Вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV Российский патент 2025 года по МПК A61K39/135 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV.

Ящур – острое вирусное заболевание из группы зоонозов, характеризующееся интоксикацией и везикулезно-эрозивным (пузырьково-язвенным) поражением слизистых оболочек ротовой и носовой полости, а также кожи межпальцевых складок и околоногтевого ложа [1].

Существует семь следующих серотипов вируса ящура: O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1, при этом представитель серотипа SAT-2 является распространенным на территории Африки, Ближнего Востока и с 2023 года в странах Азиатского континента, что определяет высокую актуальность изготовления вакцин для защиты от ящура данного серотипа.

При этом каждый из серотипов разделен на более чем 60 генотипов. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности высоковариабельного 1D-гена, который кодирует аминокислотную последовательность поверхностного белка VP₁ [2].

Восстановление после переболевания животным каким-либо одним генотипом не обеспечивает иммунную защиту против другого [3-5].

Поскольку вакцинация используется в качестве основного инструмента контроля в эндемичных районах, анализ каждого пула и генотипов в нем может подобрать наиболее специфичные вакцины, соответствующих топотипам, присутствующим в этом пуле, вместо того, чтобы продолжать полагаться на более широко доступные в настоящее время генетические вакцины.

Для серотипа SAT-2 выделяют 14 топотипов (I – XIV), внутри которых нет разделения на генетические группы [1, 3]. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-2 и, в частности, генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV, представители которых активно распространяются на территории Азии и Африки.

С целью недопущения возникновения ящура в хозяйствах Российской Федерации применяется комплекс мероприятий по борьбе и профилактике ящура, который направлен на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую вакцинацию животных в буферной зоне, проведение мониторинга иммунного статуса крупного, мелкого рогатого скота и свиней.

Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам, что подтверждено исследованиями многих ученых [6, 7, 8, 9, 10, 11].

Данная инфекция продолжает оставаться экономически значимой проблемой. Цельновирионные вакцины на сегодняшний день в отношении ящура по-прежнему признаются наиболее эффективными, что крайне важно для борьбы с самым контагиозным заболеванием в мире [8, 9, 12, 13].

Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной и безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной составляющей антиген вируса, соответствующей эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа. Создание подобных вакцин по-прежнему является крайне актуальной задачей. Достижение данной цели позволяет эффективно применять вакцину в неблагополучных регионах и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура с целью обеспечения ветеринарного благополучия [14, 15, 16].

Экстренная вакцинация является одной из нескольких мер, которые могут быть применены для борьбы при вспышке ящура. Это является ценным дополнением к применению основных мер зоосанитарного контроля, которые должны включать быструю диагностику, отслеживание, контроль за передвижением скота и дезинфекцию, а также убой инфицированных и контактирующих животных и их безопасное удаление. Критерии, определяющие успешное осуществление экстренной вакцинации, включают в себя доступ к вакцине, которая: 1) содержит штамм вируса ящура с достаточным антигенным родством по отношению к изолятам, циркулирующим в очаге; 2) относится к требуемому виду среди разработанных вакцин; 3) характеризуется приемлемой безвредностью и эффективностью; 4) имеет соответствующий доступ, в том числе объем партий и своевременность их поставок.

Планирование на случай непредвиденных обстоятельств должно включать обеспечение экстренной вакцинации и учитывать возможность сложных решений не только в отношении того, когда, где и как применять вакцину, но и экономическую целесообразность ее использования [8].

В литературных источниках указывают, что экстренная вакцинация крупного рогатого скота, овец и свиней может быть эффективной для профилактики заболевания в течение первых 4-5 дней после вакцинации. Данные исследования показывают, что риск распространения инфекции уменьшается по мере увеличения интервала между вакцинацией и заражением вирусом. Кроме того, вакцинация может уменьшить количество выделяемого вируса по сравнению с не иммунизированными животными [9, 10, 17].

На территории Африканского континента, а также Юго-Восточной, Южной, Восточной Азии вспышки ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV теперь имеют спорадический характер. Существуют крайне высоки риски заноса изолятов данных генотипов на территорию Российской Федерации, что угрожает биологической безопасности нашей страны по ящуру. Важно, для профилактики данного заболевания на указанных континентах, производить вакцину и вакцинацию для ранней защиты в условиях периодически возникающих вспышек ящура указанных генотипов.

Таким образом, возникла необходимость разработать вакцину культуральную инактивированную эмульсионную для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV для обеспечения биологической безопасности и ветеринарного благополучия территории Российской Федерации, сопредельных государств и стран, эндемичных по ящуру, которые будут использовать данный препарат для профилактики заболевания.

Изолят вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Государства Ливия в 2012 г. и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из Всемирной справочной лаборатории института Пирбрайта (the World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease, the Pirbright institute, Великобритания) для проведения научно-исследовательских и диагностических работ. Путем адаптации изолята к репродукции в первично-трипсинизированной культуре клеток СП, в перевиваемых культурах клеток ВНК-21, IB-RS-2, ПСГК-30, в организме свиней и крупного рогатого скота в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ» был получен штамм «SAT-2 Lib 39/2012». По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу SAT-2/VII/Lib-12 вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 (Фиг. 1).

