БЕЛОК, НАЦЕЛЕННЫЙ НА ИНТЕГРИН, И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК A61K38/17 A61P1/16 A61P43/00 

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 62/129499, поданной 6 марта 2015 г., которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

[0002] Настоящее изобретение было осуществлено при государственной поддержке по контракту CA175122, заключенному Национальным институтом здоровья. Государство имеет определенные права на данное изобретение.

[0003] Настоящая заявка относится к соединениям или белкам, которые можно применять в лечении патологических состояний, связанных с фиброзом. Настоящее изобретение в общем случае относится к полипептиду, который специфически связывает интегрин α_vβ₃. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу применения полипептида для снижения ангиогенеза, клеточной пролиферации и фиброза и для лечения рака, портальной гипертензии и связанных с фиброзом заболеваний и патологических состояний.

[0004] Как правило, солидные опухоли не могут вырастать больше 3-4 мм в диаметре без создания собственной системы кровоснабжения. Таким образом, развитие опухолевых кровеносных сосудов является важным для метастазирования рака.

[0005] Были разработаны антиангиогенные лекарственные препараты, такие как Авастин®, которые ингибируют ангиогенез солидных опухолей. Однако клинические исследования показали, что благоприятное действие этих антиангиогенных лекарственных препаратов на выживаемость пациентов было несущественным. Кроме того, разработка антиангиогенных лекарственных препаратов была в основном сфокусирована на стратегии блокирования сигнализации VEGF/VEGFR или других путей РТК, которые играют роль в стимуляции пролиферации и миграции эндотелиальных клеток.

[0006] Интегрины являются гетеродимерными, т.е. представляющими собой комбинацию разных α- и β-субъединиц, рецепторами клеточной поверхности. Интегрины не только играют важную роль в адгезии клеток к внеклеточному матриксу («ВКМ»), но также действуют как молекулы выходящей и входящей двусторонней сигнализации, которая обеспечивает активацию клетки в ответ на многие биологические раздражители. Интегрин α_vβ₃ имеет уникальные профили экспрессии и функциональность в ангиогенных эндотелиальных клетках. Несмотря на это, большинство современных подходов к разработке терапевтических средств сфокусировано на связывании интегрина с лигандами. Ограничения, связанные с участком(ами) нацеливания и механизмом(ами) действия препятствуют успешной разработке этих терапевтических средств.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] В настоящем изобретении предложен белок, который ингибирует ангиогенез клеток без нацеливания на связывание интегрина с лигандами, в частности без нацеливания на VEGF/VEGFR или любые другие пути РТК. Один аспект данного изобретения относится к антиангиогенному белку, который связывается с новым участком интегринов α_vβ₃, при этом белок включает вариант D1-CD2.

[0008] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу введения антиангиогенного белка, который связывается с новым участком интегринов α_vβ₃. Данный способ включает введение терапевтически эффективного количества антиангиогенного белка, при этом антиангиогенный белок включает вариант D1-CD2.

[0009] В соответствии с дополнительным аспектом патентируемое изобретение относится к способу уменьшения или предотвращения фиброза у нуждающегося в этом или подверженного риску субъекта, при этом указанный способ включает введение выделенного полипептида, который специфически связывается с интегрином α_vβ₃ в βA-домене в области α2-спирали, петли B-C и петли α2-α3.

[0001] В соответствии с дополнительным аспектом патентируемое изобретение относится к полипептиду, специфически связывающемуся с интегринами, и способу уменьшения или предотвращения фиброза у нуждающегося в этом или подверженного риску субъекта, при этом указанный способ включает введение указанному субъекту выделенного полипептида, который специфически связывается с интегрином α_vβ₃ в βA-домене в области α2-спирали, петли B-C и петли α2-α3.

[0002] Как описано в данном документе, в некоторых вариантах реализации изобретения полипептид, который специфически связывается с интегринами α_vβ₃, содержит вариант домена 1 белка клеточной адгезии (D1-CD2), имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 75% сходную с последовательностью D1-CD2 дикого типа, при этом полипептид специфически связывается с интегрином α_vβ₃ в βA-домене в области α2-спирали, петли B-C и петли α2-α3. В некоторых вариантах реализации изобретения константа диссоциации белок-белок составляет менее чем около 1 мкМ. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная замена в варианте имеет значение гидрофильности в диапазоне от около -2 до около +2 оригинальных аминокислот D1-CD2 дикого типа.

[0003] Кроме того, в некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предполагается, что вариант содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из (оригинальный остаток: замена): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gin, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gin: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gin), (He: Leu, Val), (Leu: He, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) и (Val: He, Leu). В некоторых вариантах реализации изобретения вариант содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из L94N, E95D, K96V, I97C, F98N, D99F, L100A, K101S и I102R. В конкретном варианте реализации изобретения вариант содержит последовательность, содержащую замену L94N, E95D, K96V, I97C, F98N, D99F, L100A, K101S и I102R. В некоторых вариантах реализации изобретения вариант содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из I97Y, F98D и D99Y. В конкретном варианте реализации изобретения вариант содержит последовательность, содержащую замены I97Y, F98D и D99Y. В некоторых вариантах реализации изобретения вариант содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из D99N, I102V, Q103I, E104I, E8T, T9V, W10Q, G11M, A12K. В конкретном варианте реализации изобретения вариант содержит последовательность, содержащую замены D99N, I102V, Q103I, E104I, E8T, T9V, W10Q, G11M, A12K.

[0004] Кроме того, в некоторых вариантах реализации изобретения вариант характеризуется по меньшей мере одним межмолекулярным взаимодействием с интегринами α_vβ₃. В некоторых вариантах реализации изобретения вариант связывается с интегринами α_vβ₃ в βA-бороздке. В конкретных вариантах реализации изобретения вариант перекрестно связан с интегрином α_v в TEMKQER. В конкретных вариантах реализации изобретения вариант перекрестно связан с интегрином β₃ в FNEEVKKQ. В других конкретных вариантах реализации изобретения вариант перекрестно связан с интегрином β3 в FNEEVKKQ. В некоторых вариантах реализации изобретения вариант является ПЭГилированным. В некоторых вариантах реализации изобретения вариант ПЭГилирован полиэтиленгликолем. В одном варианте реализации изобретения полиэтиленгликоль представляет собой ПЭГ массой 20 кДа.

[0005] В другом аспекте раскрытого в данном документе предмета изобретения предложена фармацевтическая композиция. Композиция содержит терапевтически эффективное количество описанного выше полипептида. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

[0006] В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ индукции апоптоза у субъекта, имеющего или подверженного риску развития заболевания, связанного с апоптозом. Способ включает введение терапевтически эффективного количества описанной выше фармацевтической композиции.

[0007] Кроме того, в другом аспекте раскрытого в данном документе предмета изобретения предложен способ предотвращения или уменьшения избыточного накопления фиброзного материала во внеклеточном матриксе пораженной или поврежденной ткани субъекта. Данный способ включает этапы определения нуждающегося в лечении субъекта и введения субъекту описанного в данном документе выделенного полипептида, который специфически связывается с интегрином α_vβ₃ в βA-домене в области α2-спирали, петли B-C и петли α2-α3, обеспечивая, таким образом, предотвращение или уменьшение избыточного накопления фиброзного материала во внеклеточном матриксе в указанной ткани указанного субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект имеет по меньшей мере одно из фиброза печени, фиброза поджелудочной железы, фиброза молочной железы или другие типы фиброзных состояний.

[0008] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения фиброзного заболевания у субъекта, имеющего или подверженного риску появления фиброзного заболевания. Данный способ включает этап введения терапевтически эффективного количества обсуждаемой в данном документе фармацевтической композиции. Неограничивающие примеры фиброзного заболевания включают фиброз печени и фиброз поджелудочной железы.

[0009] В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложен способ предотвращения и лечения опухоли у субъекта. Данный способ включает введение терапевтически эффективного количества раскрытой в данном документе фармацевтической композиции.

[0010] В некоторых вариантах реализации изобретения раскрытая в данном документе фармацевтическая композиция подходит для местного применения, инъекции, перорального введения или дозирования с замедленным высвобождением.

[0011] В некоторых вариантах раскрытого в данном документе предмета изобретения субъект является млекопитающим. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект является человеком.

[0012] Кроме того, в некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложен выделенный полипептид, который специфически связывается с интегрином α_vβ₃ в βA-домене в области α2-спирали, петли B-C и петли α2-α3. В некоторых вариантах реализации изобретения K_Д специфического связывания составляет меньше чем около 1 мкM. В других реализации изобретения K_Д специфического связывания составляет от 10^-8 до 10^-9 M.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0013] «Ангиогенез» определяется как образование новой сосудистой системы, которая способствует тканевой перфузии. Это включает образование новых сосудов посредством прорастания эндотелиальных клеток из существующих кровеносных сосудов или реструктурирование существующих кровеносных сосудов, включающее изменение размера, направления созревания или характеристик текучести для улучшения перфузии крови через ткань.

[0014] Термины «субъект», «индивид», «пациент» и «хозяин» взаимозаменяемо употребляются в данном документе и относятся к любому позвоночному, в частности, любому млекопитающему, и, в особенности, к людям, сельскохозяйственным животным и домашним млекопитающим. Субъект может, но необязательно, находиться под присмотром медицинского работника, такого как врач или ветеринарный врач, и может нуждаться в терапевтическом лечении композициями согласно изобретению.

[0015] Термин «фиброзные» заболевания, нарушения или патологические состояния включает указанные в данном документе и дополнительно включает острые и хронические, клинические или субклинические проявления, при которых очевидно наличие фиброгенной биологии или патологии. Фиброзные заболевания, нарушения или патологические состояния включают заболевания, нарушения или патологические состояния, характеризуемые, в целом или частично, избыточной выработкой фиброзного материала, включая избыточную выработку фиброзного материала во внеклеточном матриксе, или замещением элементов нормальной ткани аномальными, нефункциональными и/или накопленными в избыточном количестве компонентами матрикса. Фиброзные заболевания, нарушения или патологические состояния включают, например, фиброгенную биологию или патологию, характеризуемую фиброзом.

[0016] В контексте данного документа термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству композиции, содержащей модифицированный полипептид из неприродных аминокислот, вводимой пациенту, страдающему от заболевания, патологического состояния или нарушения, достаточному для лечения или, по меньшей мере частичного купирования, или в некоторой степени облегчения одного или более симптомов заболевания, нарушения или патологического состояния, лечение которого проводят. Эффективность таких композиций зависит от условий, включая, но не ограничиваясь этим, тяжесть и течение заболевания, нарушения или патологического состояния, предыдущую терапию, состояние здоровья пациента и восприимчивость к лекарственным препаратам, а также решение лечащего врача. Например, терапевтически эффективное количество может быть определено посредством стандартных экспериментов, включая, но не ограничиваясь этим, клиническое исследование с повышением дозы.

[0017] В контексте данного документа термин «вектор» означает молекулу ДНК, служащую носителем, способным стабильно переносить экзогенные гены в клетки-хозяев. Для подходящего применения вектор должен быть реплицируемым, обладать системой для внесения самого себя в клетку-хозяина и содержать селективные маркеры.

[0018] Термин «аминокислота» относится к аминокислотам природного и неприродного происхождения, а также к аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, действующим аналогично аминокислотам природного происхождения. Кодируемые природным образом аминокислоты включают 20 стандартных аминокислот (аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутамин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин) и пиролизин и селеноцистеин. Аминокислотные аналоги относятся к соединениям, имеющим такую же базовую химическую структуру, что и аминокислоты природного происхождения, и содержат, например, альфа-углерод, который связан с водородом, карбоксильной группой, амино-группой и R-группой. Такие аналоги могут содержать модифицированные R-группы (например, норлейцин) или могут иметь модифицированные пептидные остовы, сохраняя при этом такую же базовую химическую структуру, что и аминокислота природного происхождения. Неограничивающие примеры аминокислотных аналогов включают гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид и метилметионин-сульфоний.

