор Боумена-Бирка (BBI), где указанный BBI, или указанный терапевтический пептид, или терапевтический белок до 100 килодальтон, или их комбинация обеспечены в указанной композиции в более низкой концентрации, чем могла бы быть терапевтически эффективна в идентичном в остальном пероральном составе, включающим химически очищенный BBI вместо указанного выделенного рекомбинантно экспрессированного BBI, и достигать сопоставимого терапевтического эффекта у указанного субъекта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0024] Следующие фигуры приведены в качестве иллюстративных примеров и не предназначены для ограничения заявленного изобретения.

[0025] Фигура 1. Хроматограмма очищенного rBBI. Результат анализа RPHPLC показан вместе с его наложением на доступный стандарт.

[0026] Фигура 2. Оценка белка методом ВСА (с бицинхониновой кислотой). Образец лиофилизированного порошка взвесили и растворяли в соответствующем буфере (SOP №: QC-006) до конечной концентрации 1 мг/мл для определения количества. Результаты показали, что белок по ВСА: 94%

[0027] Фигура 3. Анализ методом SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) rBBI. Провели электрофорез, гель отсканировали и по дорожкам определили количество с применением системы документации гелей Syngene в сочетании с Genesys в качестве программного обеспечения для получения изображений инструментом Gene для измерения количества с помощью денситометрии. Образцы из расчета 1 миллиграмм на миллилитр (мг/мл) загружали в 20% Phastgel™. Дорожка 1: белковый маркер, Дорожка 2, Бланк, Дорожка 3, 2 мкг rBBI в восстанавливающих условиях, Дорожка 4, 5 мкг rBBI в восстанавливающих условиях, Дорожка 5, 10 мкг rBBI в восстанавливающих условиях, Дорожка 6, Бланк, Дорожка 7, 2 мкг rBBI в не восстанавливающих условиях, Дорожка 4, 5 мкг rBBI в не восстанавливающих условиях, Дорожка 5, 10 мкг rBBI в не восстанавливающих условиях.

[0028] Фигура 4. Анализ ингибирования химотрипсина. В результатах продемонстрирован Образец, показывающий как 2,3 мг химотрипсина ингибируются 1 мг ингибитора.

[0029] Фигура 5. Анализ ингибирования трипсина. В результатах продемонстрирован Образец, показывающий как 1,7 мг трипсина ингибируется 1 мг ингибитора.

[0030] Фигура 6. Средние профили глюкозы в крови после введения пероральных составов инсулина с течением времени. Исследование in vivo проводилось натощак на свиньях, получавших пероральные формы инсулина (8 мг), приготовленные с ингибитором протеазы (BBI), полученным из природных источников или сконструированным с применением технологии рекомбинантной экспрессии. Составы вводили в двенадцатиперстную кишку с помощью эндоскопии до конечных доз 4 мг инсулина. Образцы крови брали в течение 5-часового периода мониторинга для определения концентрации глюкозы. В дополнение к 8 мг инсулина и 150 мг ЭДТА каждый состав содержал, как указано, SBTI, как описано в WO 2013/114369, или 100 мг рекомбинантного BBI (rBBI), 100 мг rBBI и 25 мг KTL или 50 мг rBBI и 25 мг KTI. В каждой группе, которой вводили композицию, содержащую rBBI, наблюдалось более резкое падение уровней циркулирующей глюкозы по сравнению с животными, получавшими химически очищенный BBI из исходных материалов SBTI.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ

[0031] Согласно настоящему изобретению предложены улучшенные пероральные композиции, содержащие один или несколько терапевтических пептидов или белков, в которые также включен рекомбинантный ингибитор протеазы BBI, которые неожиданно превосходят композиции, содержащие тот же ингибитор протеазы, но очищенный химически, несмотря на сопоставимые последующие этапы очистки для каждого. Неожиданно было показано, что стабильные пероральные композиции, включающие терапевтические средства на основе пептидов/белков, усилитель/стабилизатор, омега-3 жирную кислоту и ингибитор(ы) протеазы, уже продемонстрировавшие обеспечение устойчивой эффективности в пероральных составах, могут быть еще улучшены, если ингибитор протеазы получен из рекомбинантного источника.

[0032] Согласно настоящему изобретению предложена пероральная фармацевтическая композиция, включающая жидкий состав на масляной основе, в которой указанный жидкий состав на масляной основе включает терапевтический пептид или терапевтический белок до 100 килодальтон с хелатором двухвалентных катионов и выделенным рекомбинантно экспрессируемым BBI.

[0033] В некоторых вариантах реализации рекомбинантно экспрессируемый BBI имеет нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью, которая представлена в SEQ ID NO: 1, или в некоторых вариантах реализации рекомбинантно экспрессируемый BBI имеет нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 97% идентичности с последовательностью, которая представлена в SEQ ID NO: 1, или в некоторых вариантах реализации рекомбинантно экспрессированный BBI имеет нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 99% идентичности с последовательностью, которая представлена в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации рекомбинантно экспрессируемый BBI

[0034] Термины «белок» и «пептид» применяются здесь взаимозаменяемо. Ни один из этих терминов не предназначен для ограничения количества присутствующих аминокислот, за исключением случаев, когда ограничение указано явно.

[0035] В некоторых вариантах реализации пероральные составы, описанные в настоящей заявке, содержат рекомбинантно экспрессируемый BBI, а в некоторых вариантах реализации дополнительно могут содержать дополнительные ингибиторы протеаз, такие как, например, химически очищенные ингибиторы протеаз, например, такие как KTI3, выделенный из соевой муки, из обычно коммерчески доступных препаратов SBTI, как описано.

[0036] Как проиллюстрировано в настоящей заявке в Примере 4, пероральные составы, содержащие 4 мг субклинической дозы инсулина, обеспечивали лучший контроль гликемии с точки зрения уровней быстро циркулирующей глюкозы, эффекты которого сохранялись в течение более, чем по меньшей мере 3 часов, когда в состав включали 25 мг rBBI. Этот эффект на 75% превышал продолжительность эффекта, измеренного у контрольных животных. Аналогично, при введении 8 мг инсулина, составы, включающие rBBI, превосходили составы, включающие химически выделенный SBTI.

[0037] Что касается отношения анти-трипсиновой активности к анти-химотрипсиновой активности, присутствующей в препаратах, содержащих rBBI, активность варьировала от 1,6:1 до 1:1, включительно. Что касается отношения анти-трипсиновой активности к анти-химотрипсоновой активности, присутствующей в препаратах, включающих в себя rBBI, активность также варьировалась в диапазоне от 1,5:1 до 1:1, включительно.

[0038] Если не указано иное, анти-химотрипсиновая активность, упоминаемая в настоящей заявке, измерена с применением химотрипсина, активность которого составляет 40 единиц ВТЕЕ на мг химотрипсина, и выражается в мг химотрипсина, ингибированного на мг тестируемого белка. ВТЕЕ относится к N-бензоил-L-тирозин этилового эфиру (см. Инструкции для продукта Sigma-Aldrich №В6125).

[0039] Если не указано иное, анти-трип си новая активность, упоминаемая в настоящей заявке, измерена с применением трипсина, активность которого составляет 10,000 единиц ВАЕЕ на мг трипсина, и выражается в мг ингибированного трипсина на мг тестируемого белка. ВАЕЕ относится к раствору Na-бензоил-L-аргинин этилового эфира (см. Инструкции для продукта Sigma-Aldrich №В4500). Например, в типичном анализе одна единица соответствует количеству ингибитора, который снижает активность трипсина на одну единицу бензоил-L-аргинин этилового эфира (BAEE-U). Один BAEE-U представляет собой количество фермента, которое увеличивает поглощение при 253 нм на 0,001 в минуту при рН 7,6 и 25°С. См., например, K. Ozawa, М. Laskowski, 1966, J. Biol. Chem. 241:3955; and Y. Birk, 1976, Meth. Enzymol. 45:700.

[0040] В дополнительном аспекте предложен KTI3, выделенный из соевой муки, причем KTI3 имеет чистоту по меньшей мере 85%, как измерено в различных вариантах реализации методом SDS-PAGE, окрашивания бриллиантовым синим или количественного анализа изображений.

[0041] В еще одном аспекте предложен KTI3, выделенный из соевой муки, причем содержание белка KTI3 превышает 95%, как измерено с помощью анализа ВСА.

[0042] В еще одном аспект обеспечен KTI3, выделенный из соевой муки, причем КТГЗ содержит менее, чем 0,1% высокомолекулярных примесей, например по оценке измерения методом SDS-PAGE и количественного анализа изображений.

[0043]Специалисты в данной области техники поймут, что каждое из вышеуказанных требований к чистоте, касающихся содержания белка, уровня примесей или эффективности, обычно оценивается до того, как KTI3 будет смешан с одним или несколькими другими компонентами фармацевтической композиции.

[0044] В дополнительных вариантах реализации вышеописанные фармацевтические композиции включают покрытие, которое устойчиво к деградации в желудке. В еще более конкретных вариантах реализации покрытие представляет собой рН-чувствительную капсулу или, альтернативно, представляет собой мягкую желатиновую капсулу.

[0045] В других вариантах реализации вышеописанные фармацевтические композиции дополнительно включают терапевтический белок до 100 килодальтон в качестве активного ингредиента. В других вариантах реализации активный ингредиент представляет собой небелковую молекулу, которая чувствительна к деградации или инактивации в пищеварительном тракте человека.

[0046] В другом варианте реализации предложена пероральная фармацевтическая композиция, содержащая жидкий состав на масляной основе, причем жидкий состав на масляной основе включает терапевтический белок до 100 килодальтон (кДа), хелатор двухвалентных катионов и рекомбинантный BBI, как описано в настоящей заявке, и опционально дополнительные ингибиторы протеаз. В других вариантах реализации жидкий состав по существу состоит из терапевтического белка до 100 кДа, хелатора двухвалентных катионов, рекомбинантного BBI, как описано в настоящей заявке, и масла. В других варианта реализации жидкий состав по существу состоит из терапевтического белка до 100 кДа, хелатора двухвалентных катионов, рекомбинантного BBI, как описано в настоящей заявке, масла и эмульгатора. В других вариантах реализации жидкий состав по существу состоит из терапевтического белка до 100 кДа, хелатора двухвалентных катионов, рекомбинантного BBI, как описано в настоящей заявке, масла и двух эмульгаторов.

[0047] В другом аспекте предложены пероральные фармацевтические композиции, включающие жидкий состав на масляной основе, причем жидкий состав на масляной основе включает терапевтический белок до 100 кДа и хелатор двухвалентных катионов, а также рекомбинантный BBI, как описано в настоящей заявке, и при этом указанный жидкий состав обладает анти-химотрипсиновой активностью по меньшей мере 50 мг ингибированнного химотрипсина на мл жидкого состава. В других вариантах реализации жидкий состав обладает анти-химотрипсиновой активностью по меньшей мере 35, 40, 45, 55 или 60 мг ингибированного химотрипсина на мл жидкого состава. В дополнительных вариантах реализации, жидкий состав обладает анти-химотрипсиновой активностью в диапазоне 35-70, 40-70, 45-70, 50-70 или 40-60 мг ингибированного химотрипсина на мл жидкого состава. В других вариантах реализации жидкий состав дополнительно включает анти-трипсиновую активность по меньшей мере 25 мг трипсина, ингибированного на мл жидкого состава. В других вариантах реализации жидкий состав дополнительно включает анти-трипсиновую активность по меньшей мере 30, 35, 40, 45 или 50 мг трипсин, ингибированного на мл жидкого состава. Альтернативно, жидкий состав дополнительно включает анти-трипсиновую активность в диапазоне 25-50, 30-50, 35-50, 25-40 или 25-45 мг трипсина, ингибированного на мл жидкого состава.

[0048] В другом аспекте предложен способ получения фармацевтической композиции, включающий этапы (а) обеспечения препарата рекомбинантного BBI, как описано в настоящей заявке, терапевтического белка до 100 килодальтон и хелатора двухвалентных катионов; и (b) смешивания указанного рекомбинантного BBI, как описано в настоящей заявке, терапевтического белка и хелатора в жидком составе на масляной основе. Кроме того, каждый из описанных в настоящей заявке вариантов реализации других ингредиентов и дополнительных ингредиентов, которые могут быть представлены, может быть включен в этот способ. В других вариантах реализации предложена фармацевтическая композиция, полученная этим способом.