Изолят вируса ящура был выделен в результате лабораторно-диагностических исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из патологического материала, отобранного от крупного рогатого скота на территории Иорданского Хашимитского Королевства в августе 2023 г. Изолят был охарактеризован и получил название – штамм «SAT-2/XIV/2023». По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу SAT-2/XIV вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 (Фиг. 1).

Известна вакцина против ящура генотипа SAT-2/VII из штамма «SAT-2/Eritrea/1998» культуральная инактивированная сорбированная [17], содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного ворзбудителю ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъюванта гидроокиси алюминия и сапонина: концентрация антигена в количестве не менее 3,5 мкг, содержание адъюванта гидроокиси алюминия – 4,4% в пересчете на сухое вещество, сапонина в количестве 1,9 мг, добавка в виде поддерживающей среды – до 2,0 см³.

В данной вакцине используется штамм вируса ящура генотипа SAT-2/VII, но вакцина сорбированная.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная эмульсионная [18], содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «SAT-2/XIV/2023», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде масляного адьюванта DMIXVAC 76 V: концентрация антигена в количестве не менее 5,0 мкг, содержание масляного адьюванта DMIXVAC 76 V – 70%, добавка в виде поддерживающей среды – до 10 см3 (прототип) [18].

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его низкой иммуногенной активности относительно появившихся штаммов/изолятов вируса ящура генотипа SAT-2/XIV и отсутствие защиты от ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV на ранних этапах – на 4 сутки после вакцинации.

Для решения указанной проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV. Данная вакцина предполагает высокое содержание 146S иммуногенного компонента вируса ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV в дозе препарата.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала культуральных инактивированных эмульсионных вакцин для ранней защиты против вируса ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в 2,0 см³ препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» (генотип SAT-2/VII/Lib-12) и «SAT-2/XIV/2023» (генотип SAT-2/XIV) вируса ящура, репродуцированных в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 15,0 мкг каждого; 2) масляный адъювант DMIXVAC 78 V («Дмитриевский химический завод», РФ), обеспечивающий усиление иммунного ответа у животных с содержанием 70% по массе,
3) поддерживающая среда – до 2,0 см³.

Штамм вируса ящура «SAT-2/XIV/2023» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №489 – деп / 23-39 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм вируса ящура «SAT-2 Lib 39/2012» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №361 – деп / 21-22 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Указанные штаммы адаптированы к первично-трипсинизированным монослойным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы предпочтительно используют перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Хэнкса без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5,0% от общего объема при рН среды 7,50-7,70. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,035% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,040% от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штаммов «SAT-2/XIV/2023» (генотип SAT-2/XIV) и «SAT-2 Lib 39/2012» (генотип SAT-2/VII) вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура каждого генотипа. Концентрацию компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [19, 20].

Для создания вакцины используют вирусный материал, содержащий в
2,0 см³ не менее 15,0 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура каждого генотипа генотип SAT-2/XIV и SAT-2/VII. Заявленную концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall.

Вакцину культуральную инактивированную эмульсионную для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV получают путем смешивания очищенного антигена и масляного адъюванта DMIXVAC 78 V в соотношении 30% и 70% по массе, соответственно. Полученная вакцина представляет собой стабильную простую обратную эмульсию белого или бледно-розового цвета, содержащую инактивированный 146S компонент вируса ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV, который обеспечивают формирование специфического иммунитета.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штаммов
«SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII и «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII и «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII и штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII и штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура каждого штамма в количестве не менее 15,0 мкг в 2,0 см³ готового вакцинного препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант DMIXVAC 78V.

4. Вакцина содержит масляный адъювант DMIXVAC 78 V в количестве 70% (по массе) в 2,0 см³ готового препарата.

5. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII и штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, полученный предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, масляный адъювант DMIXVAC 78 V, добавка в готовом препарате объемом 2,0 см³ в виде поддерживающей среды в следующих количествах:

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII вируса ящура не менее 15,0 мкг Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура не менее 15,0 мкг Масляный адъювант DMIXVAC 78 V 70% (по массе) Поддерживающая среда до 2,0 см³

Предлагаемая вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной эмульсионной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII и «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленных генотипов, которые в последние годы вызывают вспышки в странах Азии и Африки.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении.

Фиг. 1 – Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа SAT-2. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР₁.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР₁ штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура генотипа SAT-2/VII/Lib-12;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР₁ штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура генотипа SAT-2/VII/Lib-12.

SEQ ID NO:3 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT-2/XIV;

SEQ ID NO:4 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT-2/XIV.

