Штамм "SAT-3/Уганда/V" вируса ящура Aphtae epizooticae серотипа SAT-3 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 A61K39/135 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура серотипа SAT-3 и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

На сегодняшний день возбудитель ящура остается наиболее контагиозным патогеном парнокопытных и мозоленогих животных, является РНК(+)-содержащим вирусом, который относится к сфере Riboviria, царству Orthornavirae, типу Pisuviricota, классу Pisoniviricetes, отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-mouth disease virus. Длина нуклеиновой кислоты серотипа SAT-3 составляет около 8520 н.о. РНК возбудителя ящура кодирует 4 структурных белка: VP₁, VP₂, VP₃, VP₄ и множество неструктурных протеинов [1, 2, 3]. Выделяют 7 различных серотипов вируса ящура: O, А, Азия 1, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3, причем последний по-прежнему является серьезной угрозой Центральной и Южной части Африки [4]. Представители вируса ящура серотипов SAT-1, SAT-2 и SAT-3 были впервые идентифицированы в 1940-х годах [5, 6]. Все три серологических типа распространены в Африке к югу от Сахары и поражают в основном жвачных животных. Вспышки вирусов топотипа SAT-3 были связаны с передачей вируса домашнему скоту от диких животных, а передача, опосредованная африканскими буйволами, была подтверждена в Южной и Западной Африке [2, 6].

Генетически серотипы вируса ящура разделены на топотипы, генетические линии и даже сублинии, которые в суммарной форме записи обозначают полный генотип возбудителя ящура. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется наиболее высоким количеством нуклеотидных и аминокислотных замен по итогам анализа с помощью компьютерных программ биоинформатики, в частности, MEGA X [1, 2, 3].

Молекулярными биологами, которые детально исследуют геном вируса ящура, было сделано заключение, что самыми вариабельными областями белка VP₁ считаются участки в следующих диапазонах аминокислотных остатков: 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [4, 5, 6].

Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса в наибольшей степени подвержены реакции иммунной системы живого организма [5, 6].

Серотип SAT-3 включает в себя 5 следующих топотипов: I (SOUTHEAST ZIMBABWE, SEZ), II (WESTERN ZIMBABWE, WZ), III (NORTHWEST ZIMBABWE, NWZ), IV, V (East Africa, EA) [1, 6, 7].

По сравнению с европейскими и азиатскими серотипами представители вируса ящура серотипа SAT-3 претерпели относительно большое количество изменений с точки зрения структурных белков [7], но не так много изменений наблюдалось в неструктурных белках. Генетическое и антигенное разнообразие вируса ящура серотипа SAT-3 приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-3 и, в частности, генотипа SAT-3/V, представители которого распространяются на территории Центральной и Южной Африки [3].

Учитывая процесс развития и активного налаживания торгово-экономических взаимоотношений между Российской Федерацией и странами Африканского континента, высоки риски заноса изолятов серотипа SAT-3 на территорию нашей страны, что может серьезно угрожать биологической безопасности России в отношении возникновения ящура серотипа SAT-3 [8].

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, что в Намибии в 2011, 2019, 2020 гг. обнаружили возбудитель ящура генотипа SAT-3/II. Множество вспышек ящура серотипа SAT-3 зафиксировано в Зимбабве в 2013 г., ЮАР в 2015-2016 гг., Республике Зимбабве в 2015-2018 гг. При этом следует отметить, что представители генотипа SAT-3/V вируса ящура встречаются в основном на территории Центральной и Восточной Африки в частности Уганде. В настоящее время в мире встречаются изоляты и штаммы вируса ящура серотипа SAT-3 только трех топотипов: I, II и V, остальные не фиксируются несколько десятилетий, поэтому для производственных целей используют штаммы именно этих генотипов. Распространение ящура генотипа SAT-3/V является опасным и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-3/V.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа SAT-3, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «SAT-3 ZIM 4/81» (генотип SAT-3/I) (прототип) [9],

- штамм «SAT-3 Bech 1/65» (генотип SAT-3/II),

- штамм «SAT-3 ZIM/05/91/3» (генотип SAT-3/III).