[0049] Применяемый в настоящей заявке термин «жидкий» относится к композиции, которая имеет вязкость в диапазоне 1-1000 миллипаскаль секунд включительно при 20°С.Например, рыбий жир в условиях окружающей среды представляет собой жидкость. Термин включает растворы на масляной основе, суспензии и их комбинации.

[0050] В некоторых вариантах реализации BBI относится к ингибитору Боумена-Бирка; Номер Uniprot Р01055 [база данных по состоянию на 28 января 2013 г. ]).

[0051] Пример последовательности предшественника BBI представляет собой:

[0052]

[0053] В некоторых вариантах реализации KTL согласно настоящей заявке, относится к KTI3 (номер Uniprot Р01070; база данных по состоянию на 3 января 2013 г. ). Типичная последовательность предшественника KTI3 представляет собой:

[0054]

[0055] В некоторых аспектах KTI3 может быть включен в пероральные композиции, как описано в настоящей заявке, как химически очищенный, например, как коммерчески доступный, как очищенный из соевой муки. Согласно другим аспектам, KTI3 также может быть получен рекомбинантно.

[0056] Дополнительные ингибиторы протеазы

[0057] Некоторые ингибиторы трипсина, известные в данной области техники, специфичны для трипсина, в то время как другие ингибируют трипсин и другие протеазы, такие как химотрипсин. Ингибиторы трипсина могут быть получены из животных или растительных источников: например, из сои, кукурузы, лимской фасоли и других бобов, кабачков, подсолнечника, поджелудочной железы и легких коров или других животных, яичного белка курицы и индейки, молочной смеси на основе сои и крови млекопитающих. Ингибиторы трипсина также могут иметь микробное происхождение: например, антипаин; см., например, Н. Umezawa, 1976, Meth. Энзимол. 45, 678. Ингибитор трипсина также может быть миметиком аргинина или лизина или другим синтетическим соединением: например, арилгуанидин, бензамидин, 3,4-дихлоризокумарин, диизопропилфторфосфат, мезилат габексата или фенилметансульфонилфторид. В контексте настоящей заявки, миметик аргинина или лизина представляет собой соединение, которое способно связываться с Р¹ карманом трипсина и/или препятствовать функционированию активного сайта трипсина.

[0058] В некоторых вариантах реализации дополнительный ингибитор трипсина, применяемый в описанных способах и композициях, выбран из группы, состоящей из ингибитора трипсина лимской фасоли, апротинина (также известного как ингибитор трипсина поджелудочной железы или основной ингибитор трипсина поджелудочной железы [BPTI]; Номер Uniprot Р00974 [база данных по состоянию на 2 января 2013 г. ]), ингибитора Kazal (ингибитор секреторного трипсина поджелудочной железы), ингибитора Kazal (ингибитор секреторного трипсина поджелудочной железы), овомукоида, альфа-1-антитрипсина, кортизол-связывающего глобулина, центерина ([SERPINA9/GCET1 (экспрессируемый В-клетками зародышевого центра транскрипт 1)], PI-6 (Sun et al. 1995), PI-8 (Sprecher et al 1995), бомапина, серпина клады А [например, Serpina3 (ID гена в NCBI: 12), Serpina6 (ID гена в NCBL866), 8ефта12 (ID гена в NCBL145264); 8ефта10 (ID гена в NCBI:51156); 8ефта7 (ID гена в NCBL6906); 8ефта9 (ID гена в NCBL327657); 8ефта11 (ID гена в NCBL256394); вефтаО (ID гена в NCBI:388007); 8ефта2 (ID гена в NCBL390502); и 8ефта4 (ID гена в NCBL5104)] Юкопин (8ефтЬ12; ID гена:89777), антипаина, бензамидина, 3,4-дихлоризокумарина, диизопропилфторфосфата и мезилат габексата. В других вариантах реализации выбран один из указанных выше ингибиторов.

[0059] Пример последовательности предшественника апротинина представляет

собой:

[0060]

[0061] В других вариантах реализации жидкий состав на масляной основе, применяемый в описанных способах и композициях, включает как рекомбинантный BBI, так и выделенный или рекомбинантный KTI, или выделенный и рекомбинантный апротинин, или их комбинацию.

[0062] В некоторых вариантах реализации rBBI, применяемый в описанных способах и композициях, и необязательный второй ингибитор протеазы, такой как KTI, если был представлен, то хранился с консервантом. В других вариантах реализации rBBI и необязательный второй ингибитор протеазы, такой как KTI, получен и сохранен без применения консерванта.

[0063] Терапевтические белки

[0064] Терапевтические белки для описанных в настоящей заявке композиций и способов в некоторых вариантах реализации выделяют перед включением в описанные фармацевтические композиции. «Выделенный» в этом отношении исключает обеспечение терапевтического белка в виде гомогенизированного тканевого препарата или в виде другой формы, включающей значительные количества загрязняющих белков. Предпочтительным примером выделенного белка или пептида является рекомбинантный белок или пептид. Еще более предпочтительным вариантом реализации является синтетический белок, другими словами белок, полученный в бесклеточном аппарате. Специалисты в данной области техники поймут в свете настоящего раскрытия изобретения, что можно применять терапевтические белки как дикого типа, так и мутантные.

[0065] Известно, что некоторые белки и пептиды являются специфическими ингибиторами трипсина и/или химотрипсина, включая, но не ограничиваясь теми, которые описаны в настоящей заявке как ингибиторы трипсина и/или химотрипсина. Такие белки не предназначены для применения в качестве терапевтического компонента в описанных композициях и исключены из определения «терапевтические белки», применяемого в настоящей заявке.

[0066] Специалисты в данной области техники поймут в свете настоящего раскрытия изобретения, что в описанных способах и композициях можно применять множество терапевтических белков. В некоторых вариантах реализации терапевтический белок имеет размер до 100 килодальтон (кДа), обычно от 1 до 100 кДа, включительно. В более конкретных вариантах реализации размер составляет до 90 кДа. В других вариантах реализации размер составляет до 80 кДа. В других вариантах реализации размер составляет до 70 кДа. В других вариантах реализации размер составляет до 60 кДа. В других вариантах реализации размер составляет до 50 кДа. Предпочтительно размер составляет от 1 до 90 кДа, включительно. В других вариантах реализации размер составляет от 1 до 80 кДа, включительно. В других вариантах реализации размер составляет от 1 до 70 кДа, включительно. В других вариантах реализации размер составляет от 1 до 60 кДа, включительно. В других вариантах реализации размер составляет от 1 до 50 кДа, включительно.

[0067] Терапевтические белки, подходящие для применения в настоящей заявке, включают модифицированные (т.е. путем ковалентного присоединения неаминокислотного фрагмента к белку) производные. В качестве примера, но не ограничения, белок включает белки, которые были модифицированы, например, гликозилированием, ацетилированием, ПЭГилированием, фосфорилированием, амидированием, генетическим добавлением полипептидов в виде слитых белков или дериватизации известными защитными/блокирующими группами. Высокомолекулярный ПЭГ может быть присоединен к терапевтическим белкам с помощью многофункционального линкера или без него либо посредством сайт-специфической конъюгации ПЭГ с его N- или С-концом, либо через эпсилон-аминогруппы, присутствующие на остатках лизина. Кроме того, производное может содержать одну или несколько неклассических аминокислот.

[0068] В некоторых, более конкретных вариантах реализации терапевтический белок, применяемый в описанных способах и композициях, выбран из группы, состоящей из инсулина, гемагглютинина гриппа, нейраминидазы гриппа, глюкагона, интерферона гамма, интерферона бета, интерферона альфа, гормона роста, эритропоэтина, GLP-1, аналога GLP-1, лептина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), ренина, релизинг-фактора гормона роста, паратиреоидного гормона, тиреотропного гормона, фолликулостимулирующего гормона, кальцитонина, лютеинизирующего гормона, глюкагона, фактора свертывания крови (например, фактора VII, фактора VIIIC, фактора DC, тканевого фактора (TF) и тромбина), фактора, препятствующего свертыванию (например, белок С), предсердного натрийуретического фактора, белка сурфактанта A (SP-A), белка сурфактанта В (SP-B), белка сурфактанта С (SP-C), белка сурфактанта D (SP-D), активатора плазминогена (например, урокиназы, или урины человека, или активатора плизминогена тканевого типа (t-PA)), бомбезина, гемопоэтического фактора роста (колониестимулирующий фактор, множественный), фактора некроза опухоли (TNF) (например, TNF-альфа, TNF-бета, TNF bбета-2, 4-1BBL), энкефалиназы, RANTES (регулируется при активации, нормальные Т-клетки экспрессируются и секретируются), воспалительного белка макрофагов человека (MIP-1-альфа), сывороточного альбумина, антимюллеровского гормона, релаксина, мышиного гонадотропин-рилизинг гормона, ДНКазы, ингибина, активина, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), нейротрофического фактора (например, нейтротрофического фактора мозга [BDNF]), нейротрофина-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), фактора роста нервов, тромбоцитарного фактора роста (PDGF), фактор роста фибробластов (например, альфа-FGF и бета-FGF), трансформирующего фактора роста (TGF) (например, TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 и TGF-5), фактора роста нервов, включая NGF-1, инсулиноподобного фактора роста-I и -II (IGF-I и IGF-II), дез(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста (включая IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6), фактора роста кератиноцитов, остеоиндуктивного фактора, костного морфогенетического белка (ВМР)-2, ВМР-7, ВМР-4, колониестимулирующего фактора (CSF) (например, M-CSF и GM-CSF), интерлейкина (IL) (например, от IL-1 до IL-13 и IL-15, IL-18 и IL-23), супероксиддисмутазы, фактора ускорения распада, члена семейства хемокинов (например, эотаксины и МСР-1) и фактора комплемента (например, С3 и С5).

[0069] Согласно другим аспектам, терапевтические белки/пептиды для включения в пероральные составы по настоящему изобретению включают терапевтические пептиды/белки, которые действуют в качестве заместительной ферментной терапии (ФЗТ) у пациентов, страдающих, например, наследственными метаболическими заболеваниями, при которых генетические дефекты приводят к структурному дефекту или отсутствию эндогенных ферментов, критичных для метаболических путей. Эти метаболические дефекты, в свою очередь, приводят к накоплению субстратов и/или их промежуточных продуктов, что приводит к патологическим состояниям. Например, и в некоторых вариантах реализации, терапевтические белки/пептиды могут включать глюкоцереброзидазу, α-галактозидазу, кислую α-глюкозидазу, α-L-идуронидазу, идуронат-2-сульфатазу, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазу, арилсульфатазу А, кислую сфингомиелиназу, щелочную фосфатазу, пиридоксаль-5-фосфат, порфобилиноген дезаминазу и фенилалан аммиак-лиазу.

[0070] В других вариантах реализации терапевтические белки/пептиды служат для облегчения симптомов патологических состояний за счет усиления существующих эндогенных путей или за счет реализации новых каталитических функций. Такие терапевтические ферменты успешно применяются при различных патологических состояниях, начиная от онкологии и заканчивая нервно-мышечными дисфункциями, гемостазом и даже косметической хирургией. Например, и в некоторых вариантах реализации, терапевтические белки/пептиды могут включать

[0071] альтеплазу, ретеплазу, тенектеплазу, активатор тканевого плазминогена человека, урокиназу, стрептокиназу, аминазу Anistreplace, дротрекогнин-а, фактор VIIa, фактор свертывания крови человека VIIa, L-аспарагиназу, карбоксипептидазу, расбуриказу, аденозин деаминазу, ботулиновый токсин типа А, гиалуронидазу и др.

[0072] В других вариантах реализации терапевтические белки/пептиды могут включать фактор VIIa, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XI, фактор XIII, vWF, белок С, антитромбин III, фибриноген, ингибитор С1-эстеразы, ингибитор протеиназы альфа-1 (α1-PI), глюкоцереброзидазу, альфа-L-идуронидазу, идуронатсульфатазу, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазу, N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазу, гепарансульфатсульфатазу, альфа-галактозидазу А, альфа-глюкозидазу, кислую сфингомиелиназу, альфа-маннозидазу, арилсульфатазу А, лизосомальную кислую липазу (ЛКЛ), сахарозу-изомальтазу, аденозиндезаминазу, инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), щелочную фосфатазу, порфобилиноген дезаминазу или их комбинации.