Штамм «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура имеет следующую таксономию: семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип SAT-2, генотип SAT-2/VII/Lib-12. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура относится к серотипу SAT-2. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-2/VII/Lib-12 (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),

- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),

- штамм («SAT-2/BOT/P3/98») (генотип SAT-2/III),

- штамм («SAT-2/ETH/1/90») (генотип SAT-2/IV),

- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),

- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),

- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),

- штамм («SAT-2/RWO/1/00») (генотип SAT-2/VIII),

- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),

- штамм («SAT-2/UGA/19/98») (генотип SAT-2/X),

- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),

- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/91») (генотип SAT-2/XIV).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9, 20, 21].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом: при ≥0,3 – исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными; при <0,3 – исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма. Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-2 Lib 39/2012» составили r₁ от 0,01 до 0,25, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура является РНК(+) – содержащим вирусом с молекулярной массой 8,085×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,854×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса, в том числе такой важный фермент как РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,452×10^-18 г. Плавучая плотность 1,475 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,45-7,70. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,8°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность – антиген реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность – антиген не патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность – антиген не вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность – сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных – крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура имеет следующую таксономию: семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип SAT-2, генотип SAT-2/XIV. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 23 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура относится к серотипу SAT-2. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-2/XIV (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),

- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),

- штамм («SAT-2/BOT/P3/98») (генотип SAT-2/III),

- штамм («SAT-2/ETH/1/90») (генотип SAT-2/IV),

- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),

- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),

- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),

- штамм («SAT-2/RWO/1/00») (генотип SAT-2/VIII),

- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),

- штамм («SAT-2/UGA/19/98») (генотип SAT-2/X),

- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),

- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/91») (генотип SAT-2/XIV).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9, 20, 21].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом: при ≥0,3 – исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными; при <0,3 – исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма. Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-2/XIV/2023» составили r₁ от 0,01 до 0,27, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура является РНК(+) – содержащим вирусом с молекулярной массой 8,079×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,84×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса, в том числе такой важный фермент как РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,44×10^-18 г. Плавучая плотность 1,47 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,44-7,70. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,7°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность – антиген реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность – антиген не патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность – антиген не вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность – сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных – крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного вирусом генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки безопасной и эффективной вакцины для ранней защиты.

Получена безопасная и эффективная вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования

Провели анализ первичной структуры гена 1D (белок VP₁) вакцинных штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа SAT-2. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами/штаммами (19 представителей) вируса ящура серотипа SAT-2.

Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP₁ вируса ящура вакцинных штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» с другими изолятами и штаммами.

Последовательность нуклеотидов гена белка VР₁ штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII/Lib-12 вируса ящура представлена SEQ ID NO:1. Последовательность аминокислот 1D-гена, кодирующего белок VР₁ штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII/Lib-12 вируса ящура отражена на SEQ ID NO:2.

Последовательность нуклеотидов гена белка VР₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура представлена SEQ ID NO:3. Последовательность аминокислот 1D-гена, кодирующего белок VР₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура отражена на SEQ ID NO:4.

Осуществлен филогенетический анализ для вакцинных штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура. Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA 6 и алгоритма Neighbor-Joining [21]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (увеличили со стандартных 100 до 1000 повторов для высокой степени достоверности), показан рядом с ветвями [22, 23]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [24] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 19 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность 1D-гена вакцинных штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [25].

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁) вакцинных штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1). Таким образом, штамм «SAT-2 Lib 39/2012» относится к генотипу SAT-2/VII/Lib-12, штамм «SAT-2/XIV/2023» – к генотипу SAT-2/XIV, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 10%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт КРС (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,20-0,25 млн кл./см³, доза заражения вирусом – 0,001 ТЦД₅₀/кл.

По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 18 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 5,90±0,10 до 7,45±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,45±0,10 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,28±0,02 до 0,90±0,02 мкг/см³. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (0,90±0,02 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 99,14 до 100,00%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.

По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 14 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 6,01±0,10 до 7,75±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,75±0,10 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,32±0,02 до 0,96±0,02 мкг/см³. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (0,96±0,02 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 99,02 до 100,00%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.

Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» в промышленных масштабах

В процессе промышленного культивирования штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса по поддерживающей среде, температурному фактору и дозе заражения исследуемым вирусом клеток.

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,0% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DМЕМ; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса. Посевная концентрация клеток составляла 0,20 млн кл./см³, доза заражения вирусом – 0,1000-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 – 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя не менее 85%. Результаты репродукции штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 1 и 2.

Из данных таблицы 1 видно, что при репродукции штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Хэнкса, позволяющая за 13-14 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 1,08±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности 7,80±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании среды RPMI-1640 и Игла DMEM показатели репродукции вируса были ниже.