В 2013 г. на территории Республики Уганда из патологического материала от крупного рогатого скота в результате лабораторно-диагностических исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» был выделен изолят вируса ящура. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм был охарактеризован и получил название - штамм «SAT-3/Уганда/V».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-3/V, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-3, в том числе, от штамма «SAT-3 ZIM 4/81» (прототип) [9].

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-3, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура.

Штамм вируса ящура «SAT-3/Уганда/V» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №503 - деп / 23-53 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура серотипа SAT-3.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. – Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического серотипа SAT-3. Примечание: Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР₁. Штамм «SAT-3/Уганда/V» на дендрограмме обозначен «SAT-3 UGANDA V».

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР1 штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура серотипа SAT-3;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР1 штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура серотипа SAT-3.

Штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура имеет следующую таксономию: семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип SAT-3, генотип SAT-3/V. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура относится к серотипу SAT-3. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются специфические антитела, выявляемые в реакции микронейтрализации, иммуноферментном анализе и реакции связывания комплемента.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-3/V (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса в высокочувствительной перевиваемой клеточной линии почки свиньи IB-RS-2 с помощью перекрестного исследования данного штамма возбудителя ящура со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «SAT-3 ZIM 4/81» (генотип SAT-3/I),

- штамм «SAT-3 Bech 1/65» (генотип SAT-3/II),

- штамм «SAT-3 ZIM/05/91/3» (генотип SAT-3/III).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-3, против 2,0 lg ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в реакции микронейтрализации (РМН) при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в log₂ SN₅₀. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности log₂ SN₅₀ титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7-10].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 – исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при < 0,3 – исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-3/Уганда/V» составили r₁ от 0,01 до 0,07: генотип SAT-3/I – 0,01; генотип SAT-3/II – 0,05; генотип SAT-3/III – 0,07, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-3.

Гено- и хемотаксономические характеристики

Штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,075×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,874×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,4% РНК и 68,6% белка. РНК возбудителя ящура является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Данные полипептидные молекулы, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных белков вируса ящура.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,468×10^-18 г. Плавучая плотность 1,46 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,45-7,80. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,0°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для мозоленогих и парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма

«SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных – крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных линиях.

При выделении изолята вируса ящура с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [7].

Биологические и вирусологические методы включали в себя метод выделения в клеточной линии и адаптацию изолята вируса ящура к ним.

Процесс выделения возбудителя ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали в соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 75,0 см², отмывали от ростовой среды и заражали 20%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в среде Игла MEM с 0,5% гидролизата лактальбумина. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 0,5%-ным раствором гентамицина. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой во флаконы вносили поддерживающую среду и инкубировали при температуре 37,0±0,1°C до появления цитопатического действия (ЦПД) в монослое культуры клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата.

При ЦПД не менее 95% клеток, флаконы подвергали процессу «замораживание-оттаивание», очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 1500 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 95-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности вируса ящура определяли с помощью разработанной ранее методики [11].

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 1, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности изолята вируса ящура к использованным клеточным линиям. В монослойной культуре клеток ПСГК-30 за 18 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:32 и титром инфекционной активности 7,55±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 24 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,08±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 24 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:32 и титром инфекционной активности 7,29±0,05 lg ТЦД₅₀/см³. Каждое исследование и культивирование проводили 12 раз. В итоге получен штамм «SAT-3/Уганда/V» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств. Таким образом, наибольший титр инфекционной активности вируса ящура указанного штамма достигнут при культивировании в монослойной клеточной линии ПСГК-30 за наименьшее время репродукции вируса, что важно для производственных целей при получении вирусной массы.

Пример 2. Исследование биологических свойств штамма «SAT 3/Уганда/V» вируса ящура на крупном рогатом скоте.

Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура на КРС проводили в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт на этапе второго пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учёт результатов титрования на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V». Титр инфекционной активности на КРС данного штамма вируса ящура на стадии первого пассажа на КРС составил 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго пассажа – 6,50 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 6,50 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Исследование биологических свойств штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура на свиньях.

