ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ Mycoplasma hominis И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ МИКОПЛАЗМОЗОВ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования Mycoplasma hominis и диагностики урогенитальных микоплазмозов путем выделения микоплазм из клинического материала.

Этиологическая структура урогенитальных инфекций постоянно меняется. В последнее время резко возросла частота хламидийной, вирусной, микоплазменной, уреаплазменной и смешанной инфекций, борьба с которыми представляет значительные трудности в связи с развивающейся устойчивостью к антибиотикам и особенностями ответных реакций организма.

Лабораторная диагностика играет решающую роль в распознавании урогенитальных микоплазмозов. Это тем более важно, что среди людей широко распространено бессимптомное носительство. До недавнего времени традиционными методами являлись бактериологический и серологический методы.

Техногенные и другие неблагоприятные экологические и социальные факторы снижают популяционный иммунитет населения, ведут к росту иммунодефицитных состояний и изменению структуры инфекционной патологии. Отмечается увеличение заболеваемости инфекциями, передаваемыми половым путем, в том числе новыми или ранее недостаточно известными. Появление большого числа новых диагностических препаратов и методов требует оптимизации лабораторной диагностики урогенитальных инфекций.

Наибольшую диагностическую ценность имеют методы выявления возбудителей и их антигенов. Указанное определяется рядом особенностей урогенитальных инфекций и их возбудителей: их широким распространением и длительностью циркуляции антител после перенесенной инфекции (особенно IgG-антител, выявляемых в иммуноферментном анализе (ИФА)), наличием хронических и латентных форм, частыми микст-инфекциями, высокой серологической гетерогенностью и антигенной изменчивостью, широким спектром перекрестных серологических реакций, низкими титрами специфических иммуноглобулинов при локальных формах инфекций и др.

Из патентной литературы известна "ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКОПЛАЗМ". Для приготовления среды в объем дистиллированной воды добавляют, г: питательный бульон 19,21, эритрит 0,01, тиамин-бромид 0,004, аргинин 0,08, цистин 0,4, глюкоза 0,8, ЭКД 4,0, агар 8,96, Na₂CO₃ 0,64. Среду тщательно 2 перемешивают и доводят до кипения, затем автоклавируют. После остывания в среду добавляют 200 мл лошадиной сыворотки и пенициллин. При посевной дозе 10 млн./кл./мл вырастает 120 колоний. (См. патент РФ №1397481, 1988.)

Также известна ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОПЛАЗМ. Для приготовления среды используют перевар сгустков крови человека (триптический перевар) в качестве питательной основы. В качестве стимулятора роста используют сыворотку крови человека 0(1) группы, истощенную механизмами 10-20 мас.%. В состав среды входят, мас.%: 50%-ный дрожжевой экстракт 8-15; глюкоза 0,5-1; хлористый натрий 0,5-1. Все компоненты перемешивают и объем среды доводят до 100 мл переваром сгустков крови. рН среды 7,4-7,8. Рост микоплазм на 3-4-е сутки. (См. патент РФ №1527256, С 12 N 1/20, 1989.)

Наиболее близким к заявляемому способу является "Способ подсчета, обнаружения и идентификации микоплазм в общем и урогенитальных микоплазм в частности, и биологическая среда, специально приспособленная для этой цели". Способ характеризуется ферментативными реакциями, которые протекают при анаэробных условиях в жидкой среде для выращивания микоплазм, содержащей бульон для культивирования микоплазм, лошадиную сыворотку, ампициллин, бактрим, восстановитель тиогликолят натрия, дрожжевой экстракт, цистеин и аргинин. В качестве цветового индикатора используют феноловый красный. Для создания анаэробных условий используют парафиновое масло. Анализируя изменение цвета индикатора в течение одного - двух дней, делают выводы о наличии микоплазменной инфекции. (См. патент US №5091307, 1992.)