Из таблицы 2 видно, что при репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Хэнкса, позволяющая за 13-14 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 1,25±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности 7,91±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании среды RPMI-1640 и Игла DMEM показатели репродукции вируса были ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Игла DМЕМ с 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Культивирование вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 85-100% в течение 13-25 ч (табл. 1). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой за 13-14 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 1,08±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности вируса 7,80±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Культивирование вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 85-100% в течение 13-24 ч (табл. 2). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой за 13-14 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 1,25±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности вируса 7,91±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммами «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» в отдельности при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла DМЕМ с 2% сыворотки крови КРС.

Репродукцию вируса ящура штамма «SAT-2/ Lib 39/2012» проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 13-23 ч до специфического разрушения клеток на 85-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 1, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл. и составило 1,08±0,02 мкг/см³ с титром инфекционной активности вируса 7,80±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Репродукцию вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 13-19 ч до специфического разрушения клеток на 90-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл. и составило 1,25±0,02 мкг/см³ с титром инфекционной активности вируса 7,91±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры их репродукции в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда – среда Хэнкса; 2) температурный режим культивирования – 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом – 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в промышленных масштабах

При промышленном культивирования штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температурные условия и дозу заражения вирусом.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию данных штаммов вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см³. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,2°С, доза заражения вирусом – 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%.

Результаты суспензионного культивирования штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 3.

Как следует из таблицы 3, при культивировании вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см³ составило 0,96±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,0 млн кл./см³ – 1,23±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,5 млн кл./см³ – 1,56±0,02 мкг/см³, и с концентрацией 4,0 млн кл./см³ – 1,60±0,02 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура достаточной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 3,5 млн кл./см³ (при концентрации 4,0 млн кл./см³ концентрация незначительно выше, но затраты на производство по количеству клеток выше, исходя из этого, экономически целесообразно использовать концентрацию клеток, равную 3,5 млн кл./см³). Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 8,15±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Результаты суспензионного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 4.

Как следует из таблицы 4, при культивировании вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см³ составило 1,14±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,0 млн кл./см³ – 1,40±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,5 млн кл./см³ – 2,23±0,02 мкг/см³, и с концентрацией 4,0 млн кл./см³ – 2,32±0,02 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура достаточной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 3,5 млн кл./см³ (при концентрации 4,0 млн кл./см³ концентрация незначительно выше, но затраты на производство по количеству клеток выше, исходя из этого, экономически целесообразно использовать концентрацию клеток, равную 3,5 млн кл./см³). Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 8,45±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

На следующем этапе работы исследовали влияние температурного фактора на репродукцию штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензионной культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного не менее 90% (приоритет отдавали полной специфической деструкции клеток).

По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,2^°С, при которой в течение 12-13 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (1,56±0,02 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 8,15±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой в течение 12-13 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (2,23±0,02 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 8,45±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С до цитопатического действия, равного не менее 90%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура.

Как видно из данных таблицы 3, наибольшее накопление 146S компонента вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. (1,56±0,02 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 8,15±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Наибольшее накопление 146S компонента вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. (2,23±0,02 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 8,45±0,10 lg ТЦД₅₀/см³ (табл. 4).

Таким образом, проведено изучение трех параметров суспензионного культивирования штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах.

Выявлены оптимальные условия репродукции штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH: 1) концентрация клеток перед заражением – 3,5 млн кл./см³; 2) температурный режим культивирования – 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом – 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,2°С), в вируссодержащие суспензии добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,035%. Инактивацию вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С с периодическим перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления 1,2-АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 5, из данных которой видно, что полная инактивация вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» в отдельности, репродуцированного в культиваторах, произошла через 5 часов после внесения 1,2-АЭЭИ.

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. Для штамма «SAT-2 Lib 39/2012» концентрация 146S компонента составила 1,54±0,02 мкг/см³, для штамма «SAT-2/XIV/2023» – 2,20±0,02 мкг/см³.

Пример 6. Подбор условий очистки суспензий вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023»

Суспензии вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023», полученные при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,035, 0,040 и 0,045%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура указанных штаммов в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов.

Результаты анализа отражены в таблице 6, из которой следует, что в результате очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» с помощью ПГМГ в концентрации 0,035% отмечали снижение концентрации балластного белка на 4%, иммуногенных компонентов – на 0,3%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,040% наблюдали снижение количества балластного белка на 15%, 146S компонента – на 1,2%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,045% содержание балластного белка уменьшалось на 25%, а иммуногенных компонентов – на 7%.

В результате очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» с помощью ПГМГ в концентрации 0,035% отмечали снижение концентрации балластного белка на 5%, иммуногенных компонентов – на 0,4%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,040% наблюдали снижение количества балластного белка на 17%, 146S компонента – на 1,3%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,045% содержание балластного белка уменьшалось на 27%, а иммуногенных компонентов – на 8%.

Таким образом, исследуя условия очистки антигена штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,040%.

Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023»

Культуральную инактивированною суспензию штамма «SAT-2 Lib 39/2012», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 40 раз по объему, а штамма «SAT-2/XIV/2023» – в 28 раз. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall в течение 3 ч при рабочем давлении на фильтр 2,2-2,3 атм.