Заражение свиней исходным штаммом «SAT 3/Уганда/V» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку указанного штамма вируса ящура на свиньях вели в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт второго пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учёт результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности на свиньях для штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 5,75 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго – 6,25 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» (2 пассаж на подсвинках) с титром инфекционной активности 6,25 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла MEM, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,50-7,70. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,005 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,1°С до достижения ЦПД вируса, соответствующего не менее 95%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность и содержание общего вирусного белка (ОВБ) и важнейшего иммуногенного компонента с коэффициентом седиментации 146S.

Полученные суспензии были стерильными. Концентрация ОВБ в суспензии составляла 2,33±0,10 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура отражены в таблице 2, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, равной 3,94±0,15 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/клетку и продолжительности репродукции вируса 14,20±0,42 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 9,69±0,14 lg ТЦД₅₀/см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [12]. Содержание данного компонента составило 65,75±0,50 % (1,53±0,07 мкг/см³, n = 12).

Пример 5. Определение типовой специфичности и активности штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура.

Исследование типовой специфичности и активности штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК). К полученному антигену штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток крови, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³ комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37,0±0,1°С. Затем вносили по 0,2 см³ гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37,0±0,1°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки крови, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали ящурные типоспецифические гипериммунные сыворотки крови морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура «SAT-3/Уганда/V» (предлагаемое изобретение), «SAT-3 ZIM 4/81», «А №2029/Турция/06», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/XIV/2023», комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН = 7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов «SAT 3/Уганда/V», «SAT3 ZIM 4/81» «А №2029/Турция/06», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/XIV/2023».

Результаты исследования отражены в таблице 3, из которой следует, что штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа SAT-3 и активен в РСК в разведении 1:64.

Пример 6. Получение антигена штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа SAT-3.

Для получения антигена штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа SAT-3 проводили суспензионное культивирование вируса в перевиваемой клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,00 lg ТЦД50/см3. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина (0,030%) и осветляли за счет полигексаметиленгуанидина (0,023%).

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 45 мин при 5000 об/мин и 4±2°С на центрифуге типа Bekman J2-21 (Beckman Coulter, USA) или аналоге. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Да (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорид натрия (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 18±1 ч. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин, осадок растворяли в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе, концентрируя в 10 раз (1/10 от первоначального объёма).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.

Для получения очищенного антигена штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Инактивированную суспензию вируса ящура наливали по 10 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 40 000 об/мин и температуре 4±2°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Опалесцирующий слой, содержащий очищенный антиген вируса ящура, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. Данную фракцию переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 40 000 об/мин и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа SAT-3 представлены в таблице 4. Анализ проводили для всех фракций, высокие значения оптической плотности наблюдали для 5-10 фракции с максимальными значениями для фракции № 8 (2,552±0,002 о.е.).

Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для отобранной фракции. Полученные результаты свидетельствовали, что 8-кратный антиген вируса ящура не содержал примесных белков.

С помощью реакции связывания комплемента определили концентрацию 146S компонента в полученном антигене, которая составила 15,30±0,25 мкг/см³ (n = 4, p<0,005), что достаточно для использования при изготовлении диагностических наборов для выявления антигена и антител против вируса ящура, а также для изготовления специфических препаратов для профилактики данного заболевания.

Полученный антиген использовали в качестве биопрепарата для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» в исследуемых пробах при изготовлении вакцинных препаратов. Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 305 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 305 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 212 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 212 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,80-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) – 98,28-100,00%, k-критерий – 1,000; общая точность (DAc) – 99,29-100,00%.

Таким образом, полученный антиген штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура применим для использования в качестве биопрепарата в диагностических тест-системах.

Пример 7. Применение антигена вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» для получения сывороток крови кролика против антигена штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура.