[0019] В контексте данного документа термин «эффективное количество» относится к достаточному количеству вводимого агента или соединения, которое будет в некоторой степени облегчать один или более симптомов заболевания или патологического состояния, лечение которого проводят. Результатом может быть уменьшение и/или ослабление признаков, симптомов или причин заболевания или любое другое желаемое изменение биологической системы. В качестве примера вводимый агент или соединение включает, но не ограничивается этим, полипептид из природных аминокислот, полипептид из неприродных аминокислот, модифицированный полипептид из природных аминокислот или модифицированный полипептид из неприродных аминокислот. Композиции, содержащие такие полипептиды из природных аминокислот, полипептиды из неприродных аминокислот, модифицированные полипептиды из природных аминокислот или модифицированные полипептиды из неприродных аминокислот, можно вводить для профилактического, усиливающего и/или терапевтического лечения. Подходящее «эффективное» количество в каждом отдельном случае может быть определено с помощью методов, включая исследование с повышением дозы.

[0020] В контексте данного документа термин «клетка или популяция клеток» относится к выделенной клетке или множеству клеток, извлеченных из ткани или выращенных in vitro с помощью технологий тканевого культивирования. В частности, популяция клеток относится к клеткам in vivo в ткани животного или человека.

[0021] В контексте данного документа термин «приведение в контакт клетки или популяции клеток» относится к доставке пептида или зонда в соответствии с настоящим изобретением в выделенную или культивируемую клетку или популяцию клеток или введение зонда в подходящем фармацевтически приемлемом носителе в ткань-мишень животного или человека. Введение может представлять собой, но не ограничиваться этим, внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, внутримышечное, подкожное или осуществляемое любым другим способом, известным в данной области техники. Одним из предпочтительных способов является доставка непосредственно в кровеносный сосуд, ведущий прямо в целевой орган или ткань, например, поджелудочную железу, что, таким образом, снижает растворение зонда в общей системе циркуляции.

[0022] В контексте данного документа термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к разбавителю, адъюванту, вспомогательному веществу или несущей среде, с которыми вводят гетеродимерный зонд согласно изобретению и которые одобрены федеральным или государственным регуляторным органом или приведены в Фармакопее США или другой общепринятой фармакопее для применения на животных и, в частности, на людях. Такие фармацевтические носители могут быть жидкостями, такими как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Фармацевтические носители могут представлять собой солевой раствор, аравийскую камедь, желатин, крахмальную пасту, тальк, кератин, коллоидный диоксид кремния, мочевину и тому подобное. При введении пациенту гетеродимерный зонд и фармацевтически приемлемые носители могут быть стерильными. Подходящим носителем в случае внутривенного введения гетеродимерного зонда является вода. Также в качестве жидких носителей можно применять солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, в частности, для инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические носители также включают вспомогательные вещества, такие как глюкоза, лактоза, сахароза, глицеролмоностеарат, хлорид натрия, глицерин, пропиленгликоль, вода, этанол и тому подобное. Композиции согласно настоящему изобретению в случае необходимости также могут содержать незначительные количества смачивающих и эмульсифицирующих агентов или рН-буферных агентов. Композиции согласно настоящему изобретению преимущественно имеют форму растворов, эмульсий, составов с замедленным высвобождением или любую другую подходящую для применения форму.

[0023] Термины «полипептид», «пептид» и «белок» взаимозаменяемо употребляются в данном документе и обозначают полимер из аминокислотных остатков.

[0024] Термин «вариант» относится к пептиду или полинуклеотиду, который отличается от эталонного пептида или полинуклеотида, но сохраняет важные свойства. Типичный вариант пептида отличается по аминокислотной последовательности от другого, эталонного пептида. В общем случае разница ограничена так, чтобы последовательности эталонного пептида и варианта были в целом очень сходными, а во многих областях идентичными. Вариант и эталонный пептид могут отличаться по аминокислотной последовательности одной или более модификациями (например, заменами, добавлениями и/или удалениями). Вариант пептида включает консервативно модифицированные варианты (например, на около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 98% и около 99% консервативный вариант) исходной последовательности. Замещенный или вставленный аминокислотный остаток может кодироваться или не кодироваться генетическим кодом. Вариант пептида может быть природным, таким как аллельный вариант, или может быть вариантом неприродного происхождения.

[0025] В контексте данного документа термин «мишень» относится к пептиду, клетке, ткани, опухоли и т.д., для которых необходимо выявление. Пептид-мишень может находиться на поверхности клетки, в клетке, выделенной из организма животного-хозяина, культивируемой клетке или клетке или популяции клеток в ткани животного.

[0026] Настоящее изобретение включает пептиды, которые можно получать из последовательности пептида природного происхождения. Говорят, что пептид «можно получать из аминокислотной последовательности природного происхождения», если его можно получить путем фрагментации последовательности природного происхождения или если его можно синтезировать на основании известной аминокислотной последовательности природного происхождения или генетического материала (ДНК или РНК), который кодирует эту последовательность. В объем настоящего изобретения включены молекулы, которые являются «производными» пептида. Такое «производное» или «вариант» обладает значительной степенью сходства с пептидом или фрагментом пептида сходного размера и способно действовать с такой же биологической активностью, что и пептид.

[0001] В контексте данного документа термин «специфически связывает» или «специфическое связывание» относится к связыванию связывающего белка с предопределенным белком (например, интегринами). Аффинность связывания определяется в контексте константы диссоциации (K_Д). Связывающий белок специфически связывает белок, если K_Д составляет менее чем около 10^-7 M, например, около 10^-8 M или менее, например, около 10^-9 M или менее, около 10^-10 M или менее; около 10^-11 M или менее, около 10^-12 M или менее или даже меньше, и связывается с предопределенным белком с аффинностью, соответствующей K_Д, которая по меньшей мере в десять раз меньше, чем его аффинность в отношении связывания с неспецифическим антигеном (таким как БСА), например, по меньшей мере в 100 раз ниже, например, по меньшей мере в 1000 раз ниже, например, по меньшей мере в 10000 раз ниже. В контексте данного документа термин «K_Д» или «K_д» относится к константе диссоциации конкретного взаимодействия связывания белок-белок, как известно в данной области техники.

[0002] Производные согласно настоящему изобретению включают фрагменты, которые, кроме того, что содержат последовательность, в значительной степени сходную с пептидом природного происхождения, могут содержать одну или более дополнительных аминокислот в амино- и/или карбокси-концах. Аналогично, изобретение включает пептидные фрагменты, в амино- и/или карбокси-концах которых, хоть они и содержат последовательность, в значительной степени сходную с последовательностью пептида природного происхождения, могут отсутствовать одна или более дополнительных аминокислот, которые присутствуют в пептиде природного происхождения.

[0003] В контексте данного документа термин «профилактически эффективное количество» относится к количеству композиции, содержащей по меньшей мере один полипептид из неприродных аминокислот или по меньшей мере один модифицированный полипептид из неприродных аминокислот, применяемому к пациенту, которое будет в некоторой степени облегчать один или более симптомов заболевания, патологического состояния или нарушения, лечение которого проводят. В случае таких профилактических применений такие количества могут зависеть от состояния здоровья пациента, массы и тому подобного. Считается, что в компетентность специалиста в данной области техники входит определение таких профилактически эффективных количеств посредством стандартных экспериментов, включая, но не ограничиваясь этим, клиническое исследование с повышением дозы.

[0004] Выражение «в значительной степени сходные» в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или более последовательностям, которые обладают по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, 95% или выше, или любому целому промежуточному значению идентичности нуклеотидных или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании в отношении максимального соответствия согласно данным алгоритма для сравнения последовательностей, например, такого как описанные ниже, или согласно визуальной оценке. Предпочтительно значительная степень идентичности наблюдается на протяжении области последовательности, длина которой составляет по меньшей мере около 10, предпочтительно около 20, более предпочтительно около 40-60 остатков или любое целое промежуточное значение, предпочтительно на протяжении области из более 60-80 остатков, более предпочтительно по меньшей мере около 90-100 остатков, и наиболее предпочтительно последовательности являются в значительной степени идентичными на протяжении всей длины сравниваемых последовательностей, например, на протяжении кодирующей области нуклеотидной последовательности.

[0005] В контексте данного документа термин «синергетический» относится к комбинации профилактически или терапевтически эффективных агентов, которая является более эффективной, чем суммарное действие любых двух или более отдельных агентов. Синергетическое действие комбинации профилактических или терапевтических агентов может позволить применять более низкие дозы одного или более агентов и/или менее часто вводить агенты субъекту с конкретным заболеванием или патологическим состоянием. В некоторых случаях синергетическое действие комбинации профилактических или терапевтических агентов можно использовать во избежание или для снижения вредных или нежелательных побочных эффектов, связанных с применением отдельного вида терапии.

[0006] В контексте данного документа термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству композиции, содержащей по меньшей мере один полипептид из неприродных аминокислот и/или по меньшей мере один модифицированный полипептид из неприродных аминокислот, вводимой пациенту, страдающему от заболевания, патологического состояния или нарушения, достаточному для лечения или, по меньшей мере частичного купирования, или в некоторой степени облегчения одного или более симптомов заболевания, нарушения или патологического состояния, лечение которого проводят. Эффективность таких композиций зависит от условий, включая, но не ограничиваясь этим, тяжесть и течение заболевания, нарушения или патологического состояния, предыдущую терапию, состояние здоровья пациента и восприимчивость к лекарственным препаратам, а также решение лечащего врача. Например, терапевтически эффективное количество может быть определено посредством стандартных экспериментов, включая, но не ограничиваясь этим, клиническое исследование с повышением дозы.

[0007] Если не указано иное, подразумевается, что конкретная нуклеотидная последовательность также включает консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденными кодонами) и комплементарные последовательности, а также явно указанную последовательность. В частности, замены вырожденными кодонами можно создавать, получая последовательности, в которых третья позиция одного или более выбранных (или всех) кодонов замещена остатками со смешанными основаниями и/или остатками дезоксиинозина. Термин нуклеиновая кислота взаимозаменяемо используется с геном, кДНК, мРНК, олигонуклеотидом и полинуклеотидом.

[0008] В контексте данного документа термин «субъект» относится к мишени введения фармацевтической композиции. Субъектом раскрытых в данном документе способов может быть позвоночное животное, такое как млекопитающее, рыба, птица, рептилия или амфибия. Таким образом, субъектом раскрытых в данном документе способов может быть человек или не человек. Таким образом, в соответствии с раскрытым в настоящем изобретении предметом предложено ветеринарное терапевтическое применение. Следовательно, в раскрытом в настоящем изобретении предмете предложено введение млекопитающим, таким как люди и обезьяны, а также млекопитающим, имеющим значение вследствие нахождения под угрозой, таким как сибирские тигры; имеющим экономическое значение, таким как животные, выращиваемые на фермах для употребления человеком; и/или животным, имеющим социальное значение для людей, таким как животные, содержащиеся в качестве домашних любимцев или в зоопарках. Примеры таких животных включают, но не ограничиваются этим: хищников, таких как кошки и собаки; свиней, включая свиней, кабанов и диких кабанов; жвачных и/или копытных, таких как крупный рогатый скот, быки, овцы, жирафы, олени, козы, бизоны и верблюды; кроликов, морских свинок и грызунов. Также предложено лечение птиц, включая лечение тех видов птиц, которые находятся под угрозой и/или содержатся в зоопарках, а также птиц и, в частности, домашних птиц, т.е. сельскохозяйственных птиц, таких как индюшки, куры, утки, гуси, цесарки и тому подобные, так как они также экономически важны для человека. Таким образом, также предложено лечение сельскохозяйственных животных, включая, но не ограничиваясь этим, домашних свиней, жвачных, копытных, лошадей (включая верховых лошадей), птицы и тому подобных. Данный термин не относится к конкретному возрасту или полу.