Культуральный метод диагностики урогенитальных инфекций для выявления Mycoplasma hominis на селективной жидкой питательной среде является наиболее простым и надежным. Использование этого метода позволяет осуществлять выявление и идентификацию Mycoplasma hominis, а также оценивать степень обсемененности исследуемого материала в цветообразующих единицах (ЦОЕ/мл). Последнее особенно важно для клинической оценки этиологии воспалительных процессов. Имеющим этиологическое значение считается концентрация микоплазм в исследуемом материале не менее 10000 ЦОЕ/мл. Определение чувствительности выделенных культур к антибиотикам и целенаправленное назначение препаратов существенно повышает эффективность проводимой терапии, что выгодно отличает культуральный метод от других методов диагностики урогенитальных микоплазмозов (полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции иммунофлюоресценции (РИФ)). Культуральный метод диагностики урогенитальных микоплазмозов является более достоверным в сравнении с РИФ, более низкая чувствительность и специфичность которой определяется малыми линейными размерами этих микроорганизмов, выраженной их гетерогенностью и изменчивостью, часто встречающейся низкой концентрацией микоплазм в первичном материале и, соответственно, необходимостью их накопления для выявления, сложностью взятия качественного соскоба для этой реакции.

Разработана технология получения селективной питательной среды, что дает возможность проведения идентификации выделенных культур микоплазм и оценки их количества (титра) в образцах. При разработке были получены оптимальные соотношения компонентов селективной жидкой питательной среды для выявления Mycoplasma hominis, что привело к повышению ее чувствительности.

Среда обеспечивает рост Mycoplasma hominis, сопровождающийся изменением цвета среды за счет проявления ферментативной активности, и тормозит рост сопутствующих грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов.

Питательная среда для выявления Mycoplasma hominis содержит питательную основу, стимуляторы роста, аргинин, лошадиную сыворотку и дистиллированную воду. Отличается тем, что в качестве питательной основы она содержит сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста - дрожжевой экстракт и среду 199, и в качестве селективных добавок - антибиотики, и индикатор; при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

- сердечно-мозговая вытяжка ("Becton Dickinson microbiology systems"США, кат. №237500, 2002 г.)- 18-22- триптоза ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211709, 2002 г.)- 8-12- дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211929, 2002 г.)- 3-4- среда 199 сухая ("Sigma", кат. № М5017, 2002 г.)- 4,70-5,20- L-аргинина гидрохлорид ("Sigma", США, кат. №А3909, 2002 г.)- 5-10- индикатор - феноловый красный ("Sigma", США, кат. № Р5530, 2002 г.)- 0,04-0,07- сыворотка лошадиная- 0,25-0,30- селективные добавки - антибиотики- 0,64-1,27- дистиллированная вода- остальное

Питательная среда содержит селективные добавки - антибиотики при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

- ампициллина натриевая соль- 0,5-1,0- ванкомицина гидрохлорид- 0,1 -0,2- полимиксин В сульфат- 0,01-0,02- амфотерицин В- 0,01-0,02- эритромицин- 0,02-0,03

В предложенном составе питательной среды представлено оптимальное количественное соотношение компонентов, концентрация антибиотиков и индикаторного красителя. Предложенный способ диагностики инфекций, вызываемых Mycoplasma hominis, включает введение питательной среды, способствующей обнаружению возбудителей заболеваний, в лунки культурального планшета, исследуемого материала, индикатора и вещества, создающего анаэробные условия и анализ изменения цвета питательной среды. В качестве питательной среды используют питательную основу, стимуляторы роста, аргинин, лошадиную сыворотку, дистиллированную воду, в качестве питательной основы сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста - дрожжевой экстракт и среду 199, и в качестве селективных добавок - антибиотики, и индикатор.

Способ диагностики прост в постановке, не требует специального оборудования, позволяет проводить как выявление, так и идентификацию возбудителей, определить степень обсемененности и спектр чувствительности к различным антибактериальным препаратам, оценить эффективность проведенного лечения.

Использование заявляемого состава питательной среды позволяет упростить состав, повысить скорость и точность способа диагностики микоплазменной инфекции за счет повышения чувствительности среды.

