Гемостатическая композиция (варианты) Российский патент 2024 года по МПК A61K31/722 A61P7/04 

Изобретение относится к области медицины, в частности к гемостатическим средствам, а именно к местным биоразлагаемым гемостатическим средствам (далее - «МБГС») для остановки внутриполостного кровотечения.

Известно местное гемостатическое средство (Местное гемостатическое средство: патент RU 2519220, Российская Федерация, заявка RU 2013108191, заявл. 26.02.2013, опубл. 10.06.2014), включающее 75-95 мас. % соли хитозана из ряда полидисперсных порошков гидрохлорида, гидробромида, формиата, ацетата, сукцината, цитрата, гликолата либо лактата хитозана и 4-20 мас. % полигексаметиленгуанидин гидрохлорида. Соль хитозана и полигексаметиленгуанидин гидрохлорид ковалентно сшиваются 1-5 мас. % полифункционального соединения из ряда глицидиловых эфиров. Соль хитозана выбирается со средним размером частиц 0,2÷2,0 мм, степенью деацетилирования хитозана 0,75÷0,95, молекулярной массой 10÷500 кДа. В качестве полифункционального соединения из ряда глицидиловых эфиров используется диглицидиловый эфир бутандиола, ди- или триэтиленгликоля или полипропиленгликоля, олигоэтиленоксида, а также триглицидиловые эфиры глицерина или триметилолпропана. Средство обладает высокой сорбционной способностью по крови, коротким временем наступления гемостаза и высокой антимикробной активностью.

Вышеприведенное средство представляет собой порошок, который может быть использован для остановки наружного кровотечения, но не применим для остановки внутреннего кровотечения.

Известен гидрогель на основе комплексной соли хитозана и способ его получения (Гидрогель на основе комплексной соли хитозана и способ его получения: патент RU2617501, Российская Федерация, заявка RU 2015152528, заявл. 08.12.2015, опубл. 25.04.2017). Способ получения гидрогеля, включает растворение хитозансодержащего вещества в водном растворе органической кислоты и последующее введение в раствор гелеобразователя. В качестве хитозансодержащего вещества используют гидрохлорид хитозана, в качестве органической кислоты используют аскорбиновую или молочную кислоту, в качестве гелеобразователя используют растворы глицеролата кремния в глицерине при мольном соотношении глицеролат кремния:глицерин 1:2-1:6, причем исходные компоненты взяты в количестве, мас. %: гидрохлорид хитозана 1.5-20.0, аскорбиновая кислота 1.5-10.0, или молочная кислота 0.5-2.0, раствор глицеролата кремния в глицерине 10.0-60.0, вода - остальное.

Недостатком данного технического решения является относительно низкая эффективность, так как данные композиции в первую очередь нацелены на ранозаживляющее действие. При этом описанный способ получения гидрогеля является сложным, многостадийным и многокомпонентным.

Также известно гемостатическое покрытие (заявка US 2017326171. опубликована 16.11.2017 г.), содержащее гемостатический биополимер в концентрации от 0,1 до 3,0 масс. %, вторичный полимер, ионный сшивающий агент в концентрации от 0,1 до 1,0 масс. % и растворитель. В качестве гемостатического полимера может быть использован формиат хитозана. В качестве вторичного полимера может быть использован поливиниловый спирт с молекулярной массой от 50000 до 300000 Да.

Недостатком данного покрытия является его сложный многокомпонентный состав и относительно высокая сложность его получения. Это обусловлено необходимостью регулировать реологические свойства гемостатического средства путем изменения молекулярной массы полимера, концентрации полимера, типа сшивающего агента или концентрации сшивающего агента. Средство может состоять из полностью вторичного полимера с гемостатическим полимером в качестве добавки или может состоять из вторичного полимера в растворителе, например воде или органических растворителях.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является гель для остановки крови на основе хитозана (WO 2013096448 А1), включающий соль хитозана, выбранную из ацетата хитозана, сукцината хитозана, адипата хитозана, хлорида хитозана, глутамата хитозана, лактата хитозана, аспартата хитозана, пирувата хитозана, хитозанфосфата, хитозанфосфата. аскорбат, салицилат хитозана, формиат хитозана и маната хитозана. Также гель включает воду и уксусную кислоту. Данное техническое решение принято за прототип.