[0073] В еще более конкретных вариантах реализации терапевтический белок представляет собой инсулин. Альтернативно, терапевтический белок может быть ингибитором GLP-1. В более конкретном варианте реализации терапевтический белок представляет собой эксенатид. В другом варианте реализации в описанной композиции присутствуют как инсулин, так и эксенатид. В другом варианте реализации жидкий состав состоит по существу из инсулина, экзенатида, хелатора двухвалентных катионов, выделенного BBI и масла. В других вариантах реализации жидкий состав состоит по существу из инсулина, эксенатида, хелатора двухвалентных катионов, выделенного BBI, по меньшей мере одного эмульгатора и масла. Во все еще других вариантах реализации жидкий состав состоит по существу из инсулина, эксенатида, хелатора двухвалентных катионов, выделенного KTI3, апротинина и масла. В других вариантах реализации жидкий состав состоит по существу из инсулина, эксенатида, хелатора двухвалентных катионов, выделенного KTI3, апротинина, по меньшей мере одного эмульгатора и масла.

[0074] Специалист в данной области техники поймет в свете настоящего раскрытия изобретения, что для описанных способов и композиций подходят различные типы инсулина. Примеры белков инсулина включают, но не ограничиваются ими, белки инсулина дикого типа и мутантные белки инсулина, включая синтетический человеческий инсулин, синтетический бычий инсулин, синтетический свиной инсулин, синтетический китовый инсулин и металлические комплексы инсулина, такие как цинковые комплексы инсулина, протамин-цинк инсулин и глобин цинк.

[0075] Также могут быть применены различные классы инсулина, например, инсулин быстрого действия, инсулин Ленте, инсулин Семиленте, инсулин Ультраленте, инсулин НПХ, инсулин гларгин, инсулин лизпро, инсулин аспарт или комбинации двух или более из вышеуказанных типов инсулина.

[0076] В особенно предпочтительном варианте реализации инсулин из описанных способов и композиций представляет собой человеческий инсулин дикого типа (Uniprot ID Р01308). Из 110 аминокислот 1-24 представляют собой сигнальный пептид, 25-54 образуют В-цепь инсулина, 57-87 образуют С-пептид и 90-110 образуют А-цепь инсулина. В одном предпочтительном варианте реализации человеческий инсулин продуцируется в бактериальных клетках в виде рекомбинантного белка. В другом предпочтительном варианте реализации человеческий инсулин получают синтетически.

[0077] Аналоги GLP-1 также называются в данной области техники миметиками GLP-1. Специалист в данной области техники поймет в свете настоящего раскрытия изобретения, что описанные композиции могут включать по меньшей мере один из следующих аналогов GLP-1: экзенатид (Byetta™; CAS №141732-76-5), ликсисенатид (CAS №320367-13-3), лираглутид (№ CAS 204656-20-2), эксендин-9 (CAS №133514-43-9), АС3174 ([Leu(14)]эксендин-4, Amylin Pharmaceuticals, Inc.), таспоглутид (CAS №275371-94-3), альбиглутид (CAS №782500-75-8), семаглутид (CAS №910463-68-2), LY2189265 (дулаглутид™; CAS №923950- 08-7) и CJC-1134-PC (модифицированный аналог эксендина-4, конъюгированный с рекомбинантный человеческим альбумином, производимым ConjuChem™). Доступ ко всем записям CAS был осуществлен 19 декабря 2011 г. Таким образом, в некоторых вариантах реализации в описанном способе или композиции применяется любой из вышеперечисленных аналогов GLP-1. В других вариантах реализации выбрали один из вышеперечисленных аналогов GLP-1. Специалисты в данной области техники поймут в свете представленных в настоящей заявке открытий, что другие аналоги GLP-1 также могут применены в описанных способах и композициях.

[0078] В некоторых вариантах реализации указание на «терапевтический пептид» или «терапевтический белок» предназначено для включения любой такой молекулы, которая при введении нуждающемуся субъекту обеспечивает положительный эффект. В некоторых случаях молекула является терапевтической, поскольку ее функцией является замещение отсутствующей молекулы или уменьшение наличия такой молекулы у субъекта. В одном варианте реализации молекула замещает отсутствующий белок, например, в случае эндогенного нулевого мутанта, компенсируемого пероральной доставкой чужеродного белка. В других вариантах реализации эндогенный белок мутирует и образует нефункциональный белок, компенсируемый пероральной доставкой гетерологичного функционального белка. В других вариантах реализации пероральная доставка гетерологичного белка дополняет низкий эндогенный уровень, что приводит к кумулятивному усилению доступности данного белка. В других вариантах реализации молекула стимулирует сигнальный каскад, который обеспечивает экспрессию, или секрецию, или другие важные элементы для функционирования клетки или хозяина.

[0079] Эмульгаторы

[0080] В процентном отношении «мас./мас.» эмульгаторов и поверхностно-активных веществ, упомянутых в настоящей заявке, в качестве знаменателя используется количество масляной основы в составе, например, рыбьего жира; таким образом, 60 мг Gelucire в 500 мг рыбьего жира считается как 12 мас./мас. %, независимо от массы других компонентов. Аналогично 50 мг Tween-80, смешанного с 500 мг рыбьего жира, считается 10%-ным Tween-80.

[0081] В некоторых вариантах реализации жидкий состав на масляной основе, применяемый в описанных способах и фармацевтических композициях, или в других вариантах реализации, каждый из представленных жидких составов на масляной основе, дополнительно к терапевтическому белку, хелатору и BBI, включает полиэтиленгликолевые (ПЭГ) эфиры жирной кислоты, например, ПЭГ эфир моноглицерида, диглицерида, триглицерида или их смеси. В более конкретных вариантах реализации ПЭГ эфир может быть представлен в виде смеси (а) свободного моноацилглицерина, свободного диац ил глицерина, свободного триацилглицерина или их смеси; и (b) ПЭГ эфира жирной кислоты, например ПЭГ эфира моноглицерида, диглицерида, триглицерида или их смеси. В этом отношении каждый из терминов «моноацилглицерин», «диацилглицерин» и «триацилглицерин» необязательно относится к одному соединению, а скорее может включать смеси соединений, например смеси моноацилглицеринов, диацилглицеринов или триацилглицеринов, включающие жирные кислоты разной длины. В определенных предпочтительных вариантах реализации моноацилглицерины, диацилглицерины или триацилглицерины, применяемые в описанных способах и композициях, например, те, которые применяются для обычных ПЭГ эфиров, происходят из масляного источника, который обычно считается безопасным (GRAS). Примерами масел GRAS являются кокосовое масло, кукурузное масло, арахисовое масло, соевое масло, Myvacet 9-45 (диацетилированные моноацилглицерины С-18 жирных кислот). Более конкретный вариант реализации (а) представляет собой смесь C₈-C₁₈ моноацилглицеринов, диацилглицеринов и триацилглицеринов. Более конкретный вариант реализации компонента (b) представляет собой смесь ПЭГ моноэфиров и диэфиров одной или нескольких C₈-C₁₈ жирных кислот.

[0082] В более конкретных вариантах реализации жидкий состав дополнительно включает, помимо ПЭГ эфира жирной кислоты, свободный ПЭГ. В еще более конкретном варианте реализации дополнительное неионогенное поверхностно-активное вещество, например, поверхностно-активное вещество на основе полисорбата, представлен в дополнение к ПЭГ эфиру и свободному ПЭГ.

[0083] В еще более конкретном варианте реализации описанных способов и композиций жидкий состав включает: (а) смесь C₈-C₁₈ моноацилглицеринов, диацилглицеринов и триацилглицеринов; (b) ПЭГ-32 моноэфиры и диэфиры смеси C₈-C₁₈ жирных кислот; и (с) свободный ПЭГ-32. В еще более конкретных вариантах реализации мас./мас. отношение компонента (а) к сумме компонентов (b)+(с) составляет 10:90-30:70 включительно; более конкретно между 15:85-25:75 включительно; точнее 20:80. В некоторых вариантах реализации компоненты (а)-(с) вместе составляют 8-16 мас./мас. %, включая жидкий состав на масляной основе. В более конкретных вариантах реализации количество составляет 9-15%, включительно. В более конкретных вариантах реализации количество составляет 10-14%, включительно. В более конкретных вариантах реализации количество составляет 11-13%, включительно. В более конкретных вариантах реализации количество составляет 12%.

[0084] В других вариантах реализации жидкий состав на масляной основе, применяемый в описанных способах и фармацевтических композициях, дополнительно к терапевтическому белку, хелатору и BBI, включает самоэмульгирующийся компонент. Хотя некоторые варианты реализации самоэмульгирующихся компонентов представляют собой смеси компонентов, описанные в предыдущих абзацах, эти смеси не ограничивают определение термина «самоэмульгирующиеся компоненты», применяемого в настоящей заявке. Применяемый в настоящей заявке термин «самоэмульгирующийся компонент» относится к компоненту, который самопроизвольно образует эмульсию. Обычно такие компоненты образуют эмульсию при контакте с водной средой, образуя тонкую дисперсию, то есть микроэмульсию (SMEDDS). Некоторые варианты реализации таких компонентов включают смесь триацилглицерина и триацилглицеринов и поверхностно-активное вещество с высоким гидрофильным/липофильным балансом (ГЛБ; см. Griffin WC: «Calculation of ГЛБ Values of Non-Ionic Surfactants», J Soc Cosmetic Chemists 5: 259 (1954)). Другие варианты реализации самоэмульгирующегося компонента имеют воскообразную полутвердую консистенцию.

[0085] Предпочтительно, чтобы ГЛБ самоэмульгирующегося компонента, применяемого в описанных способах и композициях, составлял 10 или больше. В других вариантах реализации он составляет от 11 до 19, включительно. В других вариантах реализации он составляет от 12 до 18, включительно. В других вариантах осуществления он составляет от 12 до 17, включительно. В других вариантах реализации он составляет от 12 до 16 включительно, что указывает на эмульгатор типа масло-в-воде (М/В). В других вариантах реализации он составляет от 13 до 15, включительно. В других вариантах реализации он составляет ровно 14. Еще более конкретные варианты реализации самоэмульгирующихся компонентов имеют ГЛБ от 12 до 16 включительно и включают смеси триацилглицеринов со средней и длинной цепью, конъюгированные с ПЭГ, свободными триацилглицеринами и свободными ПЭГ. В других вариантах реализации самоэмульгирующийся компонент имеет ГЛБ от 12 до 16 включительно и состоит из смеси триацилглицеринов со средней и длинной цепью, конъюгированных с ПЭГ, свободными триацилглицеринами и свободными ПЭГ. В других вариантах реализации самоэмульгирующийся компонент имеет ГЛБ, равный 14, и включает триацилглицерины со средней и длинной цепью, конъюгированные с ПЭГ, свободными триацилглицеринами и свободными ПЭГ. В других вариантах реализации самоэмульгирующийся компонент имеет ГЛБ, равный 14, и состоит из смеси триацилглицеринов со средней и длинной цепью, конъюгированных с ПЭГ, свободными триацилглицеринами и свободными ПЭГ.

[0086] В некоторых более конкретных вариантах реализации применяется самоэмульгирующиеся компоненты, которые включают (а) моноацилглицерин, диац ил глицерин, триацилглицерин или их смесь; и (b) полиэтиленгликолевый (ПЭГ) эфир жирной кислоты. В этом отношении каждый из терминов «моноацилглицерин», «диацилглицерин» и «триацилглицерин» необязательно относится к одному соединению, а скорее может включать смеси соединений, например смеси моноацилглицеринов, диацилглицеринов или триацилглицеринов, включающие жирные кислоты разной длины. Более конкретный вариант реализации представляет собой смесь C₈-C₁₈ моноацилглицеринов, диацилглицеринов и триацилглицеринов. Более конкретный вариант реализации компонента (b) представляет собой смесь ПЭГ моноэфиров и диэфиров смеси C₈-C₁₈ жирных кислот.

[0087] В других, более конкретных вариантах реализации самоэмульгирующийся компонент дополнительно включает свободный ПЭГ.

[0088] Определенные фрагменты ПЭГ для применения в описанных композициях и способах содержат от 5 до 100 мономеров. В более конкретных вариантах реализации ПЭГ может содержать от 15 до 50 мономеров. В еще более конкретных вариантах реализации ПЭГ может содержать от 25 до 40 мономеров. В более конкретных вариантах реализации ПЭГ может содержать 32 мономера.

[0089] В еще более конкретных вариантах реализации описанных способов и композиций самоэмульгирующийся компонент, применяемый в них, включает: (а) смесь C₈-C₁₈ моноацилглицеринов, диацилглицеринов и триацилглицеринов; (b) ПЭГ-32 моноэфиры и диэфиры смеси C₈-C₁₈ жирных кислот; и (с) свободный ПЭГ-32; и мас./мас. отношение компонента (а) к компонентам (b)+(с) составляет 20:80. В некоторых вариантах реализации такого компонента количество составляет 8-16 мас./мас. %, включая жидкий состав на масляной основе. В более конкретных вариантах реализации количество составляет 9-15%, включительно. В более конкретных вариантах реализации количество составляет 10-14%, включительно. В более конкретных вариантах реализации количество составляет 11-13%, включительно. В более конкретных вариантах реализации количество составляет 12%.