До и после процесса концентрирования суспензий антигена вируса ящура определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Из данных таблицы 7 видно, что при концентрировании антигена штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 33 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 35 раз. Применяя метод концентрирования с помощью тангенциальной фильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензии в 39,6 раз.

При концентрировании антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 22 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 25,5 раз. Применяя метод концентрирования с помощью тангенциальной фильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензии в 27,8 раз.

Таким образом, технология тангенциальной фильтрации позволила получить антиген вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» с высокой концентрацией 146S компонента для получения вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV. Полученные концентраты объединили в соотношении 1:1.

Пример 8. Подбор соотношения антиген-адъювант

Для изготовления получения вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV в качестве адъюванта выбран масляный адъювант DMIXVAC 78 V в количестве 70% по массе. Антиген составлял 30% по массе (по 15% на каждый антиген).

Пример 9. Компоновка вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV

Из полученного концентрата антигена вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» изготовили вакцину культуральную инактивированную эмульсионную для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV с применением масляного адъюванта DMIXVAC 78 V. Количество 146S иммуногенного компонента в дозе 2,0 см³ вакцины 146S компонента вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» составило 18,06 и 18,10 мкг/см³ соответственно.

Пример 10. Иммунизация животных вакциной культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV

Из полученной вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV (предлагаемое изобретение) был приготовлен ряд разведений для свиней с 5-ти кратным шагом. 15 голов свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу животных (№№ 1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу свиней (№№ 6-10) привили вакциной, разведенной 1/5, третья группа животных (№№ 11-15) – вакциной, разведенной 1/25. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации.

Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура

Сыворотки крови от свиней, полученные до иммунизации и через 14 суток после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK^®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 8 для каждого заявленного штамма вируса ящура в отдельности, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови свиней < 50%).

Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV (предлагаемое изобретение)

Для определения авирулентности вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно свиньям по 0,1 см³. В исследовании использовали свиней породы ландрас массой 30-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта на животных проводили путём внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см³ (тройная доза по 2,0 см³). Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 40,3°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток, что не выходит за рамки нормы после введения вакцинного препарата.

По результатам исследований вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV (предлагаемое изобретение) была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV (предлагаемое изобретение) по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных

На 4 и 7 сутки после введения вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV (предлагаемое изобретение) у свиней отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3].

Выявлено, что у свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител против штамма «SAT-2/VII/Lib-12» на 4 сутки после иммунизации составили 5,40±0,14 log₂ SN₅₀, с разведением 1/5 (5 голов) – 4,05±0,11 log₂ SN₅₀, с разведением 1/25 (5 голов) – 2,90±0,29 log₂ SN₅₀ (табл. 9). Средние значения титра антител против штамма «SAT-2/VII/Lib-12» на 7 сутки после иммунизации составили 7,75±0,18 log₂ SN₅₀, с разведением 1/5 (5 голов) – 5,05±0,21 log₂ SN₅₀, с разведением 1/25 (5 голов) – 4,40±0,22 log₂ SN₅₀.

Выявлено, что у свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител против штамма «SAT-2/XIV/2023» на 4 сутки после иммунизации составили 5,75±0,25 log₂ SN₅₀, с разведением 1/5 (5 голов) – 4,30±0,33 log₂ SN₅₀, с разведением 1/25 (5 голов) – 3,30±0,33 log₂ SN₅₀ (табл. 10). Средние значения титра антител против штамма «SAT-2/XIV/2023» на 7 сутки после иммунизации составили 8,00±0,25 log₂ SN₅₀, с разведением 1/5 (5 голов) – 5,40±0,29 log₂ SN₅₀, с разведением 1/25 (5 голов) – 4,55±0,37 log₂ SN₅₀.

Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log₂ SN₅₀), что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 14. Изучение защитной способности вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV (предлагаемое изобретение), методом контрольного заражения естественно восприимчивых животных

Свиньи, иммунизированные в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «SAT-2 Lib 39/2012», другие 15 голов – вирусом ящура штамма «SAT-2/XIV/2023», адаптированного к этим животным в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.

Результаты контрольного заражения представлены в таблицах 9 и 10, из которой следует, что вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV (предлагаемое изобретение) в цельном виде, а также в разведениях 1/5 и 1/25, введенная в однократной дозе (2,0 см³) защищает свиней от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).

По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины для каждого из заложенных в препарат штаммов антигена вируса ящура содержится 55,9 ПД₅₀ и 0,036 ИмД₅₀ для свиней.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023», в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить раннюю эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотических штаммов вируса ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV, циркулирующих в странах Африки и Азии. Кроме того, вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV изготовлена с применением масляного адъюванта DMIXVAC 78 V отечественного производства («Дмитриевский химический завод», РФ).

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV»

1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru/directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 01.06.2024).

2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 05.06.2024).

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals – 24th Ed. – Paris, 2023 – Vol. 1, Chapter 2.1.5. – P. 166-169.