Для приготовления основы питательной среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №237500, 2002 г.) - 18-24 г, триптозу ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211709, 2002 г.) - 8-12 г, дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211929, 2002 г.) - 3-4 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую ("Sigma", кат. № М5017, 2002 г.) - 4,7-5,2 г, L-аргинина гидрохлорид ("Sigma", США, кат. №А3909, 2002 г.) - 5-10 г/л, феноловый красный ("Sigma", США, кат. № Р5530, 2002 г.) - 0,04-0,07 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием.

Для приготовления питательной среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 250-300 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль - 0,5-1,0 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,1-0,2 г, полимиксина В сульфат - 0,01-0,02 г, амфотерицин В - 0,01-0,02 г, эритромицин - 0,02-0,03 г. Под контролем рН-метра устанавливают рН 6,1-6,3, добавляя по каплям концентрированную соляную кислоту.

Пример 1.

Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №237500, 2002 г.) - 18 г, триптозу ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211709, 2002 г.) - 8 г, дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211929, 2002 г.) - 3 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую ("Sigma", кат. № М5017, 2002 г.) - 4,7 г, L-аргинина гидрохлорид ("Sigma", США, кат. №А3909, 2002 г.) - 5 г, феноловый красный ("Sigma", США, кат. № Р5530, 2002 г.) - 0,04 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием.

Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 250 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль - 0,5 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,1 г, полимиксина В сульфат - 0,01 г, амфотерицин В - 0,01 г, эритромицин - 0,02 г. Устанавливают рН 6,1-6,3.

Пример 2 (оптимальный).

Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №237500, 2002 г.) - 20 г, триптозу ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211709, 2002 г.) - 10 г, дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211929, 2002 г.) - 3 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую ("Sigma", кат. № М5017, 2002 г.) - 4,95 г, L-аргинина гидрохлорид ("Sigma", США, кат. №А3909, 2002 г.) - 7,5 г, феноловый красный ("Sigma", США, кат. № Р5530, 2002 г.) - 0,05 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием.

Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 250 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль - 0,75 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,15 г, полимиксина В сульфат - 0,01 г, амфотерицин В - 0,015 г, эритромицин - 0,025 г. Устанавливают рН 6,1-6,3.

Пример 3.

Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №237500, 2002 г.) - 24 г, триптозу ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211709, 2002 г.) - 12 г, дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211929, 2002 г.) - 4 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую ("Sigma", кат. № М5017, 2002 г.) - 5,2 г, L-аргинина гидрохлорид ("Sigma", США, кат. №А3909, 2002 г.) - 10 г, феноловый красный ("Sigma", США, кат. № Р5530, 2002 г.) - 0,07 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием.

Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 300 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль - 1 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,2 г, полимиксина В сульфат - 0,02 г, амфотерицин В - 0,02 г, эритромицин - 0,03 г. Устанавливают рН 6,1-6,3.

Селективная питательная среда должна обеспечивать рост Mycoplasma hominis, сопровождающийся изменением цвета среды с оранжевого на малиновый за счет проявления ферментативной активности, и тормозить рост сопутствующих микроорганизмов (грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов).

Способ диагностики урогенитальных микроплазмозов.

1. Разморозить среду при комнатной температуре или на водяной бане при температуре 40°С-45°С.

2. Внести по 0,225 мл питательной среды в 4 последовательные лунки культурального 96-луночного планшета (или 4 микропробирки на 1,5 мл или 0,5 мл). Промаркировать лунки планшета (микропробирки): первую - 3, вторую - 4, третью - 5, четвертую - 6.

3. Тщательно суспендировать на вортексе исследуемый образец.

4. Сделать серию 10-кратных разведений исследуемого образца в питательной среде: внести 0,25 мл исследуемого образца в лунку (микропробирку) 3, тщательно пипетировать, перенести 0,25 мл из полученного разведения в следующею лунку (микропробирку) и повторить процедуру разведения.

5. В 4 последовательные лунки культурального планшета (микропробирки), обозначенные "К-", внести по 0,200 мл питательной среды и провести процедуру 10-кратного разведения, как описано в п.4, используя вместо исследуемого образца транспортную среду.

6. В каждую лунку планшета (микропробирку) внести по 0,70 мл стерильного минерального масла для создания анаэробной среды.

7. Поместить планшет (микропробирки) в термостат и инкубировать при температуре (37±1)°C.