Для получения сыворотки крови кролика против антигена штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа SAT-3 применяли 20 клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли антиген вируса ящура, полученный как описано в примере 6, из которого готовили сложную эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG («Seppic», Р. Франция) (в соотношении адъювант/антиген = 70/30 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови, содержащую антитела против антигена штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура.

Полученные 20 сывороток крови кроликов проверяли в реакции связывания комплемента и определили, что их активность составила 1:7500-1:8000. Данные показатели являются высокими и достаточными (не менее 1:1000) для изготовления диагностических наборов по выявлению антигена и антител против вируса ящура.

Изготовленные сыворотки крови объединили в общий пул, провели лиофильную сушку и хранили при температуре 2-8°С. Таким образом, получили биопрепарат, который использовали для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V». Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 325 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 325 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 220 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК выявили, что из 220 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,87-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) – 98,34-100,00%, k-критерий – 1,000; общая точность (DAc) – 99,33-100,00%.

Таким образом, полученный антиген вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» применен как биопрепарат для изготовления вакцин для иммунизации лабораторных животных. Получен и проведен контроль качества сывороток крови кролика против антигена штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура, а также показано применение полученной сыворотки как биопрепарата для диагностики ящура генотипа SAT-3/V.

Пример 8. Применение антигена вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» для получения вакцины.

Из полученного антигена приготовили сорбированную вакцину для крупного рогатого скота. Провели иммунизацию вакциной в цельном виде 5 голов КРС. На 21 сутки после иммунизации отобрали кровь, получили сыворотки крови, которые исследовали на наличие антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» в РМН и ИФА. Результаты исследования отражены в таблице 5, из которой следует, что среднее значение титра вируснейтрализующих антител в РМН составило 7,90±0,14 log₂ SN₅₀ (положительно, ≥5,5 log₂ SN₅₀). В ИФА процент ингибиции был более 50% (среднее значение составило 83,14±2,81%), что свидетельствует о том, что все сыворотки были положительными. Таким образом, по двум реакциям получили согласованные результаты о наличии защитного количества антител против заражения вируса ящура гомологичным штаммом «SAT-3/Уганда/V». Следовательно, антиген данного штамма можно применять для создания вакцины, обеспечивающей защиту от ящура указанного штамма.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура Aphtae epizooticae серотипа SAT-3 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура».

1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th еd. Paris, May 2023. – Ch. 3.1.8.

2. Poonsuk K, Giménez-Lirola L, Zimmerman JJ. A review of foot-and-mouth disease virus (FMDV) testing in livestock with an emphasis on the use of alternative diagnostic specimens. Anim Health Res Rev. 2018 Dec;19(2):100-112.

3. Chestley T, Sroga P, Nebroski M, Hole K, Ularamu H, Lung O, Nfon C. Development of reverse-transcriptase, real-time PCR assays to distinguish the Southern African Territories (SAT) serotypes 1 and 3 and topotype VII of SAT2 of Foot-and-Mouth Disease Virus. Front Vet Sci. 2022 Sep 20;9:977761. doi: 10.3389/fvets.2022.977761. PMID: 36204292; PMCID: PMC9530708.

4. Жильцова М.В. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф… дис. кан. наук. – Владимир: 2008. – 23 с.

5. Fana EM, Mpoloka SW, Leteane M, Seoke L, Masoba K, Mokopasetso M, Rapharing A, Kabelo T, Made P, Hyera J. A Five-Year Retrospective Study of Foot-and-Mouth Disease Outbreaks in Southern Africa, 2014 to 2018. Vet Med Int. 2021 Dec 31;2021:7438809. doi: 10.1155/2021/7438809. PMID: 35003620; PMCID: PMC8741390.

6. Omondi GP, Gakuya F, Arzt J, Sangula A, Hartwig E, Pauszek S, Smoliga G, Brito B, Perez A, Obanda V, VanderWaal K. The role of African buffalo in the epidemiology of foot-and-mouth disease in sympatric cattle and buffalo populations in Kenya. Transbound Emerg Dis. 2020 Sep;67(5):2206-2221.