4. Бурдов А. Н., Дудников А. И., Малярец П. В. и др. Ящур. – М.: Агропромиздат, 1990. – 320 с.

5. Пономарев А. П., Узюмов В. Л., Груздев К. Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. — Владимир: Фолиант, 2006. – 250 с.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. – October 2002. – V. 25. – P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its causal agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. – Paris, 2003. – p. 13-21.

8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J. M. Pachecoa, Т. Doel [et.al.] // Vaccine. – December 2005. – V. 23. – P. 5775-5782.

9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. – October 2002. – V. 25. – P. 345-364.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. – February 2002. – V. 20. – P. 1505-1514.

11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease – URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reports.htm (Дата обращения 09.05.2024).

12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. – April 1998. – V. 16. – Р. 746-754.

13. Рахманов А.М. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля // Ветеринарная медицина, 2013. – С. 37-38.

14. Longjam N., Tayo T. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. – 2011. – Vol. 4(10). – P. 475-479.

15. Мельник Р.Н., Хаустова Н.В., Мельник Н.В., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. – 2019. – №3. – С.29-31.

16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston B. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy / Phil. Trans. R. Soc. B (2009) 364. – P. 2657–2667.

17. Патент на изобретение № 2804875 «Вакцина против ящура генотипа SAT-2/VII из штамма «SAT-2/Eritrea/1998» культуральная инактивированная сорбированная» / приоритет изобретения: 11 мая 2023 г., заявка № 2023112437.

18. Патент на изобретение № 2824660 «Вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная эмульсионная» / приоритет изобретения: 03 апреля 2024 г., заявка № 2024108919.

19. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Утв. 21.09.17.

20. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир: 2017. – 24 с.

21. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.

22. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.

23. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

24. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

25. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. – 2002. – V. 25. – P. 345-364.

Таблица 1

Результаты адаптации штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура при культивировании в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 в разных условиях

(n=3, M±m, p<0,01)

Параметр Условия культивирования Время репродукции, ч ЦПД, % Концентрация 146S частиц по данным ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³ Титр инфекционной активности, lg ТЦД₅₀/см³ Состав поддерживающей среды Среда Игла DМЕМ+ 2% S_КРС 24-25 95-100 0,42±0,02 6,15±0,10 Среда RPMI-1640 + 2% S_КРС 23-24 95-100 0,65±0,02 6,54±0,10 Раствор Хэнкса с 5 % ГБК + 2% S_КРС 13-14 95-100 1,08±0,02 7,80±0,10 Температура, °С 35,0±0,2 24-25 85-90 0,60±0,02 6,48±0,10 36,0±0,2 19-20 85-90 0,45±0,03 6,17±0,10 37,0±0,2 13-14 95-100 1,08±0,02 7,80±0,10 38,0±0,2 18-19 95-100 0,70±0,02 6,63±0,10 Доза заражения 0,1-0,01 15-16 90-95 0,70±0,02 6,61±0,10 0,01-0,001 13-14 95-100 1,08±0,02 7,80±0,10 0,001-0,0001 22-23 85-90 0,50±0,02 6,11±0,10

Примечание: S_КРС – сыворотка крови крупного рогатого скота,

ГБК – гидролизат белков крови,

DМЕМ – название среды Игла,

RPMI-1640 – название культуральной среды,

ЦПД – цитопатическое действие.

Таблица 2

Результаты адаптации штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура при культивировании в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 в разных условиях

(n=3, M±m, p<0,01)

Параметр Условия культивирования Время репродукции, ч ЦПД, % Концентрация 146S частиц по данным ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³ Титр инфекционной активности, lg ТЦД₅₀/см³ Состав поддерживающей среды Среда Игла DМЕМ+ 2% S_КРС 24-25 95-100 0,50±0,02 6,30±0,10 Среда RPMI-1640 + 2% S_КРС 22-23 95-100 0,71±0,02 6,50±0,10 Раствор Хэнкса с 5 % ГБК + 2% S_КРС 13-14 95-100 1,25±0,02 7,91±0,10 Температура, °С 35,0±0,2 23-24 85-90 0,60±0,02 6,42±0,10 36,0±0,2 20-21 90-95 0,75±0,03 6,59±0,10 37,0±0,2 13-14 95-100 1,25±0,02 7,91±0,10 38,0±0,2 17-18 95-100 0,85±0,02 6,78±0,10 Доза заражения 0,1-0,01 14-15 90-95 0,85±0,02 6,61±0,10 0,01-0,001 13-14 95-100 1,25±0,02 7,91±0,10 0,001-0,0001 18-19 90-95 0,79±0,02 6,55±0,10

Примечание: S_КРС – сыворотка крови крупного рогатого скота,

ГБК – гидролизат белков крови,

DМЕМ – название среды Игла,

RPMI-1640 – название культуральной среды,

ЦПД – цитопатическое действие.