8. Регистрацию результатов проводят на третьи сутки инкубации в термостате при ежедневном визуальном просмотре посевов и о степени обсемененности материала судят по изменению цвета питательной среды.

В качестве транспортной среды используют среду при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

- сердечно-мозговую вытяжку ("Becton Dickinson microbiology systems" США, кат. №237500, 2002 г.)- 18-22- триптозу ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211709,2002 г.)- 8-12- дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211929, 2002 г.)- 3-4- среда 199 сухая ("Sigma", кат. № М5017, 2002 г.)-4,70-5,20- индикатор - феноловый красный ("Sigma", США, кат. № Р5530, 2002 г.)- 0,04-0,07- сыворотку лошадиную- 0,25-0,30- ампициллина натриевую соль- 0,50-1,00- ванкомицина гидрохлорид- 0,10-0,20- полимиксин В сульфат- 0,01-0,02- амфотерицин В- 0,01-0,02- дистиллированную воду- остальное.

Для проведения диагностики используется следующий клинический материал:

- соскоб клеток слизистой уретры, цервикального канала, влагалища;

- первая порция утренней мочи (осадок, полученный центрифугированием 10 мл первой порции утренней мочи);

- секрет предстательной железы (V-0,50-0,10 мл), эякулят (V-0,50-0,10 мл).

Ключевым моментом в диагностике возбудителей урогенитальных микоплазмозов являются взятие исследуемого материала и условия его хранения.

Необходимо:

1) брать материал до начала проведения антибактериальной терапии;

2) процедура взятия материала должна быть стандартной;

3) важно получить достаточное количество клеток, поскольку микоплазмы является микроорганизмами, колонизирующими клеточную поверхность;

4) не использовать при взятии материала местных антисептиков;

5) тщательное удаление слизи из цервикального канала;

6) взятие уретральных образцов следует проводить не ранее чем через 2-3 часа после мочеиспускания;

7) получение секрета предстательной железы и эякулята проводят непосредственно после мочеиспускания;

8) исследуемый материал помещают в специальную транспортную среду, наилучшим образом обеспечивающую сохранение жизнеспособности микоплазм.

табл.1
Условия хранения образцов.Условия храненияМаксим. продолжительность хранения, час.При комнатной температуре от 18°С до 24°С5В холодильной камере (на нижней полке холодильника) при температуре от 2°С до 6°С96табл.2
Интерпретация результатов.РезультатыИнтерпретация+ - есть рост Mycoplasma hominis- - отсутствие роста Mycoplasma hominisЛунка(пробирка)Выявление Mycoplasma hominisОбсемененность исследуемого образца ЦОЕ (цветообразующих единиц)/мл образца3456----Не выявлено-+---Обнаружено10³++--Обнаружено10⁴+++-Обнаружено10⁵++++Обнаружено10⁶-+++Обнаружено10⁶

Учет результатов.

Учет результатов проводят путем визуального просмотра засеянных планшетов (пробирок). Рост Mycoplasma hominis наблюдается в течение 48-72 часов. Рост Mycoplasma hominis сопровождается изменением цвета питательной среды с оранжевого на малиновый, без помутнения, за счет проявления ферментативной активности, гидролиза аргинина, образования аммиака и сдвига рН. При росте Mycoplasma hominis возможно образование незначительного придонного осадка. Рост отмечается на вторые сутки инкубации. В случае низкой обсемененности материала изменение цвета среды происходит на третьи сутки.

Табл.3
Среда для выявления Mycoplasma hominisпитательная средачисло произведенных посевовчисло выделенных культурабсолютное значение%известная1321511,4предлагаемая1321813,6табл.4
Рост Mycoplasma hominis при посеве исследуемого материала в разных разведенияхразведение исследуемого материала (посевная доза)рост на известной средерост на предлагаемой среде10^-3151810^-4151810^-5141810^-61114