Недостатком прототипа является сложность приготовления, обусловленную необходимостью одновременного обезвоживания и прессования полимеризованного хитозанового геля.

Технической проблемой является необходимость разработки простого в изготовлении и эффективного гемостатического средства на основе хитозана, лишенного вышеприведенных недостатков.

Технический результат состоит в обеспечении простой в изготовлении и нетоксичной гемостатической композиции с высокой эффективностью.

Технический результат достигается тем, что гемостатическая композиция в виде пасты, содержащая формиат хитозана и воду, согласно изобретению содержит компоненты в следующих соотношениях, мас. %:

формиат хитозана 20

вода остальное

Для приготовления заявляемой композиции в виде пасты в реактор-смеситель загружают 40 г формиат хитозана и 100 мл воды, оставляют для набухания на 60 мин. Добавляют оставшееся количество воды и перемешивают со скоростью (50 - 100) об/мин в течение (60 - 70) мин до получения желтой или светло-желтой пасты (см. таблицу 1).

Для приготовления заявляемой композиции в виде геля в реактор-смеситель при включенной мешалке загружают 190 мл воды и 10 г лактата хитозана. Перемешивание проводят со скоростью (50 - 100) об/мин в течение 40 - 60 мин до получения однородной гелеобразной массы (см. таблицу 1).

Основные показатели данных композиций представлены в таблице 2.

Заявляемое изобретение используют следующим образом.

При проведении операций на органах брюшной полости используют композицию в виде пасты. Для этого в первую очередь убирают кровь с раневой поверхности. Выдавливают МБГС из шприца непосредственно на раневую поверхность. МБГС должен полностью контактировать с кровоточащей поверхностью. Выполняют мануальную компрессию МБГС к участку кровотечения минимум на 2 мин. После выполнения компрессии осматривают рану, оценивают уровень гемостаза. Избыток МБГС аккуратно удаляют механическим путем или смывают. В случае продолжающегося кровотечения ввести дополнительно МБГС, выполнить повторную компрессию в течение 2 мин или дольше (при необходимости).

При оказании помощи пострадавшему с продолжающимся внутрибрюшным кровотечением используют композицию в виде геля. Для этого ниже пупка, в случае переломов костей - выше пупка, по средней линии живота выполнить местную инфильтрационную анестезию на всю толщину передней брюшной стенки. Сделать продольный разрез кожи и подкожной клетчатки длиной до (1,5 - 2) см Для исключения ложноположительного результата на кровоточащие сосуды накладывают зажимы. Апоневроз белой линии живота захватывают однозубым крючком или бельевыми цапками. Передняя брюшная стенка левой рукой оперирующего оттягивается краниально и вверх. Затем перпендикулярно приподнятой и натянутой брюшной стенке (примерно 45 градусов к поверхности стола) сразу под крючком осторожными вращательными движениями троакара последовательно прокалывают апоневроз и париетальная брюшина. Затем стилет извлекают, в брюшную полость через гильзу троакара вводят прозрачный катетер. Появление в катетере крови является признаком продолжающегося внутрибрюшного кровотечения. Затем катетер проводят по гильзе троакара в правое подреберье

В корпус специального средства доставки МБГС (представлено на фигуре) устанавливают емкость с гемостатическим гелем (сменный картридж с внутренним поршнем). Катетер, введенный в брюшную полость, соединяют со штоком средства доставки. 10 нажатиями на рукоятку средства доставки в брюшную полость вводят МБГС. Катетер, введенный в брюшную полость, отсоединяют от штока средства доставки МБГС.

Катетер проводят по гильзе троакара в левое подреберье. Катетер, введенный в брюшную полость. Производят смену картриджа с МБГС и снова катетер соединяют со штоком средства доставки. 10 нажатиями на рукоятку подачи средства доставки МБГС в брюшную полость вводят гемостатический гель. Катетер, введенный в брюшную полость, отсоединяют от штока средства доставки МБГС.

После введения гемостатического средства катетер удаляют, операционная рана послойно ушивается отдельными узловыми швами. На область зашитой раны накладывают асептическую повязку (наклейка).