[0090] Примерами самоэмульгирующихся компонентов, отвечающих вышеуказанным спецификациям, являются Gelucire™ 44/14, Gelucire™ 53/10 и Gelucire™ 50/13. Более конкретным вариантом реализации является Gelucire™ 44/14. Суффиксы 44 и 14 относятся к температуре его плавления и его гидрофильному/липофильному балансу (ГЛБ) соответственно. Gelucire™ 44/14 (Gattefosse SAS, Сен-Прист, Франция) получают путем полигликолиза гидрогенизированного кокосового масла (триацилглицерины со средней и длинной цепью с ПЭГ-32). Он имеет гидрофильный/липофильный баланс 14. Он состоит из определенной смеси моно-, ди- и триацилглицеринов C₈-C₁₈ (20% м/м); ПЭГ-32 моно- и диэфиров и свободного ПЭГ-32 (80% м/м). Основной представленной жирной кислотой является лауриновая кислота, чье содержание составляет в среднем 45% от общего содержания жирных кислот. Это твердая дисперсия, состоящая из фракции ПЭГ эфира в ламеллярной фазе 120 со спиральной структурой и фракции ацилглицерина в гексагональной упаковке. Главными продуктами желудочно-кишечного липолиза Gelucire™ 44/14 являются ПЭГ-32 моно- и диэфиры. В более конкретных вариантах реализации описанные композиции включают около 12% Gelucire 44/14 в качестве единственного эмульгатора или, в других вариантах реализации, вместе с другим эмульгатором. В других вариантах реализации описанные композиции содержат примерно 12% Gelucire 44/14 и около 10% Tween-80.

[0091] Неионогенные поверхностно-активные вещества [0092] В некоторых вариантах реализации жидкий состав на масляной основе, применяемый в описанных способах и фармацевтических композициях, дополнительно содержит неионогенное поверхностно-активное вещество в дополнение к самоэмульгирующемуся компоненту. В некоторых вариантах реализации неионогенное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полисорбата-20, полисорбата-40, полисорбата-80, лауромакроголя 400, полиоксил 40 стеарата, полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла 10, 50 и 60, моностеарата глицерина, полисорбата 40, 60, 65 и 80, эфира сахарозы жирной кислоты, метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, н-октилглюкозида, н-додецилглюкозида, н-додецилмальтозида, октаноил-N-метилглюкамида, деканоил-N-метилглюкамида, Triton™-X-100, Triton™-X-114, Thesit™, изотридециполи(этиленгликолиевого эфира)n, 3-[(3-холамидопропил)диметиламминио]-1-пропансульфоната (CHAPS), 3-[(3-холамидопропил)диметиламминио]-2-гидрокси-1-пропансульфоната (CHAPSO) и N-додецил=N,N-диметил-3-аммонио-1-пропансульфоната. В других вариантах реализации выбирается один из вышеперечисленных неионогенных поверхностно-активных веществ.

[0093] В некоторых более конкретных вариантах реализации неионогенное поверхностно-активное вещество, применяемое в описанных способах и композициях, представляет собой поверхностно-активное вещество на основе полисорбата. Примерами поверхностно-активных веществ на основе полисорбата являются поверхностно-активные вещества, полученные ковалентным связыванием полиэтоксилированного сорбитана с жирной кислотой. Более конкретными вариантами реализации поверхностно-активных веществ на основе полисорбата являются полисорбат-20, полисорбат-40 и полисорбат-80.

[0094] Например, полисорбат 80 (Tween-80) представляет собой неионогенное поверхностно-активное вещество, получаемое из полиэтоксилированного сорбитана и олеиновой кислоты и имеющий следующую структуру:

[0095] В случае полисорбата 80 фрагмент, показанный справа, представляет собой смесь жирных кислот, содержащую 60-70% олеиновой кислоты (как изображено), а остальное представляет собой по существу линолевую, пальмитиновую и стеариновую кислоты.

[0096] В более конкретном варианте реализации полисорбат 80 составляет 3-15 мас./мас. %, включая жидкий состав на масляной основе, применяемый в описанных способах и композициях. В более конкретном варианте реализации процент составляет 5-14%, включительно. В более конкретном варианте реализации процент составляет 7-12%, включительно. В более конкретных вариантах реализации процент составляет 10% или, альтернативно, 5%.

[0097] Хелаторы двухвалентных катионов

[0098] Хелатор двухвалентных катионов, применяемый в описанных способах и композициях, в одном варианте реализации представляет собой любое физиологически приемлемое соединение, имеющее высокое сродство по меньшей мере к одному из ионов кальция, магния и марганца. В другом варианте реализации хелатор выбран из группы, состоящей из цитрата или его соли; этилендиаминтетуксусной кислоты (ЭДТА) или ее соли (например, ЭДТА динатрия и ЭДТА динатрия кальция); EGTA (этиленгликольтетрауксусная кислота) или ее соли; диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA) или ее соли; и ВАРТА (1,2-бис(о-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота) или ее соли. В других вариантах реализации применяется один из вышеперечисленных хелаторов. В более конкретных вариантах реализации хелатор представляет собой ЭДТА.

[0099] Масла

[00100] В свете настоящих приведенных данных специалисты в данной области техники поймут, что различные масла могут быть применены в качестве основы для их жидкой фазы в описанных композициях. В некоторых вариантах реализации масло может быть любым физиологически приемлемым маслом, которое является жидким при температуре окружающей среды.

[00101] В более конкретных вариантах реализации масло включает омега-3 жирную кислоту. В других вариантах реализации омега-3 жирная кислота представляет собой полиненасыщенную омега-3 жирную кислоту. В другом варианте реализации омега-3 жирная кислота представляет собой DHA, омега-3, полиненасыщенную 22-углеродную жирную кислоту, также называемую 4, 7, 10, 13, 16, 19-докозагексаеновой кислотой. В другом варианте реализации омега-3 жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту (9, 12, 15-октадекатриеновая кислота). В другом варианте реализации омега-3 жирная кислота представляет собой стеаридоновую кислоту (6, 9, 12, 15-октадекатетраеновую кислоту). В другом варианте реализации омега-3 жирная кислота представляет собой эйкозатриеновую кислоту (ЕТА; 11, 14, 17-эйкозатриеновая кислота). В другом варианте реализации омега-3 жирная кислота представляет собой эйксоатетраеновую кислоту (8, 11, 14, 17-эйкозатетраеновая кислота). В одном варианте реализации омега-3 жирная кислота представляет собой эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА; 5, 8, 11, 14, 17-эйкозапентаеновая кислота). В другом варианте реализации омега-3 жирная кислота представляет собой эйкозагексаеновую кислоту (также обозначаемую как 5, 7, 9, 11, 14, 17-эйкозагексаеновая кислота). В другом варианте реализации омега-3 жирная кислота представляет собой докозапентаеновую кислоту (DPA; 7, 10, 13, 16, 19-докозапенатеновая кислота). В другом варианте реализации омега-3 жирная кислота представляет собой тетракозагексаеновую кислоту (6, 9, 12, 15, 18, 21-тетракозагексаеновая кислота).

[00102] В других вариантах реализации масло представляет собой масло природного происхождения, включающее омега-3 жирную кислоту. В более конкретных вариантах реализации масло выбрано из группы, состоящей из рыбьего жира, масла канолы, льняного масла, масла водорослей и масла семян конопли. В более конкретных вариантах реализации масло представляет собой рыбий жир. Несколько типов рыбьего жира были протестированы в описанных композициях и было обнаружено, что все они работают одинаково хорошо.

[00103] В других вариантах реализации жидкий состав, применяемый в описанном способе или композиции, не содержит воды. «Безводный» в некоторых вариантах реализации относится к составу, в который намеренно не были добавлены водные компоненты. Это не исключает присутствия следовых количеств воды, которые были поглощены из атмосферы компонентами. В другом варианте реализации жидкий состав не содержит водных компонентов. Во все еще других вариантах реализации одно или несколько масел являются единственными жидкими компонентами жидкого состава. В более конкретных вариантах реализации рыбий жир является единственным жидким компонентом жидкого состава.

[00104] Покрытия

[00105] В свете настоящих открытий специалистам в данной области техники будет понятно, что в описанных способах и композициях можно применять различные рН-чувствительные покрытия. В некоторых вариантах реализации может применяться любое покрытие, которое подавляет переваривание композиции в желудке субъекта.

[00106] В других вариантах реализации покрытие включает биоразлагаемый полисахарид. В других вариантах реализации применяется гидрогель. В других вариантах реализации покрытие включает один из следующих наполнителей: хитозан, покрытие Aquacoat ECD, азо-сшитый полимер, фталат ацетата целлюлозы, тримеллитат ацетата целлюлозы (CAT), бутират ацетата целлюлозы, фталат гидр оке ипропилметилцеллюлозы или фталат полив инилацетата.

[00107] В других вариантах реализации применяется система с замедленным высвобождением, такая как Pulsincap™.

[00108] В предпочтительных вариантах реализации описанные лекарственные формы с покрытием высвобождают ядро (содержащее состав на масляной основе), когда рН достигает диапазона, обнаруженного в кишечнике, который является щелочным по сравнению с таковым в желудке. В более конкретных вариантах реализации покрытие включает рН-чувствительный полимер. В различных вариантах реализации могут применяться однослойные или многослойные покрытия.

[00109] В одном из вариантов реализации покрытие представляет собой энтеросолюбильное покрытие. Способы энтеросолюбильного покрытия хорошо известны в данной области техники (см., например, Siepmann F et al 2005). В более конкретных вариантах реализации в качестве энтеросолюбильного покрытия применяется покрытие Eudragit™. Покрытия Eudragit™ представляют собой акриловые полимеры, применение которых хорошо известно в данной области техники.

[00110] В другом варианте реализации микрокапсулирование применяется в описанных композициях в качестве устойчивого в желудке покрытия. Способы микрокапсулирования хорошо известны в данной области техники.

[00111] В других вариантах реализации покрытие представляет собой капсулу, частным вариантом которых являются желатиновые капсулы. Способы введения композиции на масляной основе в желатиновую капсулу хорошо известны в данной области техники. В других вариантах реализации покрытие представляет собой капсулу из мягкого геля с энтеросолюбильным покрытием.

[00112] В другом варианте реализации предложена пероральная фармацевтическая композиция, содержащая жидкий состав на масляной основе, где жидкий состав на масляной основе включает терапевтический белок до 100 килодальтон, хелатор двухвалентных катионов, выделенный ингибитор химотрипсина/трипсина, выделенный ингибитор трипсина и ПЭГ эфир жирной кислоты. В других вариантах реализации жидкий состав обладает анти-химотрипсиновой активностью по меньшей мере 50 мг ингибированного химотрипсина на мл жидкого состава. В других вариантах реализации жидкий состав обладает, как анти-химотрипсиновой активностью по меньшей мере 50 мг ингибированного химотрипсина на мл жидкого состава, так и анти-трипсиновой активностью по меньшей мере 25 трипсина, ингибированного на мл жидкого состава. В других вариантах реализации также представлен свободный ПЭГ. В других вариантах реализации также представлено неионогенное поверхностно-активное вещество. В других вариантах реализации жидкий состав состоит по существу из терапевтического белка до 100 килодальтон, хелатора двухвалентных катионов, ингибитора химотрипсина/трипсина, ингибитора трипсина и ПЭГ эфира жирной кислоты. В других вариантах реализации жидкий состав состоит по существу из терапевтического белка до 100 килодальтон, хелатора двухвалентных катионов, ингибитора химотрипсина/трипсина, ингибитора трипсина, ПЭГ эфира жирной кислоты и свободного ПЭГ. В других вариантах реализации жидкий состав состоит по существу из терапевтического белка до 100 килодальтон, хелатора двухвалентных катионов, ингибитора химотрипсина/трипсина, ингибитора трипсина, ПЭГ эфира жирной кислоты, свободного ПЭГ и неионогенного поверхностно-активного вещества.

[00113] Представительные примеры составов

[00114] Некоторые представительные примеры составов инсулина включают инсулин, Gelucire 44/14, ЭДТА, SBTI и апротинин в рыбьем жире, покрытые капсулой. Определенные представительные примеры составовэксенатидов содержат эксенатид, Gelucire 44/14, ЭДТА, SBTI и апротинин в рыбьем жире, покрытые капсулой.

