Штамм "SAT-2/XIV/2023" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/XIV для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/XIV и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Ящур - особо опасное, карантинное, высококонтагиозное заболевание парнокопытных и мозоленогих животных, которое вызывает РНК(+)-содержащий вирус порядка Picornavirales семейства Picornaviridae рода Aphthovirus с длиной нуклеиновой кислоты около 8500 н.о., которая кодирует 4 структурных белка: VP₁, VP₂, VP₃, VP₄ и множество неструктурных протеинов [1, 2, 3]. Выделяют 7 различных серотипов вируса ящура: О, А, Азия-1, С и SAT-1, SAT-2, SAT-3, причем в последние годы активно распространяются представители серотипа SAT-2 [1].

В пределах одного генотипа вируса ящура имеет место явление мутационной изменчивости генома и, как следствие, строения и функций белковых молекул, что приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура.

Каждый из семи серотипов генетически разделен на различные топотипы. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности ID-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1, 2, 3]. Данный белок вируса ящура является наиболее изменчивым по своему аминокислотному составу, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями считаются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [4, 5]. Филогенетический анализ на основе нуклеотидной последовательности ID-гена (белок VP₁) широко используется для вывода эволюционной динамики, эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения возбудителя вируса ящура [6].

Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием поверхностных вирусных белков и факторов клеток-хозяев [5, 6].

По оценкам WOAH (Всемирная организация здравоохранения животных, основана как OIE), болезнь циркулирует у 77% мирового поголовья домашнего скота в Африке, на Ближнем Востоке и в Азии, а также на ограниченной территории Южной Америки [1]. В связи с чем существует риск заноса инфекции в страны, свободные от ящура без вакцинации. Борьба с ящуром заключается в проведении своевременных профилактических мероприятий, таких как эффективный эпидемиологический контроль за болезнью; вакцинирование против ящура домашних и сельскохозяйственных животных; надзор за передвижением диких парнокопытных животных в приграничных районах, подверженных риску проникновения возбудителя из стран, неблагополучных по ящуру; мониторинговые исследования по оценке иммунного статуса сельскохозяйственного и домашнего скота, включая ретроспективную диагностику ящура.

Для серотипа SAT-2 выделяют 14 топотипов (I - XIV), внутри которых нет разделения на генетические группы [1, 3]. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам при специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-2 и, в частности, генотипа SAT-2/XIV, представители которого активно распространяются на территории Африканского континента и теперь за ее пределами, в том числе в Азиатских странах. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении ящура генотипа SAT-2/XIV.

На территории Юго-Восточной, Южной, Восточной Азии вспышки ящура генотипа SAT-2/XIV теперь имеют спорадический характер. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи России со странами этого региона, в частности, Монголии, Китая, Индии и др., а также Африки. Исходя из этого, крайне высоки риски заноса изолятов данного генотипа на территорию Российской Федерации, что угрожает биологической безопасности нашей страны по ящуру.

На протяжении многих лет периодически фиксировали вспышки ящура генотипа SAT-2/XIV в странах Африки, однако в 2023 г. представители данного варианта вируса были обнаружены на территории Азиатского континента и Ближнего Востока, в частности, изоляты вируса ящура указанного генотипа были выделены в Иордании 02.2023, в Ираке 02.2023, Грузии 03.2023, Турции 03.2023, Омане 04.2023, Бахрейне 05.2023. Наличие торговых отношений Российской Федерации с этими государствами является угрожающим фактором в отношении распространения возбудителя ящура на территории нашей страны и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/XIV.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа SAT-2, которые применяются или использовались ранее в мире для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),

- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),

- штамм («SAT-2/ВОТ/Р3/98») (генотип SAT-2/III),

- штамм («SAT-2/ETH/1/90») (генотип SAT-2/IV),

- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),

- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),

- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),

- штамм («SAT-2/RWO/l/00») (генотип SAT-2/VIII),

- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),

- штамм («SAT-2/UGA/19/98») (генотип SAT-2/X),

- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),

- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/91») (генотип SAT-2/XIV) (прототип).

Изолят вируса ящура был выделен в результате лабораторно-диагностических исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из патологического материала, отобранного от крупного рогатого скота на территории Иорданского Хашимитского Королевства в августе 2023 года. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» был охарактеризован и получил название - штамм «SAT-2/XIV/2023».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу SAT-2/XIV вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, в том числе, от штамма «SAT-2/ETH/2/91».

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/XIV.

Штамм вируса ящура «SAT-2/XIV/2023» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №489 - деп / 23-39 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура генотипа SAT-2/XIV.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического серотипа SAT-2. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP₁.

Фиг. 2. - Данные гель-электрофореза очищенного препарата антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023». Примечание: 1 - маркер молекулярного веса, 2 - исследуемая проба препарата антигена вируса ящура.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов ID-гена белка VP₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT-2/XIV;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот ID-гена белка VP₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT-2/XIV.