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования Mycoplasma hominis и диагностики урогенитальных микоплазмозов путем выделения микоплазм из клинического материала. Питательная среда для выявления Mycoplasma hominis содержит питательную основу, стимуляторы роста, аргинин, лошадиную сыворотку и дистиллированную воду. В качестве питательной основы она содержит сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста - дрожжевой экстракт и среду 199, и в качестве селективных добавок - антибиотики, и индикатор. Предложенный способ диагностики инфекций, вызываемых Mycoplasma hominis, включает введение питательной среды, способствующей обнаружению возбудителей заболеваний, в лунки культурального планшета, исследуемого материала, индикатора и вещества, создающего анаэробные условия и анализ изменения цвета питательной среды. В качестве питательной среды используют питательную среду вышеоговоренного качественного и количественного состава компонентов. Способ диагностики прост в постановке, не требует специального оборудования, позволяет проводить как выявление, так и идентификацию возбудителей, определить степень обсемененности и спектр чувствительности к различным антибактериальным препаратам, оценить эффективность проведенного лечения. Использование питательной среды позволяет упростить состав, повысить скорость и точность способа диагностики микоплазменной инфекции за счет повышения чувствительности среды. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Питательная среда для выявления Mycoplasma hominis, содержащая питательную основу, стимуляторы роста, аргинин, лошадиную сыворотку и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста - дрожжевой экстракт и среду 199, и в качестве селективных добавок - антибиотики, и индикатор при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Сердечно-мозговая вытяжка ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 237500, 2002 г.)18-22Триптоза ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 211709, 2002 г.)8-12Дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 211929, 2002 г.)3-4Среда 199 сухая ("Sigma", кат.№ М5017, 2002 г.)4,70-5,20L-аргинина гидрохлорид ("Sigma", США, кат.№ А 3909, 2002 г.)5-10Индикатор - феноловый красный ("Sigma", кат. № Р5530, 2002 г.)0,04-0,07Сыворотка лошадиная0,25-0,3Селективные добавки - антибиотики0,64-1,27Дистиллированная водаОстальное

Ампициллина натриевая соль0,5-1,0Ванкомицина гидрохлорид0,1-0,2Полимиксин В сульфат0,01-0,02Амфотерицин В0,01-0,02Эритромицин0,02-0,03

Сердечно-мозговая вытяжка ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат.№ 237500, 2002 г.)18-22Триптоза ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 211709, 2002 г.)8-12Дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 211929, 2002 г.)3-4Среда 199 сухая ("Sigma", кат.№ М5017, 2002 г.)4,70-5,20L-аргинина гидрохлорид ("Sigma", США, кат.№ А 3909, 2002 г.)5-10Индикатор - феноловый красный ("Sigma", кат.№ Р5530, 2002 г.)0,04-0,07Сыворотка лошадиная0,25-0,30Ампициллина натриевая соль0,50-1,00Ванкомицина гидрохлорид0,10-0,20Полимиксин В сульфат0,01-0,02Амфотерицин В0,01-0,02Эритромицин0,02-0,03Дстиллированная водаОтальное

которую вносят в лунки культурального планшета, маркируют лунки планшета, суспендируют на вортексе исследуемый материал, делают серию 10-кратных разведений исследуемого образца в питательной среде и повторяют процедуру разведения; в лунки культурального планшета вносят питательную среду и проводят процедуру 10-тикратных разведений, используя транспортную среду; в каждую лунку планшета вносят минеральное масло, создающее анаэробные условия; планшет помещают в термостат и инкубируют при температуре (37±1)°С; регистрацию результатов проводят на третьи сутки инкубации в термостате, при ежедневном визуальном просмотре посевов, а о степени обсемененности материала судят по изменению цвета питательной среды.

Сердечно-мозговая вытяжка ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 237500, 2002 г.)18-22Триптоза ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 211709, 2002 г.)8-12Дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. № 211929, 2002 г.)3-4Среда 199 сухая ("Sigma", кат. № М5017, 2002 г.)4,70-5,20Индикатор - феноловый красный ("Sigma", кат. № Р5530, 2002 г.)0,04-0,07Сыворотка лошадиная0,25-0,30Ампициллина натриевая соль0,50-1,00Ванкомицина гидрохлорид0,10-0,20Полимиксин В сульфат0,01-0,02Амфотерицин В0,01-0,02Дистиллированная водаОстальное