[00115] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен состав, имеющий следующие компоненты: 8-20% Gelucire 44/14; 25-50 мг на капсулу rBBI, 25-50 мг выделенного KTI; 100-200 мг ЭДТА; с терапевтическим белком, который может составлять 2-32 мг на капсулу инсулина и/или 150-600 мкг на капсулу эксенатида, все вместе скомбинировано в 0,5-0,7 мл рыбьего жира.

[00116] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен состав, имеющий следующие компоненты: 8-20% Gelucire 44/14; 12,5 - 25 мг на капсулу rBBI, 12,5-25 мг выделенного KTI; 100-200 мг ЭДТА; с терапевтическим белком, который может составлять 2-32 мг на капсулу инсулина и/или 150-600 мкг на капсулу эксенатида, все вместе скомбинировано в 0,5-0,7 мл рыбьего жира.

[00117] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен состав, имеющий следующие компоненты: 12,5-25 мг на капсулу rBBI, 12,5-25 мг выделенного KTI; 100-200 мг ЭДТА; с терапевтическим белком, который может составлять 2-32 мг на капсулу инсулина и/или 150-600 мкг на капсулу эксенатида, все вместе скомбинировано в 0,5-0,7 мл рыбьего жира.

[00118] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен состав, имеющий следующие компоненты: 25-50 мг на капсулу rBBI, 25-50 мг выделенного KTI; 100-200 мг ЭДТА; с терапевтическим белком, который может составлять 2-32 мг на капсулу инсулина и/или 150-600 мкг на капсулу эксенатида, все вместе скомбинировано в 0,5-0,7 мл рыбьего жира.

[00119] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен состав, имеющий следующие компоненты: 50-100 мг на капсулу rBBI, 50-100 мг выделенного KTI; 100-200 мг ЭДТА; с терапевтическим белком, который может составлять 2-32 мг на капсулу инсулина и/или 150-600 мкг на капсулу эксенатида, все вместе скомбинировано в 0,5-0,7 мл рыбьего жира.

[00120] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен состав, имеющий следующие компоненты: 75-125 мг на капсулу rBBI, 75-125 мг выделенного KTI; 100-200 мг ЭДТА; с терапевтическим белком, который может составлять 2-32 мг на капсулу инсулина и/или 150-600 мкг на капсулу эксенатида, все вместе скомбинировано в 0,5-0,7 мл рыбьего жира.

[00121] В некоторых вариантах реализации составы, содержащие рекомбинантный BBI и инсулин, как описано, демонстрируют более быстрое и качественно большее снижение уровней циркулирующей глюкозы, причем этот эффект сохраняется в течение более длительного периода времени, чем эффект, достигаемый с составами, содержащими BBL химически очищенный из препаратов сои.

[00122] В некоторых вариантах реализации составы, содержащие рекомбинантный BBI и терапевтический препарат на основе белка или пептида, как описано в настоящей заявке, обеспечивают большее терапевтическое окно с точки зрения устойчивого эффекта в течение более длительного периода времени, чем это достигается с помощью составов, содержащих BBI, химически очищенный из препаратов сои, что может быть засвидетельствовано в местных эффектах после введения или, в некоторых вариантах реализации, в уровнях циркулирующего белка/пептида после введения.

[00123] В некоторых вариантах реализации составы, содержащие рекомбинантный BBI и терапевтический препарат на основе белка или пептида, как описано в настоящей заявке, обеспечивают устойчивый эффект в течение равного или более длительного периода времени или обеспечивают равные или более высокие уровни циркулирующего белка/пептида после введения рекомбинантного BBI, в котором концентрация рекомбинантного BBI ниже, чем концентрация BBI, химически очищенного из препаратов сои, в идентичном в остальном составе.

[00124] Согласно этому аспекту и в некоторых вариантах реализации концентрация рекомбинантного BBI, обеспеченная в составе настоящего изобретения, будет составлять по меньшей мере на 30%, или в некоторых вариантах реализации по меньшей мере на 35%, или в некоторых вариантах реализации по меньшей мере на 40%, или в некоторых вариантах реализации по меньшей мере на 45%, или в некоторых вариантах реализации по меньшей мере на 50%, или в некоторых вариантах реализации по меньшей мере на 55%, или в некоторых вариантах реализации по меньшей мере на 60%, или в некоторых вариантах реализации по меньшей мере на 65%, или в некоторых вариантах реализации по меньшей мере на 70%, или в некоторых вариантах реализации по меньшей мере на 75% меньше, чем концентрация BBI, химически очищенного из препаратов сои, применяемых в сопоставимом в остальном или идентичном препарате.

[00125] Следует принять во внимание, что указание на термин «сопоставимый (сравнимый) или идентичный в остальном» в отношении составов по настоящему изобретению подразумевает идентичные ключевые ингредиенты, которые включают в себя белок/пептид, ингибитор протеазы BBI или KTI, ЭДТА и/или рыбий жир или омега-3 жирную кислоту, полученную из рыбьего жира, однако другие компоненты состава могут быть сопоставимы, что будет понятно квалифицированному специалисту.

[00126] В одном варианте реализации обеспечивается состав, имеющий следующие компоненты: 8-20% Gelucire 44/14; 50-100 мг на капсулу rBBI или rBBP/смесь выделенного или рекомбинантного KTI; 20-30 мг на капсулу Апротинина; и 100-200 мг ЭДТА; с терапевтическим белком, который может составлять 8-32 мг на капсулу инсулина и/или 150-600 мкг на капсулу эксенатида, все вместе скомбинировано в 0,5-0,7 мл рыбьего жира.

[00127] В другом варианте реализации предложен представительный пример жидкого состава инсулина, содержащий инсулин, Gelucire 44/14, ЭДТА, rBBI, KTI и апротинин в рыбьем жире.

[00128] В других вариантах реализации жидкий состав состоит по существу из инсулина, Gelucire 44/14, ЭДТА, rBBI, KTI, апротинина и рыбьего жира.

[00129] В некоторых вариантах реализации составы содержат 8 мг инсулина, 12% Gelucire 44/14,150 мг ЭДТА, всего 75 мг rBBI и KTI и 24 мг апротинина в 0,5-0,7 мл рыбьего жира; или в некоторых вариантах реализации - 16 мг инсулина, 12% Gelucire 44/14, 150 мг ЭДТА, всего 75 мг rBBI и KTI и 24 мг апротинина в 0,5-0,7 мл рыбьего жира; или в некоторых вариантах реализации - 16 мг инсулина, 12% Gelucire 44/14, 150 мг ЭДТА, всего 150 мг rBBI и KTI и 24 мг апротинина в 0,5-0,7 мл рыбьего жира.

[00130] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен состав, в котором отношение анти-трипсиновой активности к анти-химотрипсиновой активности составляет около 1,28:1. В некоторых вариантах реализации составы, содержащие только указанное количество rBBI, достаточны для активности ингибитора протеаз и в них не включаются никакие дополнительные протеазы.

[00131] В других вариантах реализации вышеуказанная композиция дополнительно содержит неионогенное поверхностно-активное вещество. В более конкретных вариантах реализации неионогенное поверхностно-активное вещество представляет собой поверхностно-активное вещество на основе полисорбата. В еще более конкретных вариантах реализации поверхностно-активное вещество на основе полисорбата представляет собой полисорбат 80. Предпочтительно, полисорбат 80 составляет 3-10 мас./мас. %, включая жидкий состав на масляной основе.

[00132] Жидкий состав может быть покрыт капсулой из мягкого геля с энтеросолюбильным покрытием. Конкретные составы, описанные в этом абзаце, также включают в некоторых вариантах реализации расширенные и уменьшенные составы, содержащие одни и те же компоненты в тех же соотношениях.

[00133] Некоторые представительные примеры препаратов экзенатида включают эксенатид, ЭДТА, rBBI, KTI и апротинин в рыбьем жире. В других вариантах реализации жидкий состав состоит по существу из экзенатида, Gelucire 44/14, ЭДТА, rBBI, KTI, апротинина и рыбьего жира. Более конкретные составы содержат 150 микрограмм (мкг) экзенатида, 150 мг ЭДТА, всего 75 мг rBBI и KTI и 24 мг апротинина в 0,5-0,7 мл рыбьего жира; 300 мкг эксенатида, 150 мг ЭДТА, всего 75 мг rBBI и KTI и 24 мг апротинина в 0,5-0,7 мл рыбьего жира; и 300 мкг экзенатида, 150 мг ЭДТА, всего 150 мг rBBI и KTI и 24 мг апротинина в 0,5-0,7 мл рыбьего жира. В некоторых вариантах реализации составы, содержащие только указанное количество rBBI, достаточны для активности ингибитора протеаз и в них не включаются никакие дополнительные протеазы

[00134] В еще более конкретном составе отношение анти-трипсиновой активности к анти-химотрипсиновой активности композиции составляет от 1,5:1 до 1:1, включительно. В еще более конкретных вариантах реализации отношение составляет примерно 1,28:1. Жидкий состав может быть покрыт капсулой из мягкого геля с энтеросолюбильным покрытием. В других вариантах реализации вышеуказанная композиция дополнительно содержит неионогенное поверхностно-активное вещество. В более конкретных вариантах реализации неионогенное поверхностно-активное вещество представляет собой поверхностно-активное вещество на основе полисорбата. В еще более конкретных вариантах реализации поверхностно-активное вещество на основе полисорбата представляет собой полисорбат 80. Предпочтительно, полисорбат 80 составляет 3-10 мас./мас. %, включая жидкий состав на масляной основе. Жидкий состав может быть покрыт капсулой из мягкого геля с энтеросолюбильным покрытием.

[00135] Показания к применению

[00136] В другом аспекте предложено применение rBBI, описанного в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для перорального введения активного ингредиента субъекту.

[00137] В еще одном аспекте предложен способ получения фармацевтической композиции, включающий этапы: (а) получения смеси, включающей rBBI, описанный в настоящей заявке, и активный ингредиент; и (b) получение смеси в фармацевтически приемлемый состав.

[00138] Как упоминалось в настоящей заявке, этап получения состава включает этапы необязательного добавления вспомогательных веществ, измельчения, покрытия и тому подобного, которые соответствуют желаемой фармацевтической композиции. Эти этапы вполне доступны специалистам в данной области техники.

[00139] В некоторых вариантах реализации активный ингредиент, как упоминалось в настоящей заявке, чувствителен к деградации или инактивации в пищеварительном тракте человека.

[00140] В другом аспекте обеспечена пероральная фармацевтическая композиция, описанная в настоящей заявке, для перорального введения активного ингредиента субъекту. В определенных предпочтительных вариантах реализации активный ингредиент чувствителен к деградации или инактивации в пищеварительном тракте человека. В более конкретных вариантах реализации активный ингредиент может быть терапевтическим белком. В других вариантах реализации активный ингредиент представляет собой небелковую молекулу, которая чувствительна к деградации или инактивации в пищеварительном тракте человека.

[00141] В другом аспекте предложено применение пероральной фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для перорального введения терапевтического белка субъекту.

[00142] В другом аспекте предложен способ перорального введения терапевтического белка субъекту, причем способ включает этап введения субъекту пероральной фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке, таким образом, перорально вводя терапевтический белок субъекту.

[00143] В другом аспекте обеспечена описанная в настоящей заявке фармацевтическая композиция для лечения диабета у человека, где, в некоторых вариантах реализации, терапевтический белок в различных вариантах реализации представляет собой инсулин, эксенатид или их комбинацию.

[00144] В еще одном аспекте предложено применение комбинации ингредиентов, описанных в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для лечения диабета у человека, где, в некоторых вариантах реализации, терапевтический белок в различных вариантах реализации представляет собой инсулин, эксенатид или их комбинацию.

[00145] В еще одном аспекте предложен способ лечения диабета, причем способ включает этап введения нуждающемуся в таком лечении субъекту фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке, где, в некоторых вариантах реализации, терапевтический белок в различных вариантах реализации представляет собой инсулин, эксенатид, или их комбинацию, с тем чтобы лечить диабет. В некоторых вариантах реализации субъектом является человек, а в других вариантах реализации субъектом является млекопитающее, не являющееся человеком.

[00146] В дополнительном аспекте обеспечена фармацевтическая композиция, описанная в настоящей заявке, для лечения нестабильного диабета у человека. В другом аспекте описанная в настоящей заявке фармацевтическая композиция обеспечена для лечения повышенного уровня глюкозы в крови натощак у человека.