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип SAT-2, генотип SAT-2/XIV. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 23 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура относится к серотипу SAT-2. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура ID-гена белка VP₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-2/XIV (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на производственные штаммы вируса ящура.

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-2/XIV/2023» составили r₁ от 0,01 до 0,27, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2 (табл. 1).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,079×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,84×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса, в том числе такой важный фермент как РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,44×10^-18 г. Плавучая плотность 1,47 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при рН 7,44-7,70. Сдвиги рН в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,7°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных линиях.

При выделении изолята вируса ящура с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [7].

Биологические и вирусологические методы включали в себя метод выделения в клеточной линии и адаптацию изолята вируса ящура к ним.

Процесс выделения возбудителя ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали в соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25,0 см², отмывали от ростовой среды и заражали 10%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хэнкса с 0,5% гидролизата лактальбумина по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором хлороформа. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при температуре 37,0±0,1°С во флаконы вносили по 5,0 см³ поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37,0±0,1°С до появления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата. При ЦПД не менее 95% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 95-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности вируса ящура определяли с помощью разработанной ранее методики [10].

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности изолята вируса ящура к использованным клеточным линиям. В монослойной культуре клеток ПСГК-30 за 13 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,31±0,10 lg ТЦД₅₀/СМ³. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 19 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,01±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 24 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,05±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. Каждое исследование и культивирование проводили 8 раз. В итоге получен штамм «SAT-2/XIV/2023» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств.

Пример 2. Исследование биологических свойств штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура на крупном рогатом скоте.

Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура на КРС проводили в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт на этапе второго пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учет результатов титрования на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023». Титр инфекционной активности на КРС данного штамма вируса ящура на стадии первого пассажа на КРС составил 5,25 lg ИД,₅₀/0,1 см³, второго пассажа - 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Исследование биологических свойств штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура на свиньях.

Заражение свиней исходным штаммом «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура на свиньях вели в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт второго пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учет результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности на свиньях для штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 5,75 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго - 6,50 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 /SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,44-7,70. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,005 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±01°С до достижения ЦПД вируса, соответствующего не менее 95%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента и общего вирусного белка (ОВБ). Полученные суспензии были стерильными. Концентрация ОВБ в суспензии составляла 2,83±0,12 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура отражены в таблице 3, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, равной 4,03±0,13 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/клетку и продолжительности репродукции вируса 11,45±0,37 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 9,53±0,16 lg ТЦД₅₀/см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [11]. Содержание данного компонента составило 68,66±0,64% (1,94±0,07 мкг/см³).

Пример 5. Определение типовой специфичности и активности штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура.

Исследование типовой специфичности и активности штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК). К полученному антигену штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³ комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37,0±0,1°С. Затем вносили по 0,2 см³ гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37,0±0,1°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура «А №2029/Турция/06», «SAT-2/XIV/2023» (предлагаемое изобретение), «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/ETH/2/91», «О №2311/Забайкальский/2016» комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН=7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов «А №2029/Турция/06», «SAT-2/XIV/2023» (предлагаемое изобретение), «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/ETH/2/91», «О №2311/Забайкальский/2016».

Результаты исследования отражены в таблице 4, из которой следует, что штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа SAT-2 и активен в РСК в разведении 1:32.

Пример 6. Получение, контроль качества и применение антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/XIV.

Для получения антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура как компонента биопрепарата при изготовлении средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/XIV проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли за счет полигексаметиленгуанидина.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4±2°С на центрифуге типа Bekman J2-21 (Beckman Coulter, USA) или аналоге. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорид натрия (сухой) до конечной концентрации 0,90%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 22±1 ч. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе, концентрируя в 10 раз (1/10 от первоначального объема).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.

Для получения очищенного антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Инактивированную суспензию вируса ящура наливали по 10 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 40 000 об/мин и температуре 4±2°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Опалесцирующий слой, содержащий очищенный антиген вируса ящура, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. Данную фракцию переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 40 000 об/мин. и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/XIV представлены в таблице 5. Анализ проводили для всех фракций, высокие значения оптической плотности наблюдали для 5-12 фракции с максимальными значениями для 8-11 пиков.

Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для отобранной фракции. Полученные результаты отражены на фиг. 2, из которой видно, что полученный очищенный антиген вируса ящура.

С помощью реакции связывания комплемента определили концентрацию 146S компонента в полученном антигене, которая составила 19,42±0,05 мкг/см³ (n=3, р<0,005), что достаточно для использования при изготовлении диагностических наборов для выявления антигена и антител против вируса ящура, а также изготовления специфических препаратов для профилактики данного заболевания.

Таким образом, проведены получение и контроль качества антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/XIV.