Рекомендовано наложение бандажа брюшной полости для улучшения эффективности гемостаза. Для этого необходимо вскрыть упаковку с компрессионной повязкой и придерживая свободный край повязки наложить циркулярную повязку на уровне мезо- и гипогастральной области живота.

В случае наличия индикатора компрессии на бандажной повязке, растянуть эластическое полотно повязки таким образом, чтобы индикатор компрессии приобрел форму в соответствии с инструкцией по применению данной повязки.

Механическое средство доставки МБГС в брюшную полость представлено на фигуре и состоит из следующих элементов:

- поз.1 корпус из твердого непрозрачного полимерного материала - ABS (акрилонитрил бутадиен стирол);

- поз.2 рукоятка подачи (курок) из твердого непрозрачного полимерного материала - ABS или полиэтилентерефталата.

- поз.3 шток из алюминия, диаметр штока 8 мм;

- поз.4 стопор прямого хода, изготовленный из стали;

- поз.5 Стопор обратного хода, изготовленный из стали;

- поз.6 пружина прямого хода, изготовленная из пружинной стали;

- поз.7 пружина обратного хода, изготовленная из пружинной стали;

- поз.8 рукоятка отвода поршня из ABS или полиэтил ентерефталата;

- поз.9 полипропиленовый картридж с металлическим бандажом для МБГС (150 см³ эффективного объема).

Конструкция позволяет вводить объем 150 см³ за (10-12) нажатий рукоятки (в течение 25 с).

Заявляемое изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Скрининг по выбору перспективных форм и концентраций местных биоразлагаемых гемостатических средств

На основе анализа литературных данных в качестве основного компонента композиций были выбраны соли молочной и муравьиной кислот. Лактат хитозана был закуплен для исследований, а формиат был получен в лаборатории ООО «НОВОПЛАСТ-М».

Соль муравьиной кислоты была получена из хитозана со степенью деацетилирования 90%. Водный раствор соли был получен при добавлении эквимольного количества кислоты к водной суспензии хитозана при комнатной температуре. Выделяли из водного раствора упариванием воды или высаживанием из этилового спирта. Соль сушили в вакууме при комнатной температуре до постоянной массы.

В результате серии опытов были определены оптимальные концентрации соли хитозана в местом биоразлагаемом гемостатическом средстве (далее - «МБГС»). Основным показателем при выборе были реологические свойства полученного средства.

Из наработанных образцов МБГС были выбраны четыре для проведения дальнейших исследований на эффективность.

МБГС 0102: Хитозан формиат - 5 г; Вода очищенная - до 100 г.

МБГС 0103: Хитозан формиат - 25 г; Вода очищенная - до 100 г.

МБГС 0401: Хитозан лактат - 5 г; Вода очищенная - до 100 г.

МБГС 0402: Хитозан лактат - 5 г; Транексамовая кислота - 5 г;

Вода очищенная - до 100 г.

Для изучения эффективности четырех составов МБГС использовали модель травматического повреждения печени кролика, адаптированную к условиям проведения эксперимента. Данный подход рекомендован для оценки эффективности гемостатических средств местного действия.

В данном исследовании в качестве тест-системы были использованы самцы кролики. На кроликах разработаны методические подходы, позволяющие моделировать травматическое повреждение печени, сопровождающееся кровопотерей.

В эксперименте было задействовано 35 самцов кроликов, и еще 5 самцов были доступны на случай необходимости замены в течение периода адаптации. После окончания периода адаптации незадействованные животные выполняли роль сентинельных животных, т.е. содержались в одинаковых условиях с экспериментальными животными до окончания эксперимента.

Была проведена рандомизация животных по группам (см. таблицу 3).

Всего 9 групп, группа №1 - контрольная (7 кроликов).

Каждое животное внутри группы было промаркировано посредством нанесения перманентным маркером индивидуального номера на внутренней стороне ушной раковины. Данный номер состоял из двух частей: 1-я - номер группы и 2-я - порядковый номер животного в группе. Нумерация в пределах группы сплошная.

В данном исследовании тестируемые составы МБГС вводили животным однократно в брюшную полость, как аналог планируемого применения в клинической практике при лечении внутренних кровотечений II-й и III-й степени. Все животные получили исследуемые объекты однократно в объеме 10 мл готовой лекарственной формы на одно животное без учета массы тела.