[00147] В еще одном аспекте предложено применение комбинации ингредиентов, описанных в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для лечения нестабильного диабета у человека. Кроме того, предложено применение комбинации ингредиентов, описанных в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для лечения повышенного уровня глюкозы в крови натощак у человека.

[00148] Кроме того, обеспечен способ лечения нестабильного диабета, включающий этап введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке, с тем чтобы лечить нестабильный диабет. Кроме того, предложен способ для снижения повышенного уровня глюкозы в крови натощак, включающий этап введения нуждающемуся в таком лечении субъекту фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке, с тем чтобы снизить повышенный уровень глюкозы в крови натощак. В некоторых предпочтительных вариантах реализации субъектом является человек.

[00149] Нестабильный диабет

[00150] Врачам, квалифицированным в данной области техники, будет понятно, что нестабильный диабет, также известный как лабильность гликемии, может быть диагностирован с помощью ряда приемлемых стандартных процедур. Одна из таких процедур описана в Ryan et al, 2004. В этой процедуре субъектов просят мониторить уровень глюкозы с помощью как минимум двух каждодневных измерений уровня глюкозы в капиллярах. Пациенты записывают на листах все измеренные значения глюкозы и подробную информацию о случаях гипогликемии в течение 4-недельного периода. В любом случае, когда уровень глюкозы составлял <3,0 ммоль/л, субъекта просили детально описать событие в анкете, в том числе, какие симптомы возникли и была ли получена посторонняя помощь от третьей стороны для распознавания или лечения гипогликемической реакции. Реакция считается серьезной, если человек потерял контроль над ситуацией и нуждался в посторонней помощи для лечения гипогликемического события. Другие такие методы включают расчет индекса MAGE (Service et al., 1970) или «М-значения» (Schlichtkrull et al) или применение систем непрерывного мониторинга глюкозы (Kessler et al). Нестабильный диабет обычно связан с повышенным уровнем глюкозы в крови натощак и/или эпизодами гипогликемии.

[00151] Следует понимать, что настоящее изобретение предусматривает пероральные композиции для лечения множества заболеваний/расстройств, как описано в настоящей заявке, включая любую форму диабета, что будет понятно специалисту в данной области техники.

[00152] В одном варианте реализации термины «лечение» или «средство лечения» включают как профилактическое, так и восстанавливающее нарушение лечение. Термины «сокращение», «подавление» и «ингибирование» имеют общепринятые значения ослабления или уменьшения в одном варианте реализации, или задержки в другом варианте реализации, или сокращения в другом варианте реализации, частоты случаев, тяжести или патогенеза заболевания, расстройства или состояния. В одном из вариантов реализации термин «лечение» относится к замедленному прогрессу, длительной ремиссии, сниженной частоте или облегчению симптомов, связанных с заболеванием, нарушением или состоянием. В одном варианте реализации термины «лечение», «сокращение», «подавление» или «ингибирование» относятся к уменьшению опасности, смертности или их комбинации, связанных с указанным заболеванием, нарушением или состоянием. В одном варианте реализации термин «прогрессирование» относится к увеличению масштаба или степени тяжести, развитию, росту или ухудшению. Термин «рецидив» в другом варианте реализации означает возвращение заболевания после ремиссии. В одном варианте реализации способы лечения по настоящему изобретению уменьшают тяжесть заболевания, или в другом варианте реализации симптомы, связанные с заболеванием, или в другом варианте реализации снижают количество биомаркеров, экспрессируемых во время заболевания.

[00153] В одном варианте реализации термин «лечение» и включенные в него аспекты относятся к введению субъекту с указанным заболеванием, нарушением или состоянием или, в некоторых вариантах реализации, субъекту, предрасположенному к указанному заболеванию, нарушению или состоянию. Термин «предрасположен к» следует рассматривать как относящийся, среди прочего, к генетическому профилю или семейным отношениям, которые связаны с тенденцией или статистическим увеличением заболеваемости, тяжести и т.д. указанного заболевания. В некоторых вариантах реализации термин «предрасположен к» следует рассматривать как относящийся, среди прочего, к образу жизни, который связан с повышенным риском указанного заболевания. В некоторых вариантах реализации термин «предрасположен к» следует рассматривать как относящийся, среди прочего, к наличию биомаркеров, которые связаны с указанным заболеванием, например, с раком, термин «предрасположен к» раку может включать наличие предраковых предшественников указанного вида рака.

[00154] В некоторых вариантах реализации термин «уменьшение патогенеза» следует понимать как включающий в себя уменьшение повреждения ткани или повреждения органа, связанного с конкретным заболеванием, нарушением или состоянием. В другом варианте реализации термин «уменьшение патогенеза» следует понимать как включающий в себя снижение частоты или тяжести ассоциированного заболевания, нарушения или состояния, которое подразумевается. В другом варианте реализации термин «уменьшение патогенеза» следует понимать как включающий в себя уменьшение числа связанных заболеваний, нарушений или состояний, которые были указаны, или связанных с ними симптомов.

[00155] Способы получения фармацевтических композиций

[00156] В настоящей заявке также представлены способы получения фармацевтических композиций. В некоторых вариантах реализации способ включает этапы необязательного объединения расплавленного Gelucire (например, Gelucire 44/14) с рыбьим жиром, охлаждения смеси, затем добавления находящегося в форме порошка ЭДТА, SBTI, апротинина и терапевтического белка или пептида, например, инсулина или, в других вариантах реализации, эксенатида, хотя специалисты в данной области техники поймут, что в свете настоящих открытий также могут быть применены другие терапевтические белки или пептиды. В других вариантах реализации способ включает этапы необязательного объединения расплавленного Gelucire (например, Gelucire 44/14) с рыбьим жиром, охлаждения смеси, а затем добавления находящегося в форме порошка ЭДТА, BBI и терапевтического белка или пептида. В некоторых вариантах реализации порошковые компоненты добавляют в указанном порядке. В других вариантах реализации полученную смесь необязательно смешивают и/или гомогенизируют.

[00157] Применяемый в настоящей заявке термин «состоящий по существу из» ограничивает объем изобретения указанными материалами или этапами, а также тем, что существенно не влияет на основные и новые характеристики заявленного изобретения.

[00158] В одном варианте реализации термин «примерно» относится к отклонению от 1 до 10%, или в другом варианте реализации от 5 до 15%, или в другом варианте реализации до 10%, или в другом варианте реализации до 25% отклонения от указанных значений, кроме случаев, когда контекст указывает, что отклонение не должно приводить к значению, превышающему 100%.

[00159] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения «масса» относится к «сухой массе». В других вариантах реализации «масса» относится к общей массе.

[00160] В некоторых вариантах реализации термин «включает» или его грамматические формы относится к включению указанных компонентов настоящего изобретения, а также к включению других активных агентов и фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ, смягчающих веществ, стабилизаторов и т.д. известных в фармацевтической промышленности.

[00161] В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает комбинированные препараты. В одном варианте реализации термин «комбинированный препарат» в основном определяет «набор частей» в том смысле, что компоненты комбинации, как определено выше, могут применяться независимо или в различных комбинациях, то есть одновременно, параллельно, отдельно или последовательно.

[00162] В некоторых вариантах реализации композиции по настоящему изобретению будут состоять по существу из компонентов, описанных в настоящей заявке, в любой форме или варианте реализации, описанных в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации термин «содержит» (включает) относится к включению указанных компонентов, как описано в настоящей заявке, таких как rBBI и терапевтические пептиды или терапевтические белки из настоящего изобретения, а также к включению других активных агентов и фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ, смягчающих веществ, стабилизаторов и т.д., известных в фармацевтической промышленности. В некоторых вариантах реализации термин «состоящий по существу из» относится к композиции, единственным активным ингредиентом которой являются указанные терапевтические пептиды или терапевтические белки настоящего изобретения и rBBI, однако могут быть включены другие соединения, которые предназначены для стабилизации, сохранения и т.д. состава, но не участвующие непосредственно в терапевтическом эффекте указанного активного ингредиента, и могут быть включены другие ингибиторы протеазы, однако, как известно, включение rBBI является важным компонентом композиции, улучшающей пролонгированную, устойчивую активность терапевтических пептидов или терапевтических белков по настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации термин «состоящий по существу из» относится к композиции, единственным активным ингредиентом которой с сопоставимым механизмом действия или сопоставимой молекулярной мишенью является указанный активный ингредиент, однако могут быть включены другие активные ингредиенты с таким вторичным активными ингредиентами, которые действуют на разные мишени или обладают паллиативной способностью, и тем представляют собой терапевтические пептиды или терапевтические белки по настоящему изобретению, и такая композиция будет дополнительно содержать rBBI, как описано. В некоторых вариантах реализации термин «состоящий по существу из» может относиться к компонентам, которые способствуют высвобождению активного ингредиента в дополнение к rBBI, который служит для ускорения доставки/предотвращения деградации и т.д. терапевтических пептидов или терапевтических белков по настоящему изобретению, как описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации термин «состоящий» относится к композиции, которая содержит терапевтические пептиды или терапевтические белки по настоящему изобретению, как описано в настоящей заявке, в качестве единственного активного ингредиента, rBBI и фармацевтически приемлемого носителя или наполнителя.

[00163] Поскольку в настоящей заявке были проиллюстрированы и описаны некоторые особенности настоящего изобретения, рядовые специалисты в данной области техники теперь смогут сделать множество модификаций, замен, изменений и эквивалентов. Таким образом, следует понимать, что прилагаемая формула изобретения предназначена для охвата всех таких модификаций и изменений, которые соответствуют истинной сущности настоящего изобретения.

[00164] Специалистам в данной области техники будет понятно, что в него могут быть внесены различные изменения в форме и деталях без отступления от сущности и объема настоящего изобретения, изложенных в прилагаемой формуле изобретения. Специалисты в данной области техники поймут или смогут установить, применяя не более чем рутинное экспериментирование, многие эквиваленты конкретных вариантов реализации изобретения, описанных в настоящей заявке. Предполагается, что такие эквиваленты входят в объем формулы изобретения.

[00165] Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в настоящей заявке, включены в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте, как если бы каждая отдельная публикация или патент были специально и индивидуально указаны для включения посредством ссылки. В случае противоречия между спецификацией и включенной ссылкой, спецификация имеет преимущественную силу. Если в этом документе указаны номерные диапазоны, крайние точки включены в этот диапазон. Кроме того, следует понимать, что если не указано иное или иное не очевидно из контекста и понимания рядового специалиста в данной области техники, значения, которые выражены как диапазоны, могут принимать любое конкретное значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, необязательно включая или исключая одну или обе крайние точки в различных вариантах реализации настоящего изобретения до одной десятой единицы нижнего предела диапазона, если контекст явно не диктует иное. Если процент указан в отношении значения, которое по своей сути имеет целые числа, любая результирующая дробь может быть округлена до ближайшего целого числа.

[00166] В формуле изобретения формы единственного числа (соотв. артиклям «а», «an» и «the» в первоначальном тексте) означают один или более, если не указано иное или иное не очевидно из контекста. Пункты формулы изобретения или описания, которые включают «или» или «и/или» между членами группы, считаются удовлетворенными, если один, более чем один или все члены группы присутствуют, применены или иным образом относятся к настоящему продукту или процессу, если не указано иное или иное не очевидно из контекста. Настоящее изобретение включает варианты реализации, в которых ровно один член группы присутствует, применен или иным образом относится к настоящему продукту или процессу. Настоящее изобретение также включает варианты реализации, в которых более одного или все члены группы присутствуют, применяются или иным образом относятся к настоящему продукту или процессу. Кроме того, следует понимать, что настоящее изобретение обеспечивает в различных вариантах реализации все вариации, комбинации и перестановки, в которых вводятся одно или несколько ограничений, элементов, пунктов, описательных терминов и т.д. из одного или нескольких перечисленных пунктов формулы изобретения в другой пункт формулы изобретения, зависящий от того же основного пункта формулы изобретения, если не указано иное или если специалисту в данной области техники не будет очевидно, что возникнет противоречие или несоответствие. Если элементы представлены в виде списков, например, в формате группы Маркуша или подобном следует понимать, что каждая подгруппа элементов также раскрывается, и любой элемент (элементы) может быть удален из группы.