[0009] Также изобретение включает очевидные или тривиальные варианты вышеописанных фрагментов, которые содержат непоследовательные аминокислотные замены (и, таким образом, имеют аминокислотные последовательности, которые отличаются от природной последовательности), при условии, что такие варианты обладают активностью, в значительной степени идентичной с активностью вышеописанных производных. Примеры очевидных или тривиальных замен включают, например, замену одного основного остатка на другой (т.е. Arg на Lys), замену одного гидрофобного остатка на другой (т.е. Leu на He) или замену одного ароматического остатка на другой (т.е. Phe на Tyr).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0010] Подробное описание приведено с отсылкой на сопровождающие фигуры. На фигурах крайняя(ие) левая(ые) цифра(ы) порядкового номера определяет фигуру, на которой впервые появляется порядковый номер. Применение одинаковых порядковых номеров на разных фигурах указывает на сходные или идентичные объекты или характеристики.

[0011] ФИГ. 1A представляет собой визуализацию стыковки D1-CD2 в βA-бороздке в соответствии с настоящим изобретением

[0012] ФИГ. 1B представляет собой визуализацию стыковки D1-CD2 в βA-бороздке в соответствии с настоящим изобретением.

[0013] ФИГ. 1C представляет собой визуализацию стыковки D1-CD2 в βA-бороздке в соответствии с настоящим изобретением.

[0014] ФИГ. ID представляет собой визуализацию стыковки D1-CD2 в βA-бороздке в соответствии с настоящим изобретением.

[0015] На ФИГ. 2 представлена таблица, иллюстрирующая межмолекулярную энергию вариантов D1-CD2 в соответствии с настоящим изобретением.

[0016] На ФИГ. 3 представлены показания Н-ЯМР для ProAgio, имеющего сходные структурные свойства со свойствами D1-CD2, в соответствии с настоящим изобретением.

[0017] ФИГ. 4A является графическим представлением, иллюстрирующим взаимодействия ProAgio с интегрином, в соответствии с настоящим изобретением.

[0018] ФИГ. 4B является графическим представлением, иллюстрирующим взаимодействия ProAgio с интегрином, в соответствии с настоящим изобретением.

[0019] На ФИГ. 4C представлена таблица, иллюстрирующая взаимодействия ProAgio с интегрином, в соответствии с настоящим изобретением.

[0020] На ФИГ. 5 приведена экспрессия α_vβ₃ клеток HUVEC в соответствии с настоящим изобретением.

[0021] ФИГ. 6 является графическим представлением, иллюстрирующим присоединение клеток HUVEC к ProAgio, в соответствии с настоящим изобретением.

[0022] ФИГ. 7 изображает экспрессию экзогенного α_vβ₃ в клетках CHO и COS-7 в соответствии с настоящим изобретением.

[0023] ФИГ. 8 является графическим представлением, иллюстрирующим присоединение экспрессирующих α_vβ₃ клеток CHO и COS-7 к покрытым ProAgio планшетам, в соответствии с настоящим изобретением.

[0024] ФИГ. 9 является графическим представлением, иллюстрирующим отсутствие присоединения экспрессирующих интегрин α_IIBβ₃ клеток CHO к покрытым ProAgio планшетам, в соответствии с настоящим изобретением.

[0025] ФИГ. 10 изображает совместную иммунопреципитацию ProAgio с интегрином β₃ в экстрактах клеток HUVEC в соответствии с настоящим изобретением.

[0026] ФИГ. 11 является графическим представлением, иллюстрирующим, что связывание RGD не предотвращает присоединение клеток HUVEC к ProAgio, в соответствии с настоящим изобретением.

[0027] На ФИГ. 12 приведено подтверждение, что связывание RGD не предотвращает присоединение клеток HUVEC к ProAgio, в соответствии с настоящим изобретением.

[0028] ФИГ. 13A изображает перекрестное связывание ProAgio с интегрином α_v в соответствии с настоящим изобретением.

[0029] ФИГ. 13B изображает перекрестное связывание ProAgio с интегрином α_v в соответствии с настоящим изобретением.

[0030] ФИГ. 13C изображает перекрестное связывание ProAgio с применением бис(сульфосукцинимидил)-глутарата в соответствии с настоящим изобретением.

[0031] ФИГ. 14 изображает перекрестное связывание ProAgio с применением глутаральдегида в соответствии с настоящим изобретением.

[0032] ФИГ. 15A изображает перекрестное связывание ProAgio с применением глутаральдегида в соответствии с настоящим изобретением.

[0033] ФИГ. 15B изображает перекрестное связывание ProAgio с применением глутаральдегида в соответствии с настоящим изобретением.

[0034] На ФИГ. 16 показано, что мутации интегрина β₃ снижали присоединение экспрессирующих мутантный интегрин клеток к ProAgio, в соответствии с настоящим изобретением.

[0035] На ФИГ. 17 показано, что мутации снижали присоединение экспрессирующих мутантов клеток CHO, в соответствии с настоящим изобретением.

[0036] ФИГ. 18 является графическим представлением, иллюстрирующим, что мутации снижали присоединение экспрессирующих мутантов клеток CHO к ProAgio, в соответствии с настоящим изобретением.

[0037] На ФИГ. 19 показано, что мутации приводили к прекращению совместной иммунопреципитации ProAgio и интегрина β₃, в соответствии с настоящим изобретением.

[0038] На ФИГ. 20 показано снижение количества и исчезновение стресс-волокон актиновых филаментов после обработки клеток HUVEC с помощью ProAgio в соответствии с настоящим изобретением.

[0039] На ФИГ. 21 показано, что обработка ProAgio приводит к инактивации FAK, активированных посредством присоединения к ВКМ, в соответствии с настоящим изобретением.

[0040] ФИГ. 22 является графическим представлением, иллюстрирующим, что ProAgio индуцирует апоптоз клеток HUVEC, в соответствии с настоящим изобретением.

[0041] ФИГ. 23 является графическим представлением, иллюстрирующим, что ProAgio является более эффективным в индукции апоптоза, чем другие антиангиогенные агенты, в соответствии с настоящим изобретением.

[0042] ФИГ. 24 является графическим представлением, иллюстрирующим, что ProAgio индуцирует апоптоз клеток HUVEC и COS-7 с экзогенной экспрессией интегринов, в соответствии с настоящим изобретением.

[0043] ФИГ. 25 является графическим представлением, иллюстрирующим, что ProAgio индуцирует апоптоз клеток HUVEC и COS-7 с экзогенной экспрессией интегринов, в соответствии с настоящим изобретением.

[0044] На ФИГ. 26 показано, что обработка ProAgio не приводит к всплыванию/отсоединению клеток HUVEC, в соответствии с настоящим изобретением.

[0045] На ФИГ. 27 показано действие обработки ProAgio на каспазу 8, каспазу 9, каспазу 7 и каспазу 3 в соответствии с настоящим изобретением.

[0046] ФИГ. 28 является графическим представлением, иллюстрирующим действие ингибитора каспазы 8 и ингибитора каспазы 9 на ProAgio, в соответствии с настоящим изобретением.

[0047] На ФИГ. 29 показано действие ингибитора каспазы 8 и ингибитора каспазы 9 после взаимной активации в соответствии с настоящим изобретением.

[0048] На ФИГ. 30 показано действие циленгитида на включение каспазы 8 в цитоплазматический домен интегрина β₃ в соответствии с настоящим изобретением.

[0049] ФИГ. 31 изображает ПЭГилирование ProAgio в соответствии с настоящим изобретением.

[0050] ФИГ. 32 является графическим представлением, иллюстрирующим действие и зависимость от дозировки ProAgio-ПЭГ на ингибирование роста опухоли, в соответствии с настоящим изобретением.

[0051] ФИГ. 33 является графическим представлением, иллюстрирующим действие и зависимость от дозировки ProAgio-ПЭГ на ингибирование роста опухоли, в соответствии с настоящим изобретением.

[0052] ФИГ. 34 является графическим представлением, иллюстрирующим действие ProAgio-ПЭГ при введении на поздней стадии роста опухоли, в соответствии с настоящим изобретением.

[0053] ФИГ. 35 является графическим представлением, иллюстрирующим действие ProAgio-ПЭГ при введении на поздней стадии роста опухоли, в соответствии с настоящим изобретением.

[0054] ФИГ. 36 изображает иммуноокрашивание CD31 с тканевыми срезами, полученными из собранных опухолей, для анализа действия ProAgio-ПЭГ на опухолевые сосуды, в соответствии с настоящим изобретением.

[0055] На ФИГ. 37 представлена таблица, иллюстрирующая действие ProAgio-ПЭГ на опухолевые сосуды, в соответствии с настоящим изобретением.

[0056] ФИГ. 38 является графическим представлением, иллюстрирующим действие ProAgio-ПЭГ по сравнению с Авастином® и Эндостаром®, в соответствии с настоящим изобретением.

[0057] ФИГ. 39 является графическим представлением, иллюстрирующим действие ProAgio-ПЭГ по сравнению с Авастином® и Эндостаром®, в соответствии с настоящим изобретением.

[0058] ФИГ. 40 является графическим представлением, иллюстрирующим действие ProAgio-ПЭГ по сравнению с Авастином® и Эндостаром®, в соответствии с настоящим изобретением.

[0059] ФИГ. 41 является графическим представлением, иллюстрирующим действие ProAgio-ПЭГ по сравнению с Авастином® и Эндостаром®, в соответствии с настоящим изобретением.

[0060] ФИГ. 42 является графическим представлением, иллюстрирующим действие ProAgio-ПЭГ на рост опухоли, в соответствии с настоящим изобретением.

[0061] ФИГ. 43 является графическим представлением, иллюстрирующим действие ProAgio-ПЭГ на рост опухоли, в соответствии с настоящим изобретением.

[0062] ФИГ. 44 изображает действие ProAgio-ПЭГ на ткань в соответствии с настоящим изобретением.

[0063] ФИГ. 45 является графическим представлением, иллюстрирующим действие ProAgio-ПЭГ на набор или потерю массы, в соответствии с настоящим изобретением.

[0064] ФИГ. 46 изображает действие ProAgio на печень фиброзных мышей в соответствии с настоящим изобретением.

[0065] ФИГ. 47 изображает действие ProAgio на печень фиброзных мышей в соответствии с настоящим изобретением.

[0066] На ФИГ. 48 представлена таблица, иллюстрирующая действие ProAgio на печень фиброзных мышей, в соответствии с настоящим изобретением.

[0067] На ФИГ. 49 представлена таблица, иллюстрирующая действие ProAgio на печень фиброзных мышей, в соответствии с настоящим изобретением.

[0068] ФИГ. 50 является графическим представлением, иллюстрирующим действие ProAgio на апоптоз первичных человеческих звездчатых клеток печени, в соответствии с настоящим изобретением.

[0069] ФИГ. 51 изображает действие ProAgio на печень фиброзных мышей в соответствии с настоящим изобретением.

[0070] ФИГ. 52 является графическим представлением, иллюстрирующим действие ProAgio на массу тела мышей, в соответствии с настоящим изобретением.

[0071] ФИГ. 53 является графическим представлением, иллюстрирующим действие ProAgio на печень фиброзных мышей, в соответствии с настоящим изобретением.