Была разработана модель оперативного вмешательства на брюшной полости (кролика) с нанесением ранения средней доли печени животного с интенсивностью кровотечения 3 степени.

Спустя (5-7) мин после наступления состояния наркоза животное фиксировали на операционном столе в положении «на спине». Затем осуществляли местную инфильтрационную анестезию средней линии живота с помощью подкожного введения 0,25% раствора препарата Новокаин, начиная от мечевидного отростка грудины.

Далее выполняли верхнесрединную лапаротомию (длина разреза (8-10) см) и осуществляли отдельный разрез передней брюшной стенки по средней линии живота ниже лапаротомии. Среднюю долю печени выводили в лапаротомический разрез и отграничивали салфетками. Через второй разрез в брюшную полость вставляли трубку длинной 20 см, диаметром 5 мм с тремя боковыми отверстиями [(2-3) мм в диаметре, на расстоянии (1-3) см от конца трубки] для обеспечения введения тестируемых МБГС.

Нанесение раны печени выполняли с помощью специального пластмассового трафарета-ограничителя с квадратным отверстием (размером 2x2 см). Трафарет прикладывали к диафрагмальной поверхности печени, надавливали и осуществляли резекцию выступившей части печени лезвием на глубину (толщину) около 0,3 см в центре участка печени. В результате чего получали поверхностное паренхиматозное кровотечение.

Образовавшаяся рана с ровными краями и равномерной кривизной имела общую площадь около 4 см2 и глубину около 0,3 см. В течение 2 мин после нанесения травмы печень погружали в брюшную полость, ранее введенную трубку подводили к ране. Далее лапаротомический разрез послойно зашивали, осуществляли введение исследуемых объектов, трубку удаляли и разрез зашивали. С целью уменьшения объема брюшной полости осуществляли «бандажирование» нижней части живота, путем наложения циркулярной повязки при помощи фиксирующего эластичного бинта.

Для животных контрольной группы осуществляли травму печени по описанному выше методу, за исключением выполнения отдельного прокола передней брюшной стенки и установки трубки.

Животным групп №№ 1-5 спустя 2 мин после нанесения раны на печень осуществляли введение тестируемых МБГС через ранее установленную трубку, согласно дизайну исследования. Животным групп №№ 6-9 тестируемые препараты вводили аналогичным способом без моделирования экспериментальной патологии.

Животному, находившегося в состоянии наркоза и зафиксированного на операционном столе в положении лежа на спине, выполняли небольшой разрез (прокол) передней брюшной стенки по средней линии живота и устанавливали трубку. Через трубку, выведенную на переднюю брюшную стенку, вводили исследуемые объекты, согласно дизайну исследования. После введения трубку удаляли и зашивали разрез.

После введения животных групп №№ 6-9 размещали на подогреваемых ковриках до выхода из наркозного состояния.

В таблице 4 представлен график манипуляций с животными по группам.

Оценку эффективности исследуемых объектов во время оперативного вмешательства животных групп №№ 1-5 проводили по следующим показателям:

- оценка функционального состояния сердечно-сосудистой системы (ССС) и дыхательной системы;

- гематологические исследования;

- оценка интенсивности кровотечения;

- регистрация времени остановки кровотечения;

- примерный объем кровопотери.

Оценку проводили на основании показателей АД, ЧСС и ЧДД. Для данных показателей был зафиксирован исходный уровень (до начала оперативного вмешательства), а также через 60 мин и перед релапаротомией через два и три часа после моделирования патологии.

Регистрацию ЧДД осуществляли с помощью пневмографа с пьезодатчиком (ADInstruments Pty Ltd, Австралия). Непосредственно после регистрации ЧДД проводили регистрацию ЧСС при помощи компьютерного электрокардиографа для ветеринарии «Поли-спектр-8Е» (ООО «Нейрософт», Россия). После регистрации ЧСС у животных измеряли АД неинвазивным методом при помощи прибора для измерения артериального давления у лабораторных животных (ООО «Zoomed», Россия).