Полученный антиген использовали в качестве биопрепарата для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» в исследуемых пробах при изготовлении вакцинных препаратов. Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 655 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 655 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 159 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 159 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,44-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 97,71-100,00%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,55-100,00%.

Таким образом, полученный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура применим для использования в качестве биопрепарата в диагностических тест-системах.

Пример 7. Применение антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023», для получения сывороток крови кролика, как биопрепарата для диагностики ящура генотипа SAT-2/XIV.

Для получения сыворотки крови кролика против антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/XIV применяли 20 клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли антиген вируса ящура, полученный как описано в примере 6, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-71 R VG («Seppic», Франция) (в соотношении адъювант/антиген=70/30 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови, содержащую антитела против антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 4-8°С.

Полученные 20 сывороток крови кроликов проверяли в реакции связывания комплемента и определили, что их активность составила 1:9000-1:9500. Данные показатели являются высокими и достаточными для изготовления диагностических наборов по выявлению антигена и антител против вируса ящура.

Изготовленные сыворотки объединили в общий пул, провели лиофильную сушку и, таким образом, получили биопрепарат, который использовали для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023». Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 658 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 658 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 200 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 200 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,44-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,17-100,00%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,57-100,00%.

Таким образом, полученный антиген вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» применим для иммунизации животных как биопрепарат. Проведены получение и контроль качества сывороток крови кролика против антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, а также показано применение полученной сыворотки как биопрепарата для диагностики ящура генотипа SAT-2/XIV.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/XIV для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура».

1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2022. - Ch. 3.1.8.

2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

3. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexsandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson // J. Compr. Pathol. - 2003. - V. 129.-P. 268-282.

4. Жильцова M.B. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф… дис. кан. наук. - Владимир: 2008. - 23 с.

5. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

6. Анализ эпизоотической ситуации по ящуру в России с 2010 г. по март 2019 г. / В.П. Семакина, Т.П. Акимова, В.А. Мищенко, А.К. Караулов // Ветеринария. - 2019. - №11. - С. 16-20.

7. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура / А.А. Гусев, В.М. Захаров, Ж.А. Шажко и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир. 2002. - 31 с.

8. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации / С.Р. Кременчугская, М.В. Жильцова, Т.К. Майорова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». -Владимир, 2012. - 36 с.

9. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А.В. Мищенко, В.А. Мищенко, В.В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - №11. - С. 20-24.

10. Патент №2674076 С1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135 C12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: №2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

11. Патент №2712769 С1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: №2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="SAT-2 XIV

2023.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-08-24">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-08-16</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>532</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-08-16</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Никифоров Виктор

Викторович</InventorName>

<InventorNameLatin>Nikiforov Viktor Viktorivich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса

ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/XIV для изготовления

биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики

ящура</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>645</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..645</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacttcggccggtgagggcgctgacgtcgtgaccattgaccccacca

cacaaggcgggtccgtgacaccggccaggcgcatccacaccgatgtggcattccttctggaccgcagcac

gcacgtccacaccaacaagaccaccttcaacatcgacctcatggacacaaaggagaaggcactggtaggg

gccatactgcgctcagccacgtactacttctgtgacctggagatcgcgtgtgttggtgaacacaagaggg

tgttttggcaaccgaatggggcgcccagaacaacaacgctgggtgacaaccccatggtgtactcgcacaa

cggagtcactagatttgccattccgtacacggcaccgcaccggttgctttccactgtatacaacggtgag

tgcgactacaagaaagcctctaccgccatccgcggtgacagggccgtccttgcggccaagtacgctaaca

ccaagcacactctcccaagcactttcaactttggtcatgtgacggctgacgcacccgtcgacgtgtacta

taggatgaaacgtgctgagttgtactgtccacgcgctcttcttcccgcgtacgaccacgtgggacgtgac

agatttgacgcgccaattggagtggagagacaactc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGADVVTIDPTTQGGSVTPARRIHTDVAFLLDRSTHVHTNKTTF

NIDLMDTKEKALVGAILRSATYYFCDLEIACVGEHKRVFWQPNGAPRTTTLGDNPMVYSHNGVTRFAIPY

TAPHRLLSTVYNGECDYKKASTAIRGDRAVLAAKYANTKHTLPSTFNFGHVTADAPVDVYYRMKRAELYC

PRALLPAYDHVGRDRFDAPIGVERQL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/XIV, семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №489 - деп / 23-39 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура. Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21). В перевиваемой суспензионной культуре клеток почки сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 11,45±0,37 часов инкубирования концентрация 146S компонента штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура имеет средние значения 1,94±0,07 мкг/см³ (68,66±0,64%), сохраняя исходные характеристики при пассировании в новой перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Представленный штамм «SAT-2/XIV/2023» может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/XIV и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 2 ил., 5 табл., 7 пр.

Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae «SAT-2/XIV/2023», депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №489 - деп / 23-39 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/XIV.