[0072] ФИГ. 54A и 54B являются графическим представлением, иллюстрирующим действие концентрации ProAgio на фиброз печени.

[0073] На ФИГ. 55A-55D приведены результаты по ProAgio в качестве варианта лечения рака молочной железы.

[0074] На ФИГ. 56 показано, что ProAgio снижает и предотвращает фиброз при раке поджелудочной железы, образуемом твердой клеточной стромой и волокнообразующими клетками.

[0075] На ФИГ. 57A-57C приведены результаты по ProAgio в качестве варианта лечения рака печени.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0076] В данном изобретении предложен антиангиогенный или антифибротический агент и способ ингибирования ангиогенеза, в котором ангиогенное или фиброзное состояние у млекопитающего лечат путем введения млекопитающему антиангиогенного агента, называемого ProAgio, в терапевтически эффективном количестве и с надлежащей частотой, чтобы привести к регрессии или купировать патологическое состояние без существенной токсичности. Ангиогенное состояние может быть выбрано из группы, состоящей из новообразования, включая солидное опухолевое новообразование, включая карциному молочной железы, карциному легкого, карциному простаты, карциному толстой кишки, карциному простаты, карциному яичника, нейробластому, опухоль центральной нервной системы, нейробластому, мультиформную глиобластому или меланому. Хотя этот список может быть неполным, антиангиогенный агент можно применять для достижения регрессии или купирования большинства, если не всех солидных опухолей. Получающим лечение млекопитающим может быть человек.

[0077] Данное изобретение в общем случае относится к полипептиду, который специфически связывает интегрин a_vβ₃. В частности, настоящее изобретение относится к варианту домена 1 белка клеточной адгезии (D1-CD2), который имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 75% сходную с последовательностью D1-CD2 1 дикого типа KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKD TYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQER 106 (SEQ ID №:1). Данное изобретение дополнительно относится к способу применения полипептида в лечении ангиогенеза, клеточной пролиферации, рака и связанных с фиброзом заболеваний и патологических состояний. Данное изобретение также включает выделенный полипептид, который специфически связывается с интегрином α_vβ₃ at βA-домене в области α2-спирали, петли B-C и петли α2-α3. Примером такого полипептида является ProAgio. Типовые последовательности ProAgio включают KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKD TYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVNDVCNFASRQER (SEQ ID №:2) и KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKD TYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKYDYLKIQER (SEQ ID №: 3).

[0078] Раскрытый в данном документе ProAgio включает белок-хозяина и домен 1 белка клеточной адгезии CD2 («D1 CD2»). Мишенью ProAgio является интегрин α_vβ₃ в новом участке, т.е. бороздке в области α2-спирали, петли B-C и петли α2-α3 («βA-бороздки»). βA-бороздка присутствует практически во всех других β-интегринах и находится относительно близко к участку связывания RGD в βA-домене. Таким образом, хотя говорится, что мишенью ProAgio может являться βA-бороздка интегрина α_vβ₃, специалисту в данной области техники следует понимать, что ProAgio можно применять для нацеливания на βA-бороздку любого β-интегрина, содержащего βA-бороздку.

[0079] Один вариант реализации способа предотвращения или снижения избыточного накопления фиброзного материала во внеклеточном матриксе в пораженной или поврежденной ткани субъекта включает определение нуждающегося в этом субъекта и введение субъекту полипептида, который специфически связывается с интегринами α_vβ₃, содержащего: вариант домена 1 белка клеточной адгезии (D1-CD2), имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 75% сходную с последовательностью D1-CD2 дикого типа, при этом полипептид специфически связывается с интегрином α_vβ₃ в βA-домене в области α2-спирали, петли B-C и петли α2-α3. Способ по п. 22, отличающийся тем, что субъект имеет фиброз печени. Субъект может иметь фиброз поджелудочной железы, фиброз печени или фиброз молочной железы.

[0080] Типовые фиброзные заболевания, нарушения и патологические состояния включают, например, склеродермию (включая ограниченную склеродермию, генерализованную склеродермию или лентовидную склеродермию), фиброз почки (включая гломерулосклероз, тубулоинтерстициальный фиброз почки, прогрессирующую почечную недостаточность или диабетическую нефропатию), фиброз сердечной мышцы (например, фиброз миокарда), фиброз легких (например, гломерулосклероз, фиброз легких, идиопатический фиброз легких, силикоз, асбестоз, интерстициальное заболевание легких, интерстициальное фибротическое заболевание легких и индуцированный химиотерапией/облучением фиброз легких), фиброз полости рта, эндомиокардиальный фиброз, фиброз дельтовидной мышцы, панкреатит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, нодулярный фасциит, эозинофильный фасциит, общий фибротический синдром, характеризуемый замещением в разной степени нормальной мышечной ткани фиброзной тканью, ретроперитонеальный фиброз, фиброз печени, цирроз печени, хроническую почечную недостаточность; миелофиброз (фиброз костного мозга), медикаментозный эрготизм, глиобластому при синдроме Ли-Фраумени, спорадическую глиобластому, миелоидный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, миелодиспластический синдром, миелопролиферативный синдром, гинекологический рак, саркому Капоши, болезнь Хансена, коллагенозный колит и острый фиброз. Фиброз может быть хроническим или острым. Фибротические состояния включают наличие избыточного количества фиброзной ткани, включая избыточное количество накопленного внеклеточного матрикса в ткани, образование ткани, которая приводит к дисфункции и, потенциально, к органной недостаточности.

[0081] В данное изобретение включены нетоксические белки, называемые в тексте ProAgio, которые ингибируют рост опухоли и демонстрируют активность в индукции апоптоза ангиогенных эндотелиальных клеток без нацеливания на VEGF/VEGFR или любые другие пути РТК.

[0100] Не ограничиваясь какой-либо одной теорией, подразумевается, что ProAgio с высокой эффективностью специфически индуцирует апоптоз экспрессирующих α_vβ₃ клеток, включая и активируя каспазу 8 в цитоплазматическом домене β₃. Так как связанные с раком панкреатические звездчатые клетки (CAPaSC) и ангиогенные эндотелиальные клетки экспрессируют высокие уровни интегрина α_vβ₃, ProAgio, вероятно, снижает количество CAPaSC и элиминирует новые кровеносные сосуды в опухолях и вокруг опухолей или других тканях.

[0101] ProAgio индуцирует апоптоз, включая или не включая связывание лиганда, а связывание ProAgio не препятствует связыванию RGD, что позволяет предположить, что действие ProAgio не зависит от связывания лиганда. ProAgio индуцирует клеточный апоптоз с помощью интегрина α_vβ₃ посредством механизма, отличного от аноикоза. Таким образом, ProAgio не обязательно конкурирует с сильными взаимодействиями интегрин-лиганд и не должен индуцировать аноикоз, который может не проявляться вследствие адгезии ангиогенных эндотелиальных клеток и ВКМ, включающей взаимодействия между множеством пар интегрина и множеством типов ВКМ.

[0102] Один вариант реализации изобретения включает белки, способные индуцировать апоптоз активированных звездчатых клеток печени и поджелудочной железы и миофибробластов, которые считаются основным источником внеклеточного матрикса в печени и других органах. Звездчатые клетки и миофибробласты восприимчивы к различным факторам роста и цитокинам, присутствующим в печени и других органах, некоторые из которых также приводят к фиброзу печени. Индукция апоптоза звездчатых клеток, стимуляция разрушения матрикса или стимуляция апоптоза звездчатых клеток снижает фиброз печени. В печени активированные звездчатые клетки, дедифференцированные синусоидальные эндотелиальные клетки (LSEC) имеют высокий уровень интегрина α_vβ₃. Действие ProAgio, состоящее в уничтожении дедифференцированных LSEC, снижает портальную гипертензию.

[0103] В структуре пептидов согласно данному изобретению можно осуществлять модификации и изменения и получать молекулы, имеющие сходные характеристики с указанными пептидами (например, консервативные аминокислотные замены). Например, некоторые аминокислоты можно заменять другими аминокислотами в последовательности без значительной потери активности. Так как биологическая функциональность пептида определяется способностью пептида к взаимодействию и его природой, в последовательности пептида можно осуществлять некоторые замены в аминокислотной последовательности и получать при этом пептид со сходными свойствами.

[0104] На ФИГ. 1A-19 изображена разработка ProAgio для связывания βA-бороздки. Хотя описанный в данном документе ProAgio способен связывать βA-бороздку интегрина α_vβ₃, специалисту в данной области техники следует понимать, что ProAgio может связываться с любым интегрином, содержащим βA-бороздку, как описано выше.

[0105] Указанный агент ингибирует или предотвращает ангиогенез путем ингибирования или регулирования апоптоза и фиброза. Разработанные полипептиды продемонстрировали высокую активность в индукции апоптоза эндотелиальных клеток без воздействия на эпителиальные клетки и фибробласты согласно результатам in vitro анализа. Кроме того, разработанные полипептиды не оказывали токсического действия на уже существующие нормальные кровеносные сосуды. Факторы выживания включают факторы роста клеток эндотелия сосудов или митогены, а также факторы, которые не оказывают прямого стимулирующего рост действия, но обеспечивают возможность восстановления клеток после повреждения.

[0106] Эти агенты могут быть включены в способы лечения млекопитающего посредством ингибирования ангиогенеза, которые включают этапы введения антиангиогенных и антифибротических агентов. В определенных вариантах реализации изобретения антиангиогенный или антифибротический полипептид демонстрировал продленное время нахождения в циркуляции по сравнению с низкомолекулярными и короткопептидными агентами.

[0107] В конкретных вариантах реализации изобретения предложены способы ингибирования ангиогенеза или фиброза, а также способы лечения связанных с ангиогенезом или фиброзных заболеваний. В других вариантах реализации в настоящем изобретении предложены способы ингибирования или снижения роста опухоли, а также способы лечения индивида, страдающего от рака. Эти способы включают введение индивиду терапевтически эффективного количества одного или более описанных выше полипептидных терапевтических агентов. В частности, эти способы рассчитаны на терапевтическое и профилактическое лечение животных и, конкретнее, человека.

[0108] Как описано в данном документе, связанные с ангиогенезом или фиброзные заболевания включают, но не ограничиваются этим, ангиогенез-зависимый рак, включая, например, солидные опухоли, кровяные опухоли, такие как лейкозы, и опухолевые метастазы; доброкачественные опухоли, например, гемангиомы, акустические невриномы, нейрофибромы, трахомы и пиогенные гранулемы; воспалительные расстройства, такие как иммунное и неиммунное воспаление; хронический суставной ревматизм и псориаз; ангиогенные заболевания глаз, например, диабетическую ретинопатию, ретинопатию недоношенных, макулярную дегенерацию, отторжение роговичного трансплантата, неоваскулярную глаукому, ретролентальную фиброплазию, рубеоз радужки; синдром Ослера-Веббера; миокардиальный ангиогенез; неоваскуляризацию бляшек; телеангиэктазию; гемофильные соединения; ангиофиброму; и грануляцию ран и лечение ран; псориазную склеродермию с телеангиэктазией, пиогенную гранулему, коронарный колатерал, ангиогенез ишемизированных конечностей, заболевания роговицы, рубеоз, артрит, диабетическую неоваскуляризацию, переломы, васкулогенез, гемопоэз.

[0109] Одним из потенциальных благоприятных эффектов комбинации антиангиогенного или антифибротического агента и химиотерапевтического агента может быть улучшение в лечении и регулировании ангиогенного патологического состояния, вызванное сниженными дозами химиотерапевтического агента. Комбинацию можно вводить в течение длительного периода времени или, необязательно, можно применять меньшую продолжительность лечения благодаря повышенной эффективности комбинации.