Оценку интенсивности кровотечения проводили через 120 мин после моделирования патологии. Проводили релапаротомию и визуально регистрировали интенсивность кровотечения по адаптированной под массу животного бальной шкале интенсивности полостного кровотечения Validated Intraoperative Bleeding Scale (VIBe Scale):

- отсутствие кровотечения - 0 баллов;

- просачивание (капиллярное) - 1 балл;

- натекание (кровотечение из венул и артериол) - 2 балла;

- сильное кровотечение (из нецентральных венул и артериол) - 3 балла;

- струйное кровотечение (из вен и артерий) - 4 балла.

После этого осуществляли сведение краев раны зажимом. Манипуляцию повторяли через 3 ч после нанесения травмы на печень.

Через 120 и 180 мин после моделирования патологии осуществляли регистрацию остановки кровотечения.

С целью выявления отклонений в состоянии здоровья и поведения ежедневно осуществляли клиническое наблюдение и регистрацию гибели животных групп №№6-9 на протяжении 14 дней после введения исследуемых объектов.

Регистрировали:

- поведение: угнетение / возбуждение;

- реакцию на раздражители: снижение / повышение;

- кожные покровы: покраснение / бледность / синюшность / желтушность;

- слизистые оболочки: покраснение / бледность / синюшность / желтушность;

- выделения: из глаз / из носа / из анального отверстия / из уретры;

- тонус мускулатуры: снижение / повышение;

- нарушение координации движений: атаксия / гиперкинез;

- одышка;

- смерть.

Регистрировали суточное потребление воды до введения препаратов (за 1-2 дня до процедуры), через 24 ч после введения, а также на 7-й и 13-й дни эксперимента. Для этого за 1 день до манипуляции животным помещали в клетки индивидуального содержания. Производили выдачу поилок с водой в объеме 0,5 мл. На следующий день производили регистрацию остаточного объема. На данный период животные не были лишены корма.

Непосредственно до введения препаратов, через 24 ч после, а также на 3-й, 7-й и 14-й дни у животных проводили сбор образцов крови для клинического анализа.

Кровь собирали из краевой вены ушной раковины кроликов в пробирки с ЭДТА-КЗ (IMPROMINI®). У животных групп №№1-5 кровь забирали до моделирования экспериментальной патологии, через 60, 120 и 180 мин. У животных групп №№6-9 - до введения тестируемых препаратов, через 24 ч, на 3-й, 7-й и 14-й дни эксперимента.

В образцах цельной крови на гематологическом анализаторе Mythic 18 Vet (Orphee, Швейцария) определяли следующие параметры:

- количество эритроцитов;

- уровень гемоглобина;

- гематокрит;

- количество тромбоцитов;

- количество лейкоцитов;

- лимфоциты;

- средние клетки (моноциты, эозинофилы, базофилы);

- гранулоциты.

Данные гематологического анализа животных групп №1-5, которым вводили тестируемые препараты на фоне экспериментальной патологии, клинически значимых изменений вышеперечисленных показателей не наблюдали. В связи с этим дополнительные параметры общего клинического анализа крови не изучали.

В раках оценки переносимости тестируемых препаратов макроскопическому анализу подлежали животные групп №№6-9. Некропсию выполняли под непосредственным наблюдением патоморфолога. После эвтаназии животные были тщательно обследованы на предмет внешних патологических признаков. Было проведено исследование состояния грудной и брюшной полости и макроскопическое исследование внутренних органов и тканей, непосредственно контактирующих с тестируемыми препаратами. Аналогичные исследования проводили в отношении павших животных с заполнением карты некропсии.

При некропсии были отобраны органы (фрагменты органов) и ткани, указанные ниже, и зафиксированы в 10% рН-нейтральном формалине:

- для животных групп №1-5 отобран участок печени, где моделировали экспериментальную патологию;

- для животных групп №№6-9 отобраны печень, селезенка, почки, фрагменты тонкого и толстого отделов кишечника, где наблюдали макроскопические патологичные изменения.

Для всех полученных данных была применена описательная статистика: данные были проверены на соответствие закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilkes W test) по группам. В случае нормального распределения был применен параметрический анализ (критерий Стьюдента, однофакторный анализ (ANOVA) с применением критерия Тьюки). В случаях несоответствия данных как минимум одной из экспериментальных групп закону нормального распределения применяли непараметрический анализ (критерий Манна-Уитни, критерий Вилкоксона для связанных данных, критерий Краскела-Уоллиса с множественными сравнениями средних рангов).