Таблица 3

Результаты репродукции штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разной концентрацией клеток

(n=3, M±m, p<0,01)

Параметр Условия культивирования Время репродукции, ч ЦПД, % Концентрация 146S частиц по данным ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³ Титр инфекционной активности, lg ТЦД₅₀/см³ Концентрация клеток перед заражением, млн кл./см³ 2,5 11-12 95-100 0,96±0,02 7,45±0,10 3,0 12-13 95-100 1,23±0,02 7,96±0,10 3,5 12-13 95-100 1,56±0,02 8,15±0,10 4,0 14 95-100 1,60±0,02 8,20±0,10 Температура, °С 35,0±0,2 21-22 90-95 0,42±0,02 6,01±0,10 36,0±0,2 16-18 90-95 1,20±0,02 7,92±0,10 37,0±0,2 12-13 95-100 1,56±0,02 8,15±0,10 38,0±0,2 15-16 95-100 1,10±0,02 7,72±0,10 Доза заражения 0,1-0,01 15 95-100 0,80±0,02 6,70±0,10 0,01-0,001 12-13 95-100 1,56±0,02 8,15±0,10 0,001-0,0001 20-21 90-95 0,95±0,02 7,45±0,10

Примечание: ОТ-ПЦР-РВ – обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция,

ТЦД – тканевая цитопатическая доза,

ЦПД – цитопатическое действие.

Таблица 4

Результаты репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разной концентрацией клеток

(n=3, M±m, p<0,01)

Параметр Условия культивирования Время репродукции, ч ЦПД, % Концентрация 146S частиц по данным ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³ Титр инфекционной активности, lg ТЦД₅₀/см³ Концентрация клеток перед заражением, млн кл./см³ 2,5 11-12 95-100 1,14±0,02 7,62±0,10 3,0 12-13 95-100 1,40±0,02 8,10±0,10 3,5 12-13 95-100 2,23±0,02 8,45±0,10 4,0 15 95-100 2,32±0,02 8,57±0,10 Температура, °С 35,0±0,2 23-24 90-95 0,50±0,02 6,01±0,10 36,0±0,2 15-16 90-95 1,40±0,02 8,08±0,10 37,0±0,2 12-13 95-100 2,23±0,02 8,45±0,10 38,0±0,2 15-16 95-100 1,45±0,02 8,14±0,10 Доза заражения 0,1-0,01 13-14 95-100 1,49±0,02 8,19±0,10 0,01-0,001 12-13 95-100 2,23±0,02 8,45±0,10 0,001-0,0001 17-18 90-95 1,15±0,02 7,61±0,10

Примечание: ОТ-ПЦР-РВ – обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция,

ТЦД – тканевая цитопатическая доза,

ЦПД – цитопатическое действие.

Таблица 5

Исследование кинетики инактивации суспензий вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023»

(n=3, M±m, p<0,05)

Время отбора проб с момента инактивации, ч Титр инфекционной активности вируса ящура, lg ТЦД₅₀/см³ штамм «SAT-2 Lib 39/2012» штамм «SAT-2/XIV/2023» 0 8,15±0,10 8,50±0,10 1 5,80±0,10 6,00±0,10 2 3,76±0,10 4,00±0,10 4 1,50±0,10 1,75±0,10 5 0 0 12 -12,00 -12,00

Таблица 6

Содержание компонентов вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» в суспензиях до и после очистки

(n=3, M±m, p<0,005)

Название штамма До очистки Концен-трация ПГМГ, % После очистки концентрация балластного белка, мг/см³ концентрация 146S компонента, мкг/см³ концентрация балластного белка, мг/см³ концентрация 146S компонента, мкг/см³ SAT-2 Lib 39/2012 10,25 1,54 0,035 9,84 1,53 0,040 8,71 1,52 0,045 7,69 1,43 SAT-2/XIV/2023 9,87 2,20 0,035 9,38 2,19 0,040 8,19 2,17 0,045 7,90 2,02

Примечание: концентрацию балластного белка определяли по формуле Калькара:

С=1,45 × А₂₈₀-0,74 × А₂₆₀,

где А₂₈₀ – значение оптической плотности при длине волны 280 нм,

А₂₆₀ – значение оптической плотности при длине волны 260 нм,

ПГМГ – полигексаметиленгуанидин (флокулянт).

Таблица 7

Содержание компонентов антигена вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023» в суспензиях до и после концентрирования

(n=3, M±m, p<0,01)

Название штамма Концентрация 146S компонента до концентрирования, мкг/см³ Методы концентрирования Концентрация 146S компонента после концентрирования, мкг/см³ SAT-2 Lib 39/2012 1,52 ПЭГ-6000,
4 ч 50,16 ПЭГ-6000,
12 ч 53,20 Тангенциальная фильтрация,
3 ч 60,19 SAT-2/XIV/2023 2,17 ПЭГ-6000,
4 ч 47,74 ПЭГ-6000,
12 ч 55,34 Тангенциальная фильтрация,
3 ч 60,33

Примечание: ПЭГ – полиэтиленгликоль,

ОВБ – общий вирусный белок.