[0110] В зависимости от природы комбинированной терапии введение полипептидных терапевтических агентов согласно изобретению можно продолжать во время применения другого вида терапии и/или впоследствии. Введение полипептидных терапевтических агентов можно осуществлять в виде единичной дозы или в виде некоторого количества доз. В некоторых случаях введение полипептидных терапевтических агентов осуществляют по меньшей мере за несколько дней до проведения традиционной терапии, тогда как в других случаях введение начинают непосредственно перед или во время применения традиционной терапии.

[0111] In silico и in situ анализ позволяет определить белки, способные связывать интегрин α_vβ₃. Следует отметить, что βA из β₃ влияет на связывание с лигандами и передачу сигнала интегрина. D1-CD2 человеческого и крысиного происхождения демонстрируют довольно слабую аффинность в отношении известных участков связывания интегрина α_vβ₃. D1-CD2 стыкуется с несколькими участками βA-домена, включая новый участок, т.е. βA-бороздку, в различных ориентациях (показано на ФИГ. 1A-1D). Однако вследствие отсутствия сильных контактов с остатками βA-бороздки, стыковку D1-CD2 с βA-бороздкой усиливали, мутируя остатки в D1-CD2 в контактирующих позициях, чтобы получить лучшее совпадение с соответствующими участками в βA-бороздке. В D1-CD2 вводили дополнительные мутации, чтобы компенсировать потенциальные структурные нарушения со стороны вышеуказанных мутаций и поддержать β-слоевую упаковку. Энергия стыковки этих вариантов D1-CD2 на интегринах была существенно повышена по сравнению с немутированным D1-CD2 (показано на ФИГ. 2). Кроме того, когда соответствующие остатки в интегрине были мутированы, значительно упала энергия связывания, разрушая, таким образом, сконструированные контакты.

[0112] Варианты D1-CD2 экспрессировали в бактериях E. coli и после этого очищали. ProAgio демонстрировал структурные свойства, сходные со свойствами родительского белка D1-CD2, как продемонстрировали результаты анализа Н-ЯМР (показано на ФИГ. 3), дальних УФ-КД и флуоресцентных спектров. Это свидетельствует о надлежащем свертывании ProAgio. Кроме того, анализ связывания biacore продемонстрировал, что ProAgio взаимодействует с интегрином α_vβ₃ с высокой аффинностью. ProAgio также слабо взаимодействует с двумя другими парами интегринов, что позволяет предположить, что ProAgio специфически взаимодействует с интегрином α_vβ₃ (показано на ФИГ. 4A-4C).

[0113] Анализ присоединения клеток с применением культурального планшета, покрытого ProAgio, подтвердил взаимодействие ProAgio/интегрин α_vβ₃. Клетки HUVEC, которые характеризовались высокими уровнями экспрессии α_vβ₃ (показано на ФИГ. 5), прочно присоединялись к покрытым ProAgio планшетам (показано на ФИГ. 6). Клетки CHO и COS-7, которые не экспрессируют α_vβ₃, не присоединялись к покрытым ProAgio планшетам. α_vβ₃ экзогенно экспрессировали в клетках CHO и COS-7 (показано на ФИГ. 7), и проводили с этими клетками вышеуказанный анализ присоединения клеток. Экспрессирующие α_vβ₃ клетки CHO и COS-7 присоединялись к покрытым ProAgio планшетам (показано на ФИГ. 8). Контрольные экспрессирующие интегрин α_vβ₃ клетки СОН не присоединялись к покрытым ProAgio планшетам (показано на ФИГ. 9). Этот анализ присоединения клеток свидетельствует о том, что ProAgio взаимодействует с интегрином α_vβ₃ на поверхности клеток.

[0114] Взаимодействие ProAgio с интегрином дополнительно подтверждали посредством совместной иммунопреципитации ProAgio с интегрином β₃ в экстрактах клеток HUVEC (показано на ФИГ. 10).

[0115] Так как ProAgio связывается с βA-бороздкой, связывание ProAgio не конкурирует со связыванием RGD, так как ProAgio и RGD не связываются с одним и тем же участком. Проводили анализ присоединения, в котором клетки HUVEC инкубировали с RGD, а после этого оценивали в отношении присоединения ProAgio. Этот эксперимент свидетельствует о связывании RGD и ProAgio с клетками HUVEC без несоответствия (показано на ФИГ. 11).

[0116] Химическое перекрестное связывание с применением бис(сульфосукцинимидил)-глутарата (BS2G) (показано на ФИГ. 12) в качестве перекрестно-сшивающего агента свидетельствует о том, что ProAgio связывается с участком βA-бороздки. Такое перекрестное связывание с последующим расщеплением трипсином и анализом ЖХ-СМ указывает, что WEKTSDKK ProAgio (aк 35-43) перекрестно связывается с интегрином в TEMKQER (aк 116-122) (показано на ФИГ. 13A-13C). Взаимодействие ProAgio и интегрина β₃ не было выявлено с помощью BS2G вследствие стерического несоответствия, т.е. из-за общего объема перекрестно-сшивающей реакционной группы.

[0117] Вместо этого повторно проводили перекрестное связывание с применением глутаральдегида (показано на ФИГ. 14) в качестве перекрестно-сшивающего агента. NLKVII ProAgio (aк 99-105) перекрестно связывается с FNEEVKKQ интегрина β₃ (aк 203-210) с помощью глутаральдегида (показано на ФИГ. 15A-15B). Это также продемонстрировало, что ProAgio [106] взаимодействует с интегринами α_vβ₃ в участке βA-бороздки.

[0118] Связывание ProAgio с βA-бороздкой дополнительно подтверждали с помощью мутационного анализа. Мутации интегрина β₃ в контактах Q158A, K233A и K234A снижали присоединение экспрессирующих мутантный интегрин клеток к ProAgio (показано на ФИГ. 16). Компьютерное моделирование продемонстрировало, что мутации ослабляют стыковку ProAgio/интегрины α_vβ₃. Мутации также снижали присоединение экспрессирующих мутантов клеток СНО (показано на ФИГ. 17) к ProAgio (показано на ФИГ. 18) и уменьшали совместную иммунопреципитацию ProAgio и интегрина β₃ (показано на ФИГ. 19).

[0119] На ФИГ. 20-30 показано действие ProAgio на клеточный апоптоз посредством стимуляции включения и активации каспазы 8 в цитоплазматический домен интегрина β₃. Анализировали образование стресс-волокон актиновых филаментов и комплекса фокальной адгезии клеток HUVEC в присутствии и отсутствие ProAgio, чтобы определить действие обработки ProAgio на активность интегрина. Количество стресс-волокон актиновых филаментов снижалось и они исчезали после обработки клеток HUVEC ProAgio (показано на ФИГ. 20). Также уменьшалось накопление винкулина в кончиках стресс-волокон после обработки клеток HUVEC ProAgio (не показано). Это свидетельствует о диссоциации комплекса фокальной адгезии.

[0120] Кроме того, обработка ProAgio инактивирует киназу фокальной адгезии («КФА»), которая активируется при присоединении к ВКМ (показано на ФИГ. 21). Таким образом, ProAgio прекращает функционирование интегрина в эндотелиальных клетках.

[0121] ProAgio также индуцирует апоптоз клеток HUVEC. В частности, ProAgio индуцирует апоптоз клеток HUVEC с EC50 около 1,4 мкM при 10-часовой обработке (показано на ФИГ. 22).

[0122] ProAgio дополнительно сравнивали с несколькими антиангиогенными агентами, используя клетки HUVEC; антиангиогенными агентами были Авастин®, Эндостар® (производное эндостатина, одобренное для лечения рака легкого в Китае), LM609® (моноклональное антитело, нацеленное на лиганд-связывающий участок интегрина α_vβ₃) и Циленгитид® (пептидомиметик на основе RGD). ProAgio был более эффективным в отношении индукции апоптоза, чем другие антиангиогенные агенты (показано на ФИГ. 23).

[0123] Проводили дополнительные исследования, чтобы определить, зависит ли действие ProAgio на апоптоз от интегрина α_vβ₃. Аналогичный анализ апоптоза проводили для нескольких клеточных линий, а именно, HUVEC, PC-3, HEK и COS-7 с или без экзогенной экспрессии интегрина α_vβ₃. Клетки HUVEC экспрессируют высокие уровни α_vβ₃, клетки PC-3 экспрессируют незначительные уровни α_vβ₃, клетки HEK экспрессируют α_v, но не β₃, а клетки COS-7 не экспрессируют α_vβ₃. ProAgio не индуцирует апоптоз в присутствии клеток PC-3, COS-7 или HEK. Однако ProAgio индуцирует апоптоз клеток HUVEC и COS-7 с экзогенной экспрессией интегрина α_vβ₃ (показано на ФИГ. 24 и 25). Апоптоз также наблюдали, когда клетки PC-3 обрабатывали высокой концентрацией ProAgio, т.е. > 30 мкM (не показано). Следовательно, действие ProAgio на индукцию апоптоза зависит от α_vβ₃.

[0124] Чтобы проверит антиангиогенную активность, проводили анализ образования эндотелиальной трубки с применением клеток HUVEC. ProAgio практически полностью разрушал эндотелиальную трубку.

[0125] В отличие от действия Циленгитида и других нацеленных на интегрин молекул, обработка ProAgio не приводит к всплыванию/отсоединению клеток HUVEC (показано на ФИГ. 26), что указывает на то, что ProAgio индуцирует апоптоз посредством механизма, отличного от аноикоза.

[0126] Активация различных каспаз в клетках HUVEC после обработки ProAgio свидетельствует о молекулярном механизме, посредством которого ProAgio индуцирует апоптоз эндотелиальных клеток. Происходила сильная активация каспазы 3 и каспазы 9, и также активировались каспаза 7 и каспаза 3 (показано на ФИГ. 27).

[0127] Также исследовали зависимость индукции апоптоза со стороны ProAgio от активации инициации каспазы 8 и/или каспазы 9. Использовали ингибиторы каспазы 8 и каспазы 9. Ингибитор каспазы 9 не препятствовал действию ProAgio на индукцию апоптоза, тогда как ингибитор каспазы 8 сильно снижал действие ProAgio (показано на ФИГ. 28). С другой стороны, ингибитор каспазы 9 не препятствовал активации каспазы 8, тогда как активация каспазы 9 сильно ингибировалась ингибитором каспазы 8 (показано на ФИГ. 29), что позволяет предположить, что активация каспазы 8 опосредует действие ProAgio на индукцию апоптоза.

[0128] Нелигированный интегрин β₃ может приводить к клеточному апоптозу посредством прямого включения каспазы 8 в свой цитоплазматический домен с помощью механизма, известного как интегрин-опосредованная гибель («ИОГ»). ProAgio может индуцировать апоптоз эндотелиальных клеток механизмом, сходным с ИОГ, в то же время отличается от других антагонистов интегрина. С помощью совместной иммунопреципитации исследовали, приводит ли обработка ProAgio к прямому включению и активации каспазы 8 в цитозольный участок интегрина β₃. Проводили совместную иммунопреципитацию каспазы 8 с интегрином β₃ после обработки ProAgio. Контрольная каспаза 8 не демонстрировала совместную иммунопреципитацию с интегрином β₃ без обработки ProAgio. Циленгитид не приводил к включению каспазы 8 в цитоплазматический домен интегрина β₃ в тех же условиях (показано на ФИГ. 30).