Различия определяли при уровне значимости р<0,05. Статистический анализ выполнялся с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, США).

Ввиду малой выборки групп №№6-9, сформированных для оценки переносимости исследуемых МБГС, статистически анализ данных не проводили.

Анализ данных, полученных в результате эксперимента, показал, что введение исследуемых образцов МБГС статистически значимо снижало интенсивность кровотечения. Однако полученные результаты не отличались между группами животных, получавших исследуемые препараты.

В результате исследования у всех животных, получивших тестируемый препарат МБГС 0103 в объеме 10 мл, наблюдали полную остановку кровотечения через 120 мин, что говорит о выраженном гемостатическом эффекте. Сформированный тромб был достаточно устойчивый, плотный и не разрушался при осмотре места кровотечения печени на 120-й и 180-й минуте.

У животных, получавших препараты МБГС 0102 и МБГС 0401, отсутствие кровотечения могли наблюдать через 180 мин. После введения препарата МБГС 0402 остановку кровотечения регистрировали лишь у 80% животных из группы (у 4 из 5 кроликов). Образовавшийся тромб после введения МБГС 0401 был устойчивым к механическим воздействиям во время осмотра кровотечения печени на 120-й и 180-й минуте. Тромбы, сформированные из тестируемых препаратов МБГС 0102 и МБГС 0402, легко разрушались, что приводило к возобновлению кровотечения.

У животных, которым ввели тестируемый препарат МБГС 0102 в объеме 10 мл после индукции травмы печени, наблюдали статистически значимое снижение ЧСС через 180 мин. У животных, получивших тестируемый препарат МБГС 0401 и МБГС 0402, регистрировали снижение систолического АД через 180 мин после формирования экспериментального кровотечения печени. Однако анализ данных примерного объема кровопотери, ЧСС, ЧДД, АД и показателей гематологического исследования не показал статистически значимого отличия между экспериментальными группами.

Таким образом, было установлено, что в результате моделирования травмы печени у животных кровотечение сохранялось на протяжении 3 ч наблюдения. В связи с этим наблюдали снижение ЧСС и АД через (60 - 120) мин после резекции срединной доли печени.

Исследование показало, что из четырех, тестируемых препаратов МБГС 0103 (ООО «НОВОПЛАСТ-М», Россия) оказал выраженное гемостатическое действие, при котором наблюдали остановку кровотечения через 120 мин после индукции травматического повреждения печени и отсутствие статистически значимого снижения ЧСС, ЧДД и АД у всех животных в группе. Остальные исследуемые препараты оказали менее выраженное действие на паренхиматозное кровотечение печени.

Полученные результаты не позволяют сделать однозначный выбор состава МБГС. В результате макроскопического исследования животных, проведенного в рамках оценки переносимости препаратов, после однократного введения всех тестируемых препаратов через 14 дней было выявлено образование спаек в брюшной полости и признаки перитонита. Таким образом, необходимо провести дополнительное исследование по выбору оптимального состава МБГС, а также биосовместимости разработанного состава препарата.

На основании полученных результатов были выбраны два состава МБГС:

МБГС 0103 (25% формиат хитозана) - оказал наиболее выраженное гемостатическое действие;

МБГС 0401 (5% лактат хитозана) - оказал менее выраженное гемостатическое действие в сравнении с МБГС 0103, но обеспечивал стабильный временный гемостаз.

Образовавшийся тромб после введения был устойчивым к механическим воздействиям во время осмотра кровотечения печени на 120-й и 180-й минуте. Тромбы, сформированные из препаратов МБГС 0102 и МБГС 0402, легко разрушались, что приводило к возобновлению кровотечения.

Для дальнейших испытаний предложено изменить состав МБГС 0103, приготовить составы гемостатического средства с меньшим содержанием формиата хитозана (15 и 20%). Полученные в результате эксперимента данные позволят оптимизировать состав МБГС 0103. Пример 2. Выбор оптимального состава и концентрации МБГС.

Для выбора оптимального состава и концентрации МБГС были проведены исследования на модели травматического повреждения печени у кроликов.