[00167] Следует понимать, что в целом, когда настоящее изобретение или аспекты настоящего изобретения упоминаются как содержащие определенные элементы, признаки и т.д., определенные варианты реализации изобретения или аспекты изобретения состоят или по существу состоят из таких элементов, функций и т.д. Для простоты эти варианты реализации не во всех случаях отдельно изложены в настоящей заявке дословно. Определенные пункты формулы изобретения представлены в зависимой форме для удобства, но заявитель оставляет за собой право переписать любой зависимый пункт формулы изобретения в независимом формате, включив в него элементы или ограничения независимого пункта формулы изобретения и любых других пунктов формулы изобретения, от которых он зависит, и такой переписанный пункт формулы изобретения должен считаться эквивалентным во всех отношениях зависимому пункту формулы изобретения, в какой бы форме он ни был представлен (в измененном или неизмененном виде) до представления в независимом формате.

[00168] Следующие ниже примеры описывают определенные варианты реализации изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом объем настоящего изобретения.

РАЗДЕЛ ПОДРОБНОГО ОПИСАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

Пример 1: Получение рекомбинантного BBI

Материалы и методы

[00169] Ген экспрессии рекомбинантного ингибитора протеиназы типа Боумена-Бирка (rBBI) оптимизировали по кодонам и синтезировали в системе Pichia pastoris. Плазмида, применяемая для секреторной экспрессии BBI, представляла собой вектор экспрессии pPIC9K Pichia (mvitrogen), экспрессируемый в хозяине: Pichia Pastoris GS115. Смещенную и оптимизированную последовательность ДНК BBI клонировали в рамке считывания с пре-последовательностью α-фактора спаривания Saccharomyces cerevisiae (сайт расщепления STE13 удалили) в плазмиде pPIC9K для получения клона, который будет экспрессировать секретируемый BBI.

[00170] Оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты хозяина Pichia pastoris для BBI имеет следующий вид:

[00171]

[00172] Аминокислотная последовательность BBI, выделенного из Glycine max (соя) (Glycine hispida) UniProtKB - P01055 (IBB1SOYBN) (ПОаа), выглядит следующим образом:

[00173] Жирным шрифтом обозначен стартовый кодон, подчеркнутым обозначен сигнальный пептид, а выделенная курсивом часть является пропептидом. Обозначения остатков обычным шрифтом соответствуют цепи Е00124, последовательности, которую подвергли смещению гена и оптимизации для экспрессии в Pichia, а трансляция оптимизированной последовательности гена in silico дала последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO: 2.

[00174] К 3'-концу конечной последовательности ДНК добавили два стоп-кодона (выделенный курсивом, жирным шрифтом и подчеркнутый текст в SEQ ID NO: 1). Смещенную и оптимизированную последовательность ДНК BBI клонировали в рамке считывания с пре-последовательностью α-фактора спаривания Saccharomyces cerevisiae (сайт расщепления STE13 удалили) в плазмиде pPIC9K для получения клона, который будет экспрессировать секретируемый BBI. Затем рекомбинантные конструкции повторно охарактеризовали с помощью секвенирования.

[00175] Экспрессию рекомбинантного продукта проводили с помощью стандартной методологии. Вкратце, Pichia культивировали в среде YPD при 30°С на шейкере при OD₆₀₀ от 0,8 до 1,0, после чего клетки собирали, промывали, суспензировали и промывали в 100 мМ LiCl, а затем трансформировали. Применяли стандартный протокол трансформации. Вкратце, затем раствор LiCl-клеток промывали и ресуспензировали в 50% растворе ПЭГ-4000, содержащем 1М LiCl одноцепочечную фрагментированную ДНК спермы лосося и плазмидную ДНК в стерильной воде (5-10 мкг; 100-200 нг/мкл). Клетки инкубировали при 30°С в течение 30 минут, затем подвергали тепловому шоку при 42°С в течение 20-25 минут, после чего клетки промывали и ресуспензировали в среде YPD, инкубировали при 30°С, затем высевали на планшеты для селекции YNB-His и инкубировали в течение еще 2-3 дней при 30°С.

[00176] Около 1000 предполагаемых клонов проверяли на получение высокопродуктивного клона. Для оптимизации процесса в ферментерах объемом 200 мл, 1 л и 5 л размножили партии 5-6 клонов. Очищенный секретированный белок rBBI из клона В17 подвергли секвенированию на N- и С-концах с помощью MALDI-TOF-MS, при этом наблюдаемые N- и С-концевые последовательности были такими, как ожидалось. Данные спектра подтверждают, что наблюдаемая масса такая же, как ожидалось, с однородностью 99%. Таким образом, процессинг rBBI из клона В17 был интактным без какой-либо делеции или добавления дополнительных остатков из сигнального пептида. Поэтому выбрали клон В17 в качестве потенциально высокопродуктивного клона и дополнительно взяли его для увеличения объема.

Пример 2: Исследование рекомбинантного продукта BBI

[00177] Клон В17 дополнительно изучили на предмет экспрессии, очистки и получения материала в объеме 200 мл, 5 л и 50 л, и очищенный белок охарактеризовали с применением различных аналитических методов.

[00178] Анализ методом ОФ-ВЭЖХ провели по стандартной методике, и результаты изобразили на Фигуре 1, изображающей анализ RP-HPLC, и наложили на доступный стандарт. Конечный очищенный rBBI показал такое же время удерживания, как и стандартный очищенный BBI.

[00179] Лиофилизированный порошок получили из очищенного rBBL и оценили количество общего содержания белка по ВСА с применением стандартной методологии (Фигура 2), и SDS-PAGE анализ в 15% геле в восстанавливающих и не-восстанавливающих условиях и окрашивание Кумасси синим подтвердили размер белка (Фигура 3).

[00180] Проверили ферментативную активность ингибитора протеазы для рекомбинантного продукта и достигли видимого ингибирования активности химотрипсина (Фигура 4), а также ингибирования активности трипсина (Фигура 5). Неожиданно результаты этих анализов продемонстрировали гораздо большее ингибирование ферментативной активности при применении рекомбинантного белка по сравнению с очищенным SBTI, который был очищен из сои.

[00181] Пример 3: Ингибитор рекомбинантной протеазы обеспечивает неожиданную эффективность

Материалы и методы

[00182] Приобретенных свиней в коммерческом источнике без SPF (полученные от Ibelin Farm (Израиль) (n=8) в возрасте 3-4 месяцев массой 25-30 кг анестезировали натощак изофлураном (2 л О₂ в минуту и 3-5% изофлурана), пометили для простоты идентификации и интубации. Доступ к воде был неограниченным. Животных размещали на левом боку и препараты вводили через эндоскопический катетер под эндоскопическим контролем непосредственно в двенадцатиперстную кишку. Это исследование проводили после одобрения того же Израильского Совета по экспериментам на животных, Министерства здравоохранения (протокол № IL-16-11-400).

[00183] После инъекции 1 мл тестируемого состава вводили 150-180 мл воздуха, чтобы гарантировать доставку препарата в двенадцатиперстную кишку. Кровь брали из катетера в центральной вене (который вводили в первый день экспериментов и заменяли по мере необходимости) в следующие моменты времени: 15 минут и непосредственно перед дозированием, и каждые 15 минут в течение 3 часов после введения дозы, а затем 3:20, 3:40, 4:00 и 4:30 после введения дозы. Небольшую часть (5 мкл) образцов крови применяли для определения концентрации глюкозы с помощью глюкометра. Когда показания были <10 мг/дл, образцы тестировали снова, и представляли среднее значение двух показаний. Между обработками установили минимальный двухдневный период вымывания.

[00184] Эксперимент проводился в условиях 150 мг ЭДТА, 8 мг инсулина и либо очищенного рекомбинантного BBI, полученного, как описано в настоящей заявке выше, либо очищенного из SBTI, выделенного из соевой муки, как описано в публикации международной патентной заявки РСТ WO/2013/114369.

[00185] Условия эксперимента были такими, как описано в Таблице 1 ниже, при этом каждый тестируемый объект испытывали на 4 разных свиньях:

[00186] Все тестируемые образцы готовили в 1 мл рыбьего жира и хранили в холодильнике. Перед применением образцы доводили до комнатной температуры и тщательно перемешивали перед введением.

[00187] Анализ данных включал оценку уровней циркулирующей глюкозы как функции времени.

[00188] За животными наблюдали в течение всего периода исследования, и во время этого исследования не наблюдалось никаких отклонений от нормы, при этом масса животных оставалась стабильной на протяжении всего исследования.

Результаты:

[00189] В то время как все составы вызывали снижение уровней циркулирующей глюкозы (Фигура 6), применение рекомбинантного BBI неожиданным образом последовательно приводило к более низким уровням глюкозы в течение длительного периода времени.

[00190] Как было показано ранее, составы, содержащие SBTI, обеспечивали снижение уровней циркулирующей глюкозы с 50 мг/дл примерно до 35 мг/дл в течение 30 минут, но уже менее чем через три часа после введения уровни циркуляции возвращались практически к исходным значениям и, более того, возврат к исходным значениям был постепенным, начиная с часа после приема пероральной дозы.

[00191] Совершенно неожиданно все группы, предоставившие рекомбинантный BBI, продемонстрировали более быстрое и качественно большее снижение циркулирующих уровней примерно до 20 мг/дл, и этот эффект сохранялся в течение по крайней мере 2 часов после введения дозы, после чего также было очевидно постепенное увеличение, однако животные, которым вводили 100 мг рекомбинантного BBI (rBBI) с 25 мг KTI, через 4 часа все еще не вернулись к исходному уровню, а животные, которым вводили 100 мг только rBBI, не возвращались к исходному уровню, пока не прошло более 3,5 часов после введения. Неожиданно, животные, которым вводили только 50 мг rBBI и KTI также не возвращались к исходному уровню, пока не прошло более 3 часов после введения.

[00192] Таким образом, результаты подтвердили, что, неожиданно, rBBI был более эффективен в снижении уровней циркулирующей глюкозы по сравнению с очищенными композициями, содержащими BBI, и что превосходный эффект потенциально сохранялся в течение длительного периода.

[00193] Пример 4: Ингибитор рекомбинантной протеазы со временем обеспечивает неожиданную эффективность

Материалы и методы

[00194] Приобретенных коммерческих свиней без SPF (полученные от Ibelin Farm (Израиль) (n=8) в возрасте 3-4 месяцев массой 25-30 кг анестезировали натощак изофлураном (2 л О₂ в минуту и 3-5% изофлурана), пометили для простоты идентификации и интубации. Доступ к воде был неограниченным. Животных размещали на левом боку и препараты вводили через эндоскопический катетер под эндоскопическим контролем непосредственно в двенадцатиперстную кишку. Это исследование проводили после одобрения того же Израильского Совета по экспериментам на животных, Министерства здравоохранения (протокол № IL-16-11-400).

[00195] После инъекции 1 мл тестируемого состава вводили 150-180 мл воздуха, чтобы гарантировать доставку препарата в двенадцатиперстную кишку. Кровь брали из катетера в центральной вене (который вводили в первый день экспериментов и заменяли по мере необходимости) в следующие моменты времени: 15 минут и непосредственно перед дозированием, и каждые 15 минут в течение 3 часов после введения дозы, а затем 3:20, 3:40, 4:00, 4:30 и 5 часов после введения дозы. Небольшую часть (5 мкл) образцов крови применяли для определения концентрации глюкозы с помощью глюкометра. Когда показания были <10 мг/дл, образцы тестировали снова, и представляли среднее значение двух показаний. Между обработками установили минимальный двухдневный период вымывания.

[00196] Эксперимент проводился в условиях 150 мг ЭДТА и 4 мг инсулина и увеличивающимися количествами рекомбинантного BBI, полученного, как описано в настоящей заявке выше.

[00197] Условия эксперимента были такими, как описано в Таблице 2 ниже, при этом каждый тестируемый объект испытывали за 8-10 сеансов на 7-8 разных свиньях:

[00198]

[00199] Все тестируемые образцы готовили в 1 мл рыбьего жира и хранили в холодильнике. Перед применением образцы доводили до комнатной температуры и тщательно перемешивали перед введением.

[00200] Анализ данных включал оценку отклонения от исходного уровня и процентное изменение от исходного уровня глюкозы, площадь под кривой (AUC) определяли для каждого сеанса лечения. Кроме того, для каждого сеанса лечения также определяли время от первого падения до первого подъема показаний глюкозы.

[00201] За животными наблюдали в течение всего периода исследования, и во время этого исследования не наблюдалось никаких отклонений от нормы, при этом масса животных оставалась стабильной на протяжении всего исследования.