[0129] На ФИГ. 31-43 показана эффективность ProAgio в ингибировании роста опухоли и снижении количества опухолевых кровеносных сосудов. ProAgio ПЭГилировали полиэтиленгликолем, используя ПЭГ массой 20 кДа, молекулу с линейной цепью ПЭГ («ProAgio-ПЭГ»), во внесенном остатке Cys (показано на ФИГ. 31). Мутацию Cys вводили в участок, не вовлеченный в контакт с интегрином. In vitro исследование с клетками HUVEC свидетельствует о том, что ПЭГилирование ProAgio не приводит к значительному снижению активности.

[0130] Создавали ксенографтную модель клеток PC-3. Мышам, несущим опухоль, в.в. вводили различные дозы ProAgio-ПЭГ и ПЭГилированного D1-CD2 или буферный солевой раствор в течение 20 дней по одной дозе через день. Эту обработку начинали на пятый день после инокуляции опухоли. ProAgio-ПЭГ ингибировал рост опухоли в группах, получавших дозы по 10 и 20 мг/кг (при этом две или одна опухоли полностью исчезали в группах с дозами в 20 и 10 мг/кг соответственно), тогда как у мышей, обрабатываемых буфером или ПЭГилированным D1-CD2 опухоли росли с нормальной скоростью.

[0131] Действие ProAgio-ПЭГ на ингибирование роста опухоли зависит от дозировки. При этом зависимость от дозировки менее выражена при дозах более 10 мг/кг (показано на ФИГ. 32 и 33).

[0132] ProAgio-ПЭГ также эффективен при введении на поздней стадии роста опухоли (показано на ФИГ. 34 и 35).

[0133] Проводили иммуноокрашивание CD31, эндотелиальным маркером, применяя срезы тканей, полученных из собранных опухолей, чтобы проанализировать действие обработки ProAgio-ПЭГ на опухолевые сосуды (показано на ФИГ. 36). ProAgio снижал плотность, количество точек разветвления и длину кровеносных сосудов (показано на ФИГ. 37).

[0134] Подразумевается, что антиангиогенный агент можно применять с противораковыми дополнительными усиливающими агентами, включая следующие дополнительные усиливающие агенты: противораковые дополнительные усиливающие агенты: трициклические антидепрессанты (например, имипрамин, дезипрамин, амитриптилин, кломипрамин, тримипрамин, доксепин, нортриптилин, протриптилин, амоксапин и мапротилин); нетрициклические антидепрессанты (например, сертралин, тразодон и циталопрам); антагонисты Ca.sup.++ (например, верапамил, нифедипин, нитрендипин и кароверин); ингибиторы кальмодулина (например, прениламин, трифтазин и кломипрамин); амфотерицин B; аналоги трипаранола (например, тамоксифен); антиаритмические препараты (например, хинидин); антигипертензивные препараты (например, резерпин); вещества, снижающие количество тиола (например, бутионин и сульфоксимин), и агенты, снижающие множественную лекарственную устойчивость, такие как кремафор EL. Соединения согласно изобретению также можно вводить с цитокинами, такими как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Другие многочисленные соединения, которые попадают в эту категорию агентов, можно применять в комбинации с антифибротическим агентом.

[0135] Один вариант реализации изобретения также включает набор для лечения ангиогенного патологического состояния у млекопитающего, содержащий антиангиогенный агент и химиотерапевтический агент. Предложена комбинация агентов, обеспечивающая введение в количестве и с частотой, которые терапевтически эффективны для ингибирования или регрессии ангиогенеза. В определенных вариантах реализации изобретения антифибротический агент и/или полинуклеотиды вводят одни или в комбинации с противовоспалительным агентом. Противовоспалительные агенты, которые можно вводить с антиангиогенными агентами согласно изобретению, включают, но не ограничиваются этим, кортикостероиды (например, бетаметазон, будесонид, кортизон, дексаметазон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон и триамцинолон), нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты (например, диклофенак, дифлунисал, этодолак, фенопрофен, флоктафенин, флурбипрофен, ибупрофен, индометацин, кетопрофен, меклофенамат, мефенамовую кислоту, мелоксикам, набуметон, напроксен, оксапрозин, фенилбутазон, пироксикам, сулиндак, теноксикам, тиапрофеновую кислоту и толметин), а также антигистаминные средства, производные аминоарилкарбоновой кислоты, производные арилуксусной кислоты, производные арилмасляной кислоты, арилкарбоновые кислоты, производные арилпропионовой кислоты, пиразолы, пиразолоны, производные салициловой кислоты, тиазинкарбоксамиды, е-ацетамидокапроновую кислоту, S-аденозилметионин, 3-амино-4-гидроксимасляную кислоту, амиксетрин, бендазак, бензидамин, буколом, дифенпирамид, дитазол, эморфазон, гваязулен, набуметон, нимесулид, орготеин, оксацепрол, паранилин, перизоксал, пифоксим, проквазон, проксазол и тенидап.

[0136] Фармацевтические агенты включают следующие категории и конкретные примеры. Подразумевается, что категория не ограничена конкретными примерами. Специалисты в данной области техники смогут легко определить те фармацевтические агенты, действие которых происходит за пределами центральной нервной системы. Множество других соединений, которые попадают в эту категорию, можно применять в соответствии с изобретением.

[0137] В некоторых вариантах реализации изобретения может возникать необходимость в повышении растворимости и времени нахождения в системе кровообращения антиангиогенного агента. Чтобы повысить растворимость и время нахождения полипептида в системе кровообращения, можно использовать полиэтиленгликоль для дериватизации полипептидов согласно изобретению, включая, например, поли(этиленгликоль) (ПЭГ), поли(винилпирролидон), полиоксомеры, полисорбат и поли(виниловый спирт), в частности, предпочтительно применение полимеров ПЭГ. Полимеры ПЭГ представляют собой полимеры ПЭГ с молекулярной массой от около 100 до около 40000. Другие подходящие гидрофильные полимеры в дополнение перечисленным выше очевидны для специалиста в данной области техники на основании настоящего изобретения. В общем случае применяемые полимеры могут включать полимеры, которые можно присоединять к полипептидам согласно изобретению с помощью реакций алкилирования или ацилирования. В одном примере антиангиогенный агент ПЭГилировали с помощью ПЭГ-цепи массой 20 кДа.

[0138] Молекулы полиэтиленгликоля (или других химических компонентов) следует присоединять к полипептиду с учетом их влияния на функциональные или антигенные домены полипептида. Специалистам в данной области техники известно большое количество способов присоединения. Например, полиэтиленгликоль может быть ковалентно связан посредством аминокислотных остатков с помощью реактивной группы, такой как свободная амино- или карбоксильная группа. Реактивные группы представляют собой группы, с которыми может быть связана активированная молекула полиэтиленгликоля. Аминокислотные остатки, содержащие свободную аминогруппу, могут включать остатки лизина и N-концевые аминокислотные остатки; остатки, содержащие свободную карбоксильную группу, могут включать остатки аспарагиновой кислоты, остатки глутаминовой кислоты и C-концевые аминокислотные остатки. Также в качестве реактивной группы для присоединения молекул полиэтиленгликоля можно использовать сульфгидрильные группы. Предпочтительным для терапевтических целей является присоединение в аминогруппе, например, присоединение в N-конце или в группе лизина. Может возникать необходимость в полипептидах, химически модифицированных в N-конце. Используя полиэтиленгликоль в качестве иллюстрации представленной композиции, можно выбирать из множества молекул полиэтиленгликоля (по молекулярной массе, разветвленности и т.д.), соотношений молекул полиэтиленгликоля и молекул полипептида (полипептида) в реакционной смеси, типов проводимых реакций пэгилирования и способов получения выбранного пэгилированного в N-конце полипептида. При подходящих условиях реакции можно достичь в значительной степени избирательной дериватизации полипептида в N-конце карбонильной группой, содержащей полимер.

[0139] Доступно множество путей введения. Конкретный выбранный режим может зависеть от антиангиогенного агента, конкретного патологического состояния, лечение которого проводят, и дозировки, необходимой для эффективности. Эти способы можно реализовать на практике, используя любой режим введения, который является приемлемым с медицинской точки зрения, то есть, любой режим, который приводит к эффективным уровням иммунного ответа, не вызывая клинически неприемлемых вредных явлений. Определенные режимы введения представлены парентеральным путем.

[0140] В некоторых конкретных вариантах реализации изобретения также предложены фармацевтические композиции. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество активного компонента (например, антиангиогенный агент, антиангиогенный агент плюс химиотерапевтический агент или антиангиогенный агент плюс противовоспалительный агент) и фармацевтически приемлемый носитель. Такие фармацевтические носители могут быть жидкостями, такими как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно, носитель представляет собой воду. Также в качестве жидких носителей можно использовать солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, в частности, для инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиции в случае необходимости также могут содержать незначительные количества смачивающих или эмульсифицирующих агентов, или рН-буферных агентов. Эти композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и тому подобного. Композиция может быть получена в виде суппозитория с традиционными связующими веществами и носителями, такими как триглицериды. Пероральный состав может содержать стандартные носители, такие как имеющие фармацевтическую степень очистки манит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.д. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество антиангиогенного агента вместе с подходящим количеством носителя, обеспечивающие форму для надлежащего введения пациенту. Состав должен соответствовать режиму введения.

[0141] В частности, перед применением на людях агент или фармацевтические композиции можно исследовать in vitro, а затем in vivo в отношении желаемой терапевтической или профилактической активности. Например, in vitro методы анализа для демонстрации терапевтической или профилактической пригодности соединения или фармацевтической композиции включают изучение действия соединения на линию клеток или образец ткани пациента. Действие соединения или композиции на линию клеток и/или образец ткани можно определить, используя методы, известные специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, анализ розеткообразования и анализ клеточного лизиса. В соответствии с изобретением in vitro методы анализа, которые можно применять для определения того, требуется ли введение конкретного соединения, включают in vitro анализ клеточных культур, в котором образец ткани пациента выращивают в культуре и подвергают воздействию или каким-либо другим образом обрабатывают соединением, и наблюдают действие такого соединения на образец ткани.

[0142] Конкретные варианты реализации лечения и/или предотвращения, полностью или частично, различных заболеваний, нарушений и патологических состояний, включая, например, способы лечения субъекта, имеющего или вероятно имеющего, или предрасположенного, или подверженного риску развития фиброза и различных фиброзных заболеваний, нарушений и патологических состояний, характеризуемых в целом или частично наличием (1) фиброзного материала, (2) избыточной выработкой фиброзного материала во внеклеточном матриксе и/или (3) замещением элементов нормальной ткани аномальными, нефункциональными и/или накопленными в избыточном количестве компонентами матрикса, включают введение композиции, содержащей полипептид, который специфически связывается с интегрином α_vβ₃ в области α2-спирали, петли B-C и петли α2-α3.

[0143] Подразумевается, что антиангиогенный агент можно получить в соответствии с обычными процедурами в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения человеку. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. В случае необходимости композиция также может содержать солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции. В общем случае ингредиенты поставляются отдельно или смешиваются вместе в единичной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата, в герметически запечатанном контейнере, таком как ампула или саше, с указанным количеством активного ингредиента. Если композиция предназначена для введения путем инфузии, она может быть разведена в инфузионной бутылке, содержащей фармацевтической степени очистки воду или солевой раствор. Если композицию вводят путем инъекции, может предоставляться ампула со стерильной водой для инъекций или солевым раствором так, чтобы смешать ингредиенты перед введением.

[0144] Известны различные системы доставки, которые можно использовать для введения соединения согласно изобретению, например, инкапсулирование в липосомах, микрочастицах, микрокапсулах, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать соединение, рецепторопосредованный эндоцитоз, конструирование нуклеиновой кислоты в виде части ретровирусного или другого вектора и т.д. Способы введения включают, но не ограничиваются этим, интрадермальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный пути. Соединения или композиции можно вводить любым удобным путем, например, посредством инфузии или болюсной инъекции, посредством всасывания через эпителиальную или слизисто-кожную выстилку (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.), и можно вводить вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или местным. Кроме того, может возникать необходимость введения фармацевтических соединений или композиций согласно изобретению в центральную нервную систему любым подходящим путем, включая интравентрикулярную и интратекальную инъекцию; интравентрикулярную инъекцию может облегчить интравентрикулярный катетер.