На испытание были предоставлены образцы гемостатических средств на основе соли хитозана - лактат и формиат. В таблице 5 представлены описание и состав исследуемых образцов.

В эксперимент были переданы клинически здоровые животные. Было использовано 53 кролика - самки породы советская шиншила (масса (3,21±0,23) кг). Каждому животному был присвоен индивидуальный номер, в соответствии с которым была нанесена отметка на ухо животного.

Перед проведением экспериментального исследования провели рандомизацию животных по группам, в таблице 6 представлено распределение животных на группы в сериях острых экспериментов.

Для всех животных были определены фоновые (физиологические) показатели, характеристика фоновых показателей экспериментальных групп представлена в таблице 7.

За 12 ч до начала эксперимента животным прекращали доступ к воде и корму. В день операции животных взвешивали на электронных весах «Карапуз» (ООО «МИДЛ С», Россия). Максимальный предел взвешивания - 20 ООО г, минимальный предел взвешивания - 100 г. Цена поверочного деления - 5 г. Класс точности - 3. Затем в экспериментальной операционной для индукции анестезии внутримышечно вводились тилетамина гидрохлорид и золазепама гидрохлорид (Zoletil®100) в дозировке 7,5 мг/кг и кслазина гидрхлорида (Xyla) в дозировке 0,15 мл/кг. Дополнительно в группах животных со сроками наблюдения одни и трое суток перед оперативным вмешательством внутримышечно вводили цефтриаксон из расчета 50 мг/кг (повторные введения через 24 и 48 ч в дозировке 20 мг/кг).

После наступления медикаментозного сна животное временно фиксировали на операционном столе в положении на животе, проводили пункцию ушной вены, осуществляли забор крови для общего анализа крови. Затем животное переворачивали на спину, фиксировали. Устанавливали электроды монитора витальных функций, с использованием ветеринарного тонометра «PetMap» измеряли артериальное давление.

Проводили подготовку операционного поля:

- удаление шерсти на животе животного;

- троекратная обработка кожи спиртовым раствором хлогексидина;

отграничение операционного поля стерильными салфетками.

Для оценки состояния животного наблюдали за изменением значений АД, ЧСС и ЧДД. Регистрировали значения данных показателей до начала оперативного вмешательства, а затем через 60 мин и перед релапаротомией на 120-й минуте после моделирования повреждения.

В случае выживания животного через 180 мин после нанесения повреждения, показатели регистрировались перед выведением животного из эксперимента. В группах суточного и трехсуточного наблюдения показатели фиксировались через 24, 48 и 72 ч соответственно.

Для оценки интенсивности кровотечения из экспериментальной раны печени использовали адаптированную под массу животного бальную шкалу интенсивности полостного кровотечения Validated Intraoperative Bleeding Scale (VIBe Scale):

- отсутствие кровотечения - 0 баллов;

- просачивание (капиллярное) - 1 балл;

- натекание (кровотечение из венул и артериол) - 2 балла;

- сильное кровотечение (из нецентральных венул и артериол) - 3 балла;

- струйное кровотечение (из вен и артерий) - 4 балла.

Исследование проводили, добившись кровотечения с интенсивностью 2-3 балла. Гематологические исследования проводили с использованием гематологического анализатора Abacus Junior 30ND, кровь забирали из краевой ушной вены животного.

Определяемые показатели:

- уровень гемоглобина;

- количество эритроцитов;

- количество лейкоцитов;

- количество тромбоцитов.

Гематологические показатели изучали: перед оперативным вмешательством, 180 мин наблюдения, через 24 ч, на вторые и третьи сутки, соответственно.

Объем излившейся в ходе эксперимента крови определяли гравиметрическим методом по разности масс. С этой целью в ходе исследования для осушения использовали предварительно взвешенные малые марлевые салфетки. После проведения эксперимента весь перевязочный материал собирали и взвешивали, по разности масс определяли количество излившейся крови. При расчете учитывали массу тромбов, извлеченных из брюшной полости и объем крови, взятый на операционном столе для анализов. На секции оценивали массу сгустков и жидкой крови, обнаруженных в брюшной полости.