7. Tully DC, Fares MA. Shifts in the selection-drift balance drive the evolution and epidemiology of foot-and-mouth disease virus. J Virol. 2009;83:781–790. doi: 10.1128/JVI.01500-08.

8. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации /С. Р. Кременчугская, М. В. Жильцова, Т. К. Майорова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2012. – 36 с.

9. Jo HE, You SH, Choi JH, Ko MK, Shin SH, Song J, Jo H, Lee MJ, Kim SM, Kim B, Park JH. Evaluation of novel inactivated vaccines for the SAT 1, SAT 2 and SAT 3 serotypes of foot-and-mouth disease in pigs. Virol J. 2019 Dec 16;16(1):156. doi: 10.1186/s12985-019-1262-1. PMID: 31842907; PMCID: PMC6916012.

10. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А. В. Мищенко, В. А. Мищенко, В. В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. – 2014. - № 11. – С. 20-24.

11. Патент № 2674076 C1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135 С12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: № 2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

12. Патент № 2712769 C1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: № 2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

Таблица 1

Биологические свойства штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура при культивировании в клеточных линиях (предлагаемое изобретение)

(n=12)

Наименование клеточной линии Время проявления
биологической
активности, ч Количество адаптационных пассажей Характеристика адаптированного материала Активность в РСК Титр инфекционной активности вируса, lg ТЦД₅₀/см³ ПСГК-30 18 5 1:32 7,55±0,10 IB-RS-2 24 5 1:16 7,08±0,10 ВНК-21 24 5 1:16 7,29±0,05

Таблица 2

Оценка стабильности репродукции штамма «SAT 3/Уганда/V» вируса ящура (предлагаемое изобретение) в суспензионной перевиваемой культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH

(n=12, p<0,05)

№ п/п Концентрация клеток, млн/см³ Доза заражения, ТЦД₅₀/кл. Длительность репродукции, ч Титр инфекционной активности вируса, lg ТЦД₅₀/см³ Концентрация ОВБ, мкг/см³ Концентрация
146S компонента, мкг/см³ Содержание 146S компонента, % 1 3,7 0,005 14,5 9,45 2,15 1,42 65,8 2 3,9 0,005 14,5 9,65 2,31 1,50 65,0 3 3,9 0,005 14,5 9,65 2,30 1,53 66,6 4 3,9 0,005 13,5 9,65 2,28 1,50 65,9 5 4,0 0,005 14,0 9,80 2,40 1,56 65,0 6 3,9 0,005 14,5 9,60 2,28 1,50 66,0 7 3,9 0,005 14,0 9,65 2,30 1,52 65,9 8 3,9 0,005 14,5 9,68 2,35 1,53 65,3 9 4,3 0,005 14,5 9,95 2,53 1,67 66,0 10 4,0 0,005 13,5 9,83 2,41 1,59 66,0 M±m 3,94±0,15 0,005 14,20±0,42 9,69±0,14 2,33±0,10 1,53±0,07 65,75±0,50

Примечание: ОВБ – общий вирусный белок,

146S – иммуногенный компонент,

ТЦД – тканевая цитопатическая доза.

Таблица 3

Оценка типовой специфичности и активности штамма «SAT 3/Уганда/V» вируса ящура (предлагаемое изобретение) в РСК

Штаммы
вируса ящура

Сыворотки Штамм «SAT 3/Уганда/V» вируса ящура Контрольные штаммы вируса ящура 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 SAT-3/Уганда/V SAT-3 ZIM 4/81 А №2029/Турция/06 Азия-1/Таджикистан/2011 SAT-1 №96/62 SAT-2/XIV/2023 SAT-3 /Уганда/V ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ - ++++ - - - - - SAT-3 ZIM 4/81 +++- - - - - - - - ++++ - - - - А №2029/
Турция/06 - - - - - - - - - ++++ - - - Азия-1/
Таджикистан/
2011 - - - - - - - - - - ++++ - - SAT-1 № 96/62 - - - - - - - - - - - ++++ - SAT-2/XIV/2023 - - - - - - - - - - - - ++++ б/с - - - - - - - - - - - - б/а - - - - - - - - - - - -

Примечания: «++++» – четыре креста – 100%-ная задержка гемолиза;

«-» - полный гемолиз;

б/с – без сыворотки;

б/а – без антигена.