[0145] В конкретном варианте реализации изобретения может возникать необходимость местного введения антиангиогенного агента в область, нуждающуюся в лечении. Это можно осуществить, например и без ограничений, посредством местной инфузии во время хирургического вмешательства, местного применения, например, в сочетании с перевязкой раны после хирургического вмешательства, посредством инъекции, посредством применения катетера, посредством суппозитория или посредством имплантата, состоящего из пористого, непористого или гелеобразного материала, включая мембраны, такие как силастиковые мембраны, или волокна. При применении полипептида следует позаботиться о том, чтобы использовать материалы, в которые полипептид не абсорбируется.

[0146] В конкретном варианте реализации изобретения, в котором антиангиогенный агент представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, нуклеиновую кислоту можно вводить in vivo, чтобы стимулировать экспрессию кодируемого ею полипептида, путем конструирования ее в виде части подходящего нуклеотидного экспрессионного вектора и введения так, чтобы она стала внутриклеточной, например, путем использования ретровирусного вектора, или путем прямой инъекции, или путем бомбардировки микрочастицами, или путем покрытия липидами или рецепторами клеточной поверхности или трансфицирующими агентами, или путем введении в сочетании с гомеобокс-подобным пептидом, который может проникать в ядро, и т.д. В альтернативном варианте нуклеиновую кислоту можно вводить внутриклеточно и включать в ДНК клетки-хозяина для экспрессии путем гомологичной рекомбинации

[0147] Другие варианты реализации изобретения относятся к векторам, содержащим полинуклеотид, кодирующий антиангиогенный агент, клеткам-хозяевам и получению антиангиогенного агента синтетическими и рекомбинантными методами. Вектор может представлять собой, например, фаговый, плазмидный, вирусный или ретровирусный вектор. Ретровирусные векторы могут быть компетентными по репликации или дефективными по репликации. В последнем случае размножение вируса будет происходить только в дополняющих клетках-хозяевах. Полинуклеотиды, кодирующие антиангиогенный агент, могут быть присоединены к вектору, содержащему селективный маркер, для размножения в организме-хозяине. В общем случае плазмидный вектор вносят в преципитат, такой как преципитат фосфата кальция, или в комплексе с заряженным липидом. Полинуклеотидная вставка должна быть функционально связана с соответствующим промотором, таким как, например, промотор фага лямбда PL, промоторы E. coli lac, trp, phoA и tac, ранний и поздний промоторы SV40 и промоторы ретровирусных ДКП. Другие подходящие промоторы известны специалисту в данной области техники. Экспрессионные конструкции дополнительно содержат участки инициации и терминации транскрипции и, в транскрибируемой области, участок связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть транскриптов, экспрессируемых конструкциями, предпочтительно содержит кодон инициации трансляции в начале и кодон терминации трансляции (UAA, UGA или UAG), соответствующим образом расположенный в конце предназначенного для трансляции полипептида. Как указано, экспрессионные векторы предпочтительно содержат по меньшей мере один селективный маркер.

[0148] Подразумевается, что регуляторные гены и последовательности можно применять для экспрессии и репликации антиангиогенного агента. Природа регуляторных последовательностей для генной экспрессии может варьироваться для разных видов или типов клеток, но в общем случае они должны содержать, при необходимости, 5' нетранскрибируемые и 5' нетранслируемые последовательности, вовлеченные в инициацию транскрипции и трансляции соответственно, такие как TATA-бокс, кэпирующая последовательность, последовательность CAAT и тому подобные. Промоторы могут быть конститутивными или индуцибельными. Регуляторные последовательности также могут содержать энхансерные последовательности или вышерасположенные активаторные последовательности в случае необходимости.

[0149] В одном варианте реализации изобретения полинуклеотиды, кодирующие антиангиогенный агент, могут быть слиты с полинуклеотидами, кодирующими сигнальные последовательности, которые будут управлять локализацией полипептидов в определенных компартментах прокариотической или эукариотической клетки и/или управлять секрецией полипептида. Например, в E. coli может возникнуть необходимость направить экспрессию белка в периплазматическое пространство. Для конструирования слитых белков, которые будут управлять локализацией белка, существует несколько коммерчески доступных векторов.

[0150] В одном конкретном варианте реализации изобретения предложены стенты, имеющие общую трубчатую структуру (которая включает, например, спиральные формы), поверхность которых покрыта описанным выше антиангиогенным агентом. Стент может представлять собой поддерживающую конструкцию, обычно цилиндрической формы, которую можно вставлять в канал организма (например, желчные протоки) или часть канала организма, которая была сужена, имеет неправильную форму, закупорена или перекрыта в процессе заболевания (например, вследствие врастания опухоли), с целью предотвращения закрытия или повторного закрытия канала.

[0151] В одном конкретном варианте реализации изобретения предложено применение антиангиогенного агента в широком спектре хирургических процедур. Например, в одном аспекте настоящего изобретения антиангиогенный белок (например, в форме спрея или пленки) можно использовать для покрытия или обрызгивания участка перед удалением опухоли, чтобы изолировать нормальные окружающие ткани от злокачественной ткани и/или предотвратить распространение заболевания на окружающие ткани. В других аспектах настоящего изобретения хирургические сетки, которые были покрыты антиангиогенным белком, можно использовать в любой процедуре, в которой может применяться хирургическая сетка.

[0152] Нижеприведенные примеры приведены для облегчения понимания изобретения, но не предназначены и не должны восприниматься как ограничивающие объем изобретения каким-либо образом.

ПРИМЕРЫ

[0153] Проводили эксперименты, чтобы сравнить действие ProAgio-ПЭГ и Авастина® и ProAgio-ПЭГ и Эндостара® с применением ксенотрансплантатов PC-3. ProAgio-ПЭГ был более эффективным в ингибировании роста опухоли по сравнению с Авастином® и Эндостаром® (показано на ФИГ. 38-41).

[0154] Кроме того, обработка ProAgio-ПЭГ приводит к большей степени снижения количества сосудов, чем обработка ® Авастином® и Эндостаром® (не показано).

[0155] На ангиогенез опухоли в общем случае влияет микроокружение, окружающее опухоль. Соответственно, проводили ортотопическое моделирование с иммуносовместимыми мышами. В частности, проводили эксперименты с клетками молочной железы мышей 4T-1, используя мышей Balb/c. Мышей, несущих опухоли, обрабатывали в одном режиме дозирования ProAgio-ПЭГ или D1-CD2-ПЭГ. Обработку начинали на пятый день после инокуляции опухоли. Существует значительная разница в росте опухолей между обработанной ProAgio-ПЭГ группой и обработанной буфером группой (показано на ФИГ. 42 и 43), что указывает на то, что ProAgio эффективен в ингибировании роста опухоли в случае ортотопической модели.

[0156] ФИГ. 44 и 45 демонстрируют нетоксичность ProAgio для нормальных тканей и органов. Хороший антиангиогенный агент должен обладать минимальной токсичностью для существующих кровеносных сосудов в нормальных тканях/органах. Чтобы оценить это свойство ProAgio, готовили срезы ткани из печени, легких, сердца и почек мышей, обработанных разными агентами. Срезы тканей анализировали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином («ГиЭ») и иммуноокрашивания. Окрашивание ГиЭ выявило, что ProAgio не приводит к очевидным аномалиям и повреждениям в анатомической структуре ткани, например, поражениям/некрозу (показано на ФИГ. 44). Иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью анти-CD31 антитела свидетельствует о том, что ProAgio-ПЭГ разрушает или снижает количество кровеносных сосудов в печени, легких, сердце или почках в меньшей степени, чем ПЭГилированный D1-CD2 или буферный солевой раствор (показано на ФИГ. 44). Кроме того, ProAgio не приводит к аномальному набору или потере массы (показано на ФИГ. 45).

[0157] Чтобы дополнительно проанализировать токсичность ProAgio, здоровым мышам CD-I в.в. вводили три дозы по 60 мг/кг ProAgio-ПЭГ в течение 48 часов. Мышей наблюдали в течение 14 дней. Все мыши вели себя нормально. Брали образцы крови и мочи. Через 48 часов после введения агентов исследовали уровни АСТ/АЛТ, TnT, креатинина в плазме и альбумина в моче. Исследования показали, что ProAgio-ПЭГ в таких дозах не приводит к повреждению печени, почек или сердца мышей (не показано).

[0158] На ФИГ. 46-50 изображено лечение фиброзных заболеваний и других заболеваний с помощью ProAgio. В частности, на ФИГ. 46-48 показано действие ProAgio на мышей с фиброзом печени (мыши Balb/c). Фиброз печени индуцировали в течение шести недель, используя две дозы по 250 мг/кг в неделю плюс 10% спирт, добавляемые в питьевую воду для мышей. Непосредственно после индукции фиброза мышам десять раз в.б. вводили ProAgio (10 мг/кг) или буфер. Первые четыре дозы вводили ежедневно, а последующие шесть доз вводили через день. На ФИГ. 46 изображены обработанные печени мышей с фиброзом. На ФИГ. 47 приведены увеличенные изображения обработанных печеней мышей с фиброзом. На ФИГ. 48 приведена масса печени обработанных спиртом и буфером или спиртом и ProAgio мышей. СО представляет собой стандартное отклонение, а значение β рассчитывали, используя непарный двусторонний t-критерий. Важно отметить, что размер и масса печени в обработанной ProAgio группе были меньше (≈35%-45% в среднем), чем в обработанной буфером группе.

[0159] На ФИГ. 49 приведены уровни TIMP1 (нг/г образца печени) в печеночных экстрактах, полученных из печеней мышей, обработанных спиртом и буфером или спиртом и ProAgio. Уровни TIMP1 в печеночных экстрактах обработанной ProAgio группы были в около 5 раз меньше, чем в обработанной буфером группе. Кроме того, уровни MMP2 в печеночных экстрактах обработанной ProAgio группы на около 30% превышали уровни в обработанной буфером группе (не показано). СО представляет собой стандартное отклонение, а значение β рассчитывали, используя непарный двусторонний t-критерий.

[0160] В проиллюстрированном эксперименте фиброз печени индуцировали путем применения обработки 250 мг/кг 10% спирта во время кормления дважды в неделю в течение одиннадцати недель. После этого в.б. вводили 10 мг/кг ProAgio или буферного солевого раствора. Первые три дозы вводили ежедневно, а последующие семь доз вводили через день, начиная с двенадцатой недели после первой обработки во время кормления. В обработанной буфером группе умерло четыре мыши, и ни одна мышь не умерла в обработанной ProAgio группе. Размер и масса печени в обработанной ProAgio группе были меньше (≈50%-60% в среднем), чем в обработанной буфером группе.

[0161] В другом проиллюстрированном эксперименте определяли уровни TIMP1 и MMP2. Уровни TIMP1 в печеночных экстрактах обработанной ProAgio группы были в около 7 раз меньше, чем в обработанной буфером группе. Кроме того, уровни MMP2 в печеночных экстрактах обработанной ProAgio группы на около 25% превышали уровни в обработанной буфером группе.