В случае констатации смерти в течение первых 3 ч наблюдения (отсутствие электрической активности сердца по данным мониторинга ЭКГ на протяжении 5 и более минут) выносили заключение «Животное погибло в первые 3 часа». В остальных случаях делали заключение «Животное выжило в первые 3 часа». В случае констатации смерти после 3 ч наблюдения выносилось заключение «Животное погибло» и указывали сутки, на которые наступила смерь.

Оценку гемостатической эффективности проводили на основании анализа выживаемости, продолжительности жизни, зафиксированного объема кровопотери из экспериментальной раны печени, данные наблюдений представлены в таблице 8.

В целом объем кровопотери составил в контрольной группе (19±11) % от расчетного объема ОЦК. В опытной группе №1 этот показатель был на уровне (12±4) %, во второй опытной (9±3) % и статистически (р<0,05) отличался от показателей контрольной. В третьей опытной группе кровопотеря в среднем составила (10±9) %.

В опытных группах №1 и №2 все животные выжили в сроки, оговоренные протоколом настоящего исследования. В опытной группе №3 наблюдали случай неудачного гемостаза, когда на фоне острой массивной кровопотери до 33% ОЦК животное погибло на столе, сходный случай имел место в контрольной группе.

Учитывая особенности биологических объектов, использованных в работе (кролики очень чувствительны к кровопотере), отмечали закономерные реакции со стороны сердечнососудистой системы в виде падения артериального давления и тахикардии.

Через 3 ч артериальное давление у большинства животных нормализовалось, в первую очередь за счет тахикардии.

Изменения в показателях общего анализа крови (количество эритроцитов и тромбоцитов, концентрация гемоглобина, гематокрит) свидетельствовали о гемоконцентрации и не имели статистически значимых различий в группах.

В группах в первые 3 ч погибло три животных: два животных в контрольной группе, одно животное в опытной группе №3. Причина смерти - острая массивная кровопотеря с потерей более 30% ОЦК. Остальные животные выжили и были выведены из эксперимента в сроки, соответствующие программе исследования.

Результаты острого эксперимента свидетельствуют о гемостатической эффективности опытных образцов МБГС на модели ранения печени у кролика.

На фоне 66,7% летальности в первые 3 ч после нанесения повреждения в контрольной группе, в опытных группах №1 и №2 случаев гибели животных от острой кровопотери не было. В группе №3 летальность составила 11,1%. Сводные данные по оценке общебиологических критериев (выживаемость, средняя продолжительность жизни животных), косвенные и прямые данные по изменению интенсивности кровотечения из раны печени у кролика представлены в таблице 9.

Анализ данных таблицы 7 свидетельствует о надежном гемостазе (стабилизация САД, относительная стабилизация ЧСС, отсутствием гибели животных в посттравматическом периоде на фоне умеренной кровопотери) характерном в эксперименте с образцом МБГС 0401.

Представленные образцы МБГС обладают гемостатической активностью в модели ранения печени у кролика. Наибольшая скорость наступления гемостаза, характеризующаяся меньшей кровопотерей и отсутствием гибели животных, отмечена у рецептуры МБГС 0103 20%. Далее дополнительно была проведена оценка воздействия гемостатических средств на общее состояние животных в суточном и трехсуточном наблюдении, результаты которой показала рецептура МБГС 0401. Данный состав обеспечивает временный гемостаз и не оказывает воздействие на ткани и органы, находясь в брюшной полости до трех суток.

По результатам проведенных испытаний были выбраны два наиболее эффективных состава: 20 мас. % формиата хитозана для пасты и 5 мас. % лактата хитозана для геля.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гемостатическим средствам, а именно к местным биоразлагаемым гемостатическим средствам для остановки внутриполостного кровотечения. Гемостатическая композиция в виде пасты, содержащая формиат хитозана и воду. Технический результат состоит в обеспечении возможности остановки продолжающегося внутриполостного кровотечения у тяжелораненых и методики восстановления кровообращения у пациентов с травматической и нетравматической остановкой кровообращения. 1 ил., 9 табл., 2 пр.

Гемостатическая композиция в виде пасты, содержащая формиат хитозана и воду, отличающаяся тем, что содержит компоненты в следующих соотношениях, мас.%:

формиат хитозана 20 вода остальное