Таблица 4

Спектрометрическое исследование полученных фракций штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура (предлагаемое изобретение) как компонента биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа SAT-3

(n = 3, p<0,005)

№ фракции п/п Значение оптической плотности, у.е. 1 0,054±0,001 2 0,138±0,001 3 0,487±0,001 4 0,811±0,001 5 1,314±0,001 6 1,965±0,001 7 2,202±0,002 8 2,552±0,002 9 2,112±0,001 10 1,569±0,001 11 0,993±0,001 12 0,448±0,002 13 0,196±0,001 14 0,012±0,001

Таблица 5

Определение антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» после однократной иммунизации КРС на 21 сутки после вакцинации в реакции микронейтрализации и ИФА

(n = 3, p<0,005)

№ животного Титр вирусонейтрализующих антител против вируса ящура штамма «SAT 3/Уганда/V» в РМН, log₂ SN₅₀ Результаты ИФА процент ингибиции, % интерпретация 1 7,75 79,92 положительно 2 8,00 85,36 положительно 3 8,00 85,21 положительно 4 8,00 84,99 положительно 5 7,75 80,23 положительно M±m 7,90±0,14 83,14±2,81 5/5

Примечание: * - при дозе вируса, равной 2,0 lg ТЦД₅₀/мл,

РМН – реакция микронейтрализации (титр антител ≥5,5 log₂ SN₅₀ свидетельствует о серопозитивности),

ИФА – иммуноферментный анализ (процент ингибиции ≥50% свидетельствует о серопозитивности).

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="SAT 3 xml.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-03-21">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-03-21</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>576</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-03-21</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм «SAT- 3/Уганда/V» вируса

ящура Aphtae epizooticae серотипа SAT-3 для изготовления

биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура

</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>660</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..660</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttattatttgcaggcgagggcgctgacgtcgtctcgacgacagttgaga

cacacggcggcacagcgcaggttgcgcggcgccaacacacggacgtcgccttcttgctcgaccggttcac

tcacatcggaccggtaacaggtagcaagacactcgacctgctcacgaccaaagaacacacgatggtcgga

gccatccttcgctctgcaacatactacttctgtgatctggaggtggcagtccttggtgacgccgagcacg

ccgcttggatacccaacggatgccctgaggtgaacaacattgaggacaacccggtcgtctttgccaaggg

cggcgtggcgcgcttcgcgctgccctacaccgcaccacaccgggtactcgccacaatttacaacgggaca

tgtgtctacaagaaaaacgccccggtaacctctcgccgtggcgacctccaagttctgcaacaacgcgtgg

acgctgaacgcgagcggtgtatcccaacatcgttcaacttcggtcgtctctacgttgaatctggcaacct

ctatcttcgcatgaagagagcagagttgtactgtccacggtggctctttgtccgttacacgcacacgacg

gaccgccacaaggtgtcacttgtcaagccagaaaaacaactcgggtgtgcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>220</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..220</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>LLFAGEGADVVSTTVETHGGTAQVARRQHTDVAFLLDRFTHIGPVTGSK

TLDLLTTKEHTMVGAILRSATYYFCDLEVAVLGDAEHAAWIPNGCPEVNNIEDNPVVFAKGGVARFALPY

TAPHRVLATIYNGTCVYKKNAPVTSRRGDLQVLQQRVDAERERCIPTSFNFGRLYVESGNLYLRMKRAEL

YCPRWLFVRYTHTTDRHKVSLVKPEKQLGCA</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной вирусологии. Предложен штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-3/V, семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером № 503 - деп / 23-53 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Изобретение может быть использовано для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-3/V и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 1 ил., 5 табл., 8 пр.

Штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-3/V, семейства Picornaviridae, рода Aphthоvirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером № 503 - деп / 23-53 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», предназначенный для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-3/V.