[0162] Также проводили клеточный эксперимент. Основной причиной фиброза печени является активация звездчатых клеток печени. На ФИГ. 50 показано действие ProAgio на апоптоз первичных человеческих звездчатых клеток печени («hHSC»). hHSC активировали путем культивирования в непокрытых пластиковых культуральных планшетах в течение 8 дней. Инактивированные hHSC представляли собой клетки в первый день культивирования. Инактивированные или активированные hHSC обрабатывали 5 мкм ProAgio (закрашенные столбики) или буфером (пустые столбики). Апоптоз определяли с помощью набора для определения апоптоза и представляли в виде % апоптоза, определяя инактивированные клетки без какой-либо обработки как 0%. Обработка активированных и инактивированных hHSC ProAgio показала, что ProAgio эффективно приводит к апоптозу активированных hHSC, тогда как ProAgio не оказывает действие на инактивированные hHSC. Планки погрешностей отображают стандартное отклонение по пяти независимым экспериментам.

[0163] На ФИГ. 51-53 изображен эксперимент, демонстрирующий действие ProAgio на мышей с фиброзом печени. Фиброз печени индуцировали путем применения обработки 250 мг/кг TAA+10% спирт во время кормления дважды в неделю в течение двенадцати недель. После этого применяли в.б. обработку. Первые три дозы обработки вводили ежедневно, а последующие 6 доз обработки вводили через день. Три группы обработки включали применение 10 мг/кг ProAgio (8 мышей на группу), 20 мг/кг Эсбриета® (недавно одобренный лекарственный препарат для лечения фиброза легких) (8 мышей на группу) и буферного солевого раствора (8 мышей на группу). Одна мышь в буферной группе и одна мышь в группе Эсбриета® умерли.

[0164] На ФИГ. 54A-54B показано действие ProAgio на фиброзную печень. Считается, что звездчатые клетки являются основным источником внеклеточного матрикса в печени. На ФИГ. 54A показано действие на ток крови в фиброзной печени после обработки ProAgio. Мышей с фиброзом печени обрабатывали указанными агентами. Ток крови через воротную вену определяли с помощью допплерографии и представляли в виде мм3 в секунду. Контролем служило измерение для мыши без индуцированного фиброза. Планки погрешностей отображают стандартное отклонение для измерений для шести мышей. На ФИГ. 54B показан апоптоз активированных синусоидальных эндотелиальных клеток печени (LSEC), индуцированный ProAgio. Первичные человеческие LSEC активировали в культуре без VEGF. Активированные LSEC обрабатывали ProAgio в указанной концентрации в течение 10 часов. Контролем служили LSEC без активации. Апоптоз представлен в виде % апоптоза. Планки погрешностей отображают стандартное отклонение по пяти независимым экспериментам. ProAgio не только снижал фиброз, но также нормализовал сосуды печени.

[0165] На ФИГ. 55A-55D приведены результаты по ProAgio в качестве лечения рака молочной железы. Рак молочной железы мышей 4T-1 (хорошо известная модель рака молочной железы) обрабатывали 10 мг/кг ProAgio в количестве 10 доз. На ФИГ. 55A показан размер опухоли в конечный момент времени (одна опухоль была исключена вследствие превышения размера и предварительного завершения эксперимента согласно нормам IACUC). На ФИГ.55B приведены типовые изображения окрашивания сириусом красным (коллаген) и α-ГМА, отображающие уровни окрашивания миофибробластов в срезах ткани из опухолей. На ФИГ. 55C приведен количественный анализ окрашивания красителем сириусом красным или красителем, который представлен в виде процентной доли окрашенных участков в каждом поле зрения. На ФИГ. 55D приведен другой количественный анализ α-ГМА, который представлен в виде количества пикселей положительно окрашенных участков в каждом поле зрения. Планки погрешностей на (C) и (D) отображают стандартное отклонение для измерений для пяти мышей.

[0166] На ФИГ. 56 показано, что ProAgio снижает и предотвращает фиброз при раке поджелудочной железы, который образован раковой стромой и волокнообразующими клетками. При раке поджелудочной железы активированные волокнообразующие клетки или звездчатые клетки поджелудочной железы имеют высокие уровни интегрина альфа v бета 3. В секции А показан рост ксенографитынх опухолей MIA-Paca-2, имплантированных совместно с PaSC, в условиях обработки указанными агентами, который отслеживали, измеряя объем опухолей каждые четыре дня. PaSC выделяли из поджелудочной железы мышей и иммортализовали с помощью коммерческого набора hTERT. Обработку начинали, когда опухоли в среднем достигали размера 250 мм³. В секциях B, C и D приведен количественный анализ длины, плотности и количества точек разветвления сосудов в срезах опухолевой ткани для окрашивания CD31 в секции B, окрашивания сириусом красным в секции C и окрашивания в секции D. В секции С содержание коллагена представлено в виде % окрашенных коллагеном участков. В секции D положительное окрашивание α-ГМА представлено в виде количества положительных пикселей в поле зрения. Контролями на (C) и (D) служат результаты количественной оценки срезов нераковой ткани поджелудочной железы. Планки погрешностей на (A), (C) и (D) отображают стандартное отклонение для экспериментальных измерений для шести мышей. Р-значения рассчитывали, используя непарный двусторонний t-критерий Стьюдента. На (C) и (D) * означает Р < 0,05, ** означает P < 0,01, а *** означает P < 0,001. Изображения на (C) и (D) являются репрезентативными для указанных групп обработки.

[0167] На ФИГ. 57A, ФИГ. 57B и ФИГ. 57C показано, что ProAgio снижает и предотвращает фиброз при раке печени. На этих фигурах показано, что ProAgio снижает и предотвращает фиброз при раке печени и приводит к снижению объема опухоли печени. При раке печени активированные волокнообразующие клетки или звездчатые клетки печени имеют высокие уровни экспрессии интегрина альфа v бета 3. На ФИГ. 57A и 57B показано действие ProAgio на ксенотрансплантаты рака печени. Эти эксперименты проводили на ксенотрансплантатах опухоли HepG (шесть бестимусных мышей/группу), а опухоль начиналась с 1×107 клеток только HepG или половина на половину клеток HepG+LX-2. При обработке одной дозой (в.б.) в 10 мг/кг каждые два дня в течение 20 дней и примерно через 18 дней после инокуляции опухоли объем опухоли уменьшался с помощью ProAgio. Эти клетки (как миофибробласты в других типах опухолей) поддерживают раковые клетки в опухоли, поэтому их апоптоз приводит к уменьшению массы опухолей. Оценивали содержание коллагена и представляли в виде % окрашенных коллагеном участков. Количественное измерение проводили вручную в 319,8 X 319,8 мм2 поле зрения, используя imaging-J. Количественная оценка представляла собой средние значения по случайно выбранным 3 полям в совпадающих по позициям 4 секциях, для каждой опухоли. Контролями служили результаты по срезам нераковой ткани печени. Планки погрешностей отображают стандартное отклонение для экспериментальных измерений для шести мышей. На ФИГ. 57C показан коллаген или волокна в опухолях после обработки ProAgio. Всего исследовали по 80 слайдов на группу животных и по три поля зрения на слайд, а контролем служило окрашивание нормальной ткани печени. ProAgio приводил к лечению рака печени.

[0168] ProAgio можно применять для лечения других фиброзных заболеваний и лечения остеопороза. Кроме того, ProAgio можно применять в комбинации с другими агентами для лечения ревматоидного артрита.

[0169] Аспект настоящего изобретения относится к активному участку раскрытого в данном документе белка и его особенностям, раскрытым в данном документе.

[0170] Конкретные раскрытые в данном документе примеры следует воспринимать исключительно как иллюстративные и никоим образом не ограничивающие оставшуюся часть изобретения. Без дополнительного уточнения считается, что специалист в данной области техники может, на основании приведенного в данном документе описания, применять настоящее изобретение в полном объеме.

[0171] Раскрытые примеры приведены для того, чтобы обеспечить для специалиста в данной области техники полное изложение и описание того, как осуществлять способы и применять композиции и соединения, раскрытые и заявляемые в данном документе. Были предприняты усилия, чтобы гарантировать точность в отношении числовых значений, например, количества, температуры и т.д., но следует учитывать возможность некоторых погрешностей и отклонений. Если не указано иное, доли представляют собой массовые доли, температура представлена в °C, а давление равно или приближено к атмосферному. Нормальные температура и давление соответствуют 20°C и 1 атмосфере.

[0172] Следует отметить, что соотношения, концентрации, количества и другие числовые данные могут быть выражены в данном документе в формате диапазона. Следует понимать, что такой формат диапазона используется для удобства и для краткости и, следовательно, должен интерпретироваться гибким образом, как включающий не только числовые значения, четко указанные в качестве границ диапазона, но также включающий все отдельные числовые значения или поддиапазоны, включенные в этот диапазон, как в случае четкого указания каждого числового значения и поддиапазона. Для иллюстрации, диапазон концентраций «от около 0,1% до около 5%» следует интерпретировать, как включающий не только четко указанную концентрацию от около 0,1 масс.% до около 5 масс.%, но также как включающий отдельные концентрации, например, 1%, 2%, 3% и 4%, и поддиапазоны, например, 0,5%, 1,1%, 2,2%, 3,3% и 4,4% в пределах указанного диапазона. Термин «около» может включать ±1%, ±2%, ±3%, ±4%, ±5%, ±6%, ±7%, ±8%, ±9% или ±10% или более от модифицируемого(ых) числового(ых) значения(й).

Предложенная группа изобретений относится к медицине, а именно к фармацевтике. Предложено применение полипептида ProAgio, который специфически связывается с интегрином α_vβ₃ в βA-домене в области α2-спирали, петли B-C и петли α2-α3, для предотвращения или лечения фиброза печени у субъекта, где указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. Предложен способ предотвращения или лечения фиброза печени у субъекта, включающий определение нуждающегося в этом субъекта и введение указанному субъекту указанного полипептида. Предложенная группа изобретений обеспечивает предотвращение фиброза печени путем введения субъекту полипептида ProAgio, который специфически связывается с интегрином α_vβ₃ в βA-домене в области α2-спирали, петли B-C и петли α2-α3. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 57 ил., 1 пр.

1. Способ предотвращения или лечения фиброза печени у субъекта, включающий определение нуждающегося в этом субъекта и введение указанному субъекту полипептида ProAgio, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, где указанный полипептид специфически связывается с интегрином α_vβ₃ в βA-домене в области α2-спирали, петли B-C и петли α2-α3.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полипептид характеризуется константой диссоциации менее чем 1 мкM.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аминокислотная замена в полипептиде приводит к тому, что полипептид имеет значение гидрофильности в диапазоне от -2 до +2 по сравнению с оригинальной аминокислотной последовательностью D1-CD2 дикого типа.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полипептид характеризуется одним межмолекулярным взаимодействием с интегринами α_vβ₃.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полипептид связывается с интегринами α_vβ₃ в βA-бороздке.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полипептид перекрестно связан с интегрином α_v в TEMKQER.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полипептид перекрестно связан с интегрином β₃ в FNEEVKKQ.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полипептид является ПЭГилированным.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что полипептид ПЭГилирован полиэтиленгликолем.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что полиэтиленгликоль представляет собой ПЭГ с молекулярной массой 20 кДа.

11. Применение полипептида ProAgio, который специфически связывается с интегрином α_vβ₃ в βA-домене в области α2-спирали, петли B-C и петли α2-α3, для предотвращения или лечения фиброза печени у субъекта, где указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.

12. Применение по п. 11, где указанный полипептид предоставляется в фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество указанного полипептида.

13. Применение по п. 12, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

14. Применение по п. 12, где указанная фармацевтическая композиция подходит для местного применения, инъекции, перорального введения или дозирования с замедленным высвобождением.

15. Применение по п. 11, где указанный субъект является млекопитающим.

16. Применение по п. 11, где указанный субъект является человеком.