Результаты:

[00202] Пример 3 продемонстрировал, что rBBI обеспечивает усиленный гликемический контроль за счет большего снижения уровней циркулирующей глюкозы у субъектов, которым вводили 8 мг инсулина перорально, когда ингибитор протеазы представлял собой рекомбинантный BBI, в отличие от химически очищенного. Для дальнейшего изучения эффектов rBBI и расширения результатов ради интереса оптимизировали rBBI и оценили эффекты с течением времени. С этой целью аналогично оценивали пероральные составы, содержащие только 4 мг инсулина, но содержащие 12,5, 25, 50 и 75 мг rBBI. В таблице 3 представлены результаты этих исследований:

[00203]

[00204] Наименьшее снижение глюкозы от исходного уровня относительно AUC, следующего за лечением с помощью ORMD-0801, содержащим 25 мг rBBI, с последующим лечением составом, содержащим 75 мг rBBI. При рассмотрении ответов животных на лечение составами, содержащими ингибитор протеазы, по сравнению с контрольным лечением, не содержащим ингибитора протеаз, опять же, составы, содержащие 25 мг rBBI, а затем 75 мг rBBI, дали наибольшее изменение от исходного уровня AUC (-6,369 и -4,640, соответственно) и, соответственно, наибольшее отклонение от расчетов AUC контрольного сеанса (-4 989 и -2 960, соответственно).

[00205] Что касается устойчивости эффекта, совершенно неожиданно, что составы, содержащие rBBI, обеспечивали длительный эффект со средним интервалом в 140 минут между первым признаком снижения уровня глюкозы и первым признаком ее возвращения к исходным значениям у испытуемых субъектов. Этот эффект был на 75% дольше, чем продолжительность эффекта, измеренная у контрольных животных.

[00206] Таким образом, удивительно и неожиданно, хотя последующие этапы очистки BBI от средств чисто химической экстракции или химической очистки рекомбинантно экспрессируемых белков по существу идентичны, когда исходным источником для BBI является rBBI, в этих исследованиях обнаружили более продолжительную активность ингибитора.

[00207] Таким образом, совершенно неожиданно рекомбинантного BBI оказалось достаточно в качестве единственного ингибитора протеазы для обеспечения устойчивого и качественно лучшего гликемического контроля.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Oramed, LTD.

<120> КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ИНГИБИТОР ПРОТЕАЗЫ,

СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> ORAMED20940PC

<150> 62/683061

<151> 2018-06-11

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 219

<212> ДНК

<213> Pichia pastoris

<400> 1

gatgacgaaa gctctaagcc atgctgcgat cagtgtgctt gtaccaagtc caacccacca 60

cagtgtagat gctccgacat gcgtttgaac tcctgtcact ccgcttgcaa gtcctgtatc 120

tgtgccttgt cctacccagc tcagtgtttc tgcgtcgaca tcaccgactt ctgctacgag 180

ccatgtaagc catctgagga cgataaggaa aactaataa 219

<210> 2

<211> 110

<212> Белок

<213> Glycine max

<400> 2

Met Val Val Leu Lys Val Cys Leu Val Leu Leu Phe Leu Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Thr Ser Ala Asn Leu Arg Leu Ser Lys Leu Gly Leu Leu Met Lys

20 25 30

Ser Asp His Gln His Ser Asn Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys

35 40 45

Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser

50 55 60

Asp Met Arg Leu Asn Ser Cys His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ile Cys

65 70 75 80

Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gln Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe

85 90 95

Cys Tyr Glu Pro Cys Lys Pro Ser Glu Asp Asp Lys Glu Asn

100 105 110

<210> 3

<211> 100

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Репрезентативная последовательность

<400> 3

Met Lys Met Ser Arg Leu Cys Leu Ser Val Ala Leu Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Gly Thr Leu Ala Ala Ser Thr Pro Gly Cys Asp Thr Ser Asn Gln Ala

20 25 30

Lys Ala Gln Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro

35 40 45

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu

50 55 60

Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe

65 70 75 80

Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala Ile Gly Pro

85 90 95

Trp Glu Asn Leu

100

<210> 4

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность предшественника

<400> 4

Met Lys Ser Thr Ile Phe Phe Leu Phe Leu Phe Cys Ala Phe Thr Thr

1 5 10 15

Ser Tyr Leu Pro Ser Ala Ile Ala Asp Phe Val Leu Asp Asn Glu Gly

20 25 30

Asn Pro Leu Glu Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Ile Leu Ser Asp Ile Thr

35 40 45

Ala Phe Gly Gly Ile Arg Ala Ala Pro Thr Gly Asn Glu Arg Cys Pro

50 55 60

Leu Thr Val Val Gln Ser Arg Asn Glu Leu Asp Lys Gly Ile Gly Thr

65 70 75 80

Ile Ile Ser Ser Pro Tyr Arg Ile Arg Phe Ile Ala Glu Gly His Pro

85 90 95

Leu Ser Leu Lys Phe Asp Ser Phe Ala Val Ile Met Leu Cys Val Gly

100 105 110

Ile Pro Thr Glu Trp Ser Val Val Glu Asp Leu Pro Glu Gly Pro Ala

115 120 125

Val Lys Ile Gly Glu Asn Lys Asp Ala Met Asp Gly Trp Phe Arg Leu

130 135 140

Glu Arg Val Ser Asp Asp Glu Phe Asn Asn Tyr Lys Leu Val Phe Cys

145 150 155 160

Pro Gln Gln Ala Glu Asp Asp Lys Cys Gly Asp Ile Gly Ile Ser Ile

165 170 175

Asp His Asp Asp Gly Thr Arg Arg Leu Val Val Ser Lys Asn Lys Pro

180 185 190

Leu Val Val Gln Phe Gln Lys Leu Asp Lys Glu Ser Leu Ala Lys Lys

195 200 205

Asn His Gly Leu Ser Arg Ser Glu

210 215

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу введения субъекту терапевтически эффективного количества пептида или белка до 100 килодальтон в пероральной фармацевтической композиции, которая содержит выделенный рекомбинантно экспрессированный ингибитор Боумена-Бирка (BBI), при этом указанный рекомбинантно экспрессированный BBI экспрессируется в дрожжевой системе экспрессии, и указанная дрожжевая система экспрессии представляет собой Pichia pastoris. Изобретение обеспечивает улучшенную длительную активность терапевтических белков и пептидов. 14 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 4 пр.

1. Способ введения субъекту терапевтически эффективного количества пептида или белка в пероральном составе, причем указанный способ включает получение пероральной фармацевтической композиции, содержащей терапевтический пептид или терапевтический белок до 100 килодальтон, хелатор двухвалентных катионов и выделенный рекомбинантно экспрессированный ингибитор Боумена-Бирка (BBI), где указанный BBI или указанный терапевтический пептид, или терапевтический белок до 100 килодальтон, или их комбинация представлены в указанном составе в более низкой концентрации, чем была бы терапевтически эффективной в идентичном в остальном пероральном составе, содержащем химически очищенный BBI вместо указанного выделенного рекомбинантно экспрессированного BBI, и достижение сравнимого терапевтического эффекта у указанного субъекта, и при этом указанный рекомбинантно экспрессированный BBI экспрессируется в дрожжевой системе экспрессии, и указанная дрожжевая система экспрессии представляет собой Pichia pastoris.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный рекомбинантно экспрессированный BBI имеет нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95-99% идентичности с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, или указанный рекомбинантно экспрессированный BBI имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный состав дополнительно содержит ингибитор трипсина, отличный от указанного BBI, где предпочтительно указанный ингибитор трипсина представляет собой ингибитор трипсина Кунитца 3 (KTI3).

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанный KTI3 химически выделяют и очищают до по меньшей мере 85% чистоты, измеренной методом электрофореза в полиактиламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), или указанный KTI3 очищают до содержания белка более 95%, согласно измерению в анализе BCA, или указанный KTI3 экспрессируют рекомбинантно.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный терапевтический белок подходит для лечения субъекта с метаболическим заболеванием или нарушением, где предпочтительно указанный терапевтический пептид или терапевтический белок выбран из группы, состоящей из инсулина, гемагглютинина гриппа, нейраминидазы гриппа, глюкагона, интерферона гамма, интерферона бета, интерферона альфа, гормона роста, эритропоэтина, GLP-1 (глюкогонподобного пептида 1), аналога GLP-1, лептина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), ренина, релизинг-фактора гормона роста, паратиреоидного гормона, тиреотропного гормона, фолликулостимулирующего гормона, кальцитонина, лютеинизирующего гормона, глюкагона, фактора свертывания крови, фактора, препятствующего свертыванию, предсердного натрийуретического фактора, белка сурфактанта A (SP-A), белка сурфактанта B (SP-B), белка сурфактанта C (SP-C), белка сурфактанта D (SP-D), активатора плазминогена, бомбезина, гемопоэтического фактора роста (колониестимулирующий фактор, множественный), фактора некроза опухоли (TNF), энкефалиназы, RANTES (регулируется при активации, нормальные Т-клетки экспрессируются и секретируются), воспалительного белка макрофагов человека (MIP-1-альфа), сывороточного альбумина, антимюллеровского гормона, релаксина, мышиного гонадотропин- рилизинг гормона, ДНКазы, ингибина, активина, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), нейротрофического фактора, нейротрофина-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), фактора роста нервов, тромбоцитарного фактора роста (PDGF), фактор роста фибробластов, трансформирующего фактора роста (TGF), инсулиноподобного фактора роста-I и -II (IGF- I и IGF-II), дез(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста-1 (IGFBP-1), IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, фактора роста кератиноцитов, остеоиндуктивного фактора, костного морфогенетического белка (BMP)-2, ВМР-4, BMP-7, колониестимулирующего фактора (CSF), интерлейкина (IL), супероксиддисмутазы, фактора ускорения распада, члена семейства хемокинов и фактора комплемента.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанный терапевтический пептид или терапевтический белок выбран из группы, состоящей из инсулина и аналога GLP-1.

7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанный терапевтический пептид или терапевтический белок является иммуномодулятором, где предпочтительно указанный терапевтический пептид или терапевтический белок представляет собой Глатирамера ацетат.

8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанный хелатор представляет собой ЭДТА.

9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанный состав представляет собой жидкий состав на масляной основе.

10. Способ по п. 9, дополнительно включающий:

(А) полиэтиленгликолевый (ПЭГ) эфир моноглицерида, диглицерида, триглицерида или их смеси, где необязательно указанный ПЭГ эфир представлен в виде смеси (а) моноацилглицерина, диацилглицерина, триацилглицерина или их смеси; и (b) полиэтиленгликолевого (ПЭГ) эфира жирной кислоты, где необязательно часть (а) указанной смеси содержит моноацилглицерины C₈-C₁₈, диацилглицерины и триацилглицерины, и где необязательно:

(i) часть (b) указанной смеси содержит ПЭГ моноэфиры и диэфиры смеси генетически связанных полипептидных меток C₈-C₁₈ жирных кислот или их комбинацию, или

(ii) часть (а) указанной смеси содержит C₈-C₁₈ моноацилглицерины, диацилглицерины и триацилглицерины; часть (b) указанной смеси содержит ПЭГ-32 моноэфиры и диэфиры смеси C₈-C₁₈ жирных кислот; указанный жидкий состав на масляной основе дополнительно включает (c) свободный ПЭГ-32; и мас./мас. отношение части (а) указанной смеси к сумме части (b) указанной смеси и (с) составляет от 10:90 до 30:70, включительно, и где необязательно (а), (b) и (c) вместе составляют 8-16 мас./мас.%, включительно от указанного жидкого состава на масляной основе; или

(В) свободный ПЭГ.

11. Способ по любому из пп. 9 или 10, отличающийся тем, что указанный состав содержит желатин и глицерин.

12. Способ по любому из пп. 1-11, дополнительно включающий неионогенное поверхностно-активное вещество, предпочтительно указанное неионогенное поверхностно-активное вещество представляет собой поверхностно-активное вещество на основе полисорбата, более предпочтительно указанное поверхностно-активное вещество на основе полисорбата представляет собой полисорбат 80, и где необязательно указанный полисорбат 80 составляет 3-10 мас./мас.%, включительно от указанного жидкого состава на масляной основе.

13. Способ по любому из пп. 9-12, отличающийся тем, что указанным маслом является рыбий жир.

14. Способ по любому из пп. 9-13, отличающийся тем, что указанный жидкий состав на масляной основе не содержит воды.

15. Способ по любому из пп. 1-14, дополнительно включающий покрытие, устойчивое к деградации в желудке, где предпочтительно указанное покрытие представляет собой pH-чувствительную капсулу или мягкую желатиновую капсулу.