Таблица 8

Результаты исследования сывороток крови свиней на антитела к неструктурным белкам вируса ящура до и после вакцинации препаратом (предлагаемое изобретение), изготовленным с применением антигена вируса ящура штаммов «SAT-2 Lib 39/2012» и «SAT-2/XIV/2023»

№ жив-о п/п Значение оптической плотности пробы Процент ингибиции (PI), % тип образца референс-значения до вакцинации на 14 сутки после вакцинации тип образца референс-значения до вакцинации на 14 сутки после вакцинации СПК 0,404 -//- СПК 59,56 -//- ПК 0,052 ПК 94,80 ОК 0,999 ОК 0,000 1 -//- 0,952 0,912 -//- 4,705 8,709 2 0,953 0,916 4,605 8,308

Примечание: СПК – слабоположительный контроль,

ПК – положительный контроль,

ОК – отрицательный контроль, сыворотка отрицательная при PI, меньшим 50%.

Таблица 9

Исследование гуморального иммунитета и иммуногенной активности вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV на свиньях

(анализ для штамма «SAT-2 Lib 39/2012»)

(n=5, p<0,01, M±m)

Наименование штамма для контрольного заражения Разведение вводимой вакцины № животных п/п Титр антител в РМН, log₂ SN₅₀ Результаты контрольного заражения, проведенного на 7 сутки ИмД₅₀/ПД₅₀ 4 сутки после вакцинации 7 сутки после вакцинации SAT-2 Lib 39/2012 без разведения 1 5,50 8,00 ─ 0,036/
55,9 2 5,50 7,50 ─ 3 5,25 7,75 ─ 4 5,25 7,75 ─ 5 5,50 7,75 ─ M±m 5,40±0,14 7,75±0,18 0/5 1/5 6 4,00 5,25 ─ 7 4,00 5,25 ─ 8 4,25 4,75 ─ 9 4,00 5,00 ─ 10 4,00 5,00 ─ M±m 4,05±0,11 5,05±0,21 0/5 1/25 11 3,00 4,50 ─ 12 3,00 4,50 ─ 13 3,25 4,50 ─ 14 2,50 4,50 ─ 15 2,75 4,00 ─ M±m 2,90±0,29 4,40±0,22 0/5 контроль 1 ─ + контроль 2 ─ +

Примечание: «-» отсутствие генерализации процесса ящура,

РМН – реакция микронейтрализации,

ИмД₅₀ – иммуногенная доза,

ПД₅₀ – протективная доза.

Таблица 10

Исследование гуморального иммунитета и иммуногенной активности вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV на свиньях

(анализ для штамма «SAT-2/XIV/2023»)

(n=5, p<0,01, M±m)

Наименование штамма для контрольного заражения Разведение вводимой вакцины № животных п/п Титр антител в РМН, log₂ SN₅₀ Результаты контрольного заражения, проведенного на 7 сутки ИмД₅₀/ПД₅₀ 4 сутки после вакцинации 7 сутки после вакцинации SAT-2/XIV/2023 без разведения 1 5,50 8,00 ─ 0,036/
55,9 2 5,50 8,25 ─ 3 6,00 7,75 ─ 4 6,00 7,75 ─ 5 5,75 8,25 ─ M±m 5,75±0,25 8,00±0,25 0/5 1/5 6 4,00 5,75 ─ 7 4,25 5,25 ─ 8 4,75 5,50 ─ 9 4,00 5,00 ─ 10 4,50 5,50 ─ M±m 4,30±0,33 5,40±0,29 0/5 1/25 11 3,50 5,00 ─ 12 3,75 4,50 ─ 13 3,25 4,50 ─ 14 3,00 4,75 ─ 15 3,00 4,00 ─ M±m 3,30±0,33 4,55±0,37 05 контроль 1 ─ + контроль 2 ─ +

Примечание: «-» отсутствие генерализации процесса ящура,

РМН – реакция микронейтрализации,

ИмД₅₀ – иммуногенная доза,

ПД₅₀ – протективная доза.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена вакцина против ящура культуральная инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество - смесь из двух штаммов вируса ящура: авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII/Lib-12, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №361 - деп / 21-22 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 15,0 мкг; и авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №489 - деп / 23-39 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 15,0 мкг; и адъювант - отечественный масляный адъювант DMIXVAC 78 V с содержанием 70% по массе готового препарата и поддерживающую среду - до 2,0 см³ готового препарата. Изобретение обеспечивает расширение арсенала культуральных инактивированных эмульсионных вакцин для ранней защиты против эпизоотических штаммов вируса ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV, циркулирующих в странах Африки и Азии. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 10 табл., 14 пр.

1. Вакцина против ящура культуральная инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество и адъювант, и в качестве активного вещества она содержит смесь из двух штаммов вируса ящура: авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII/Lib-12, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №361 - деп / 21-22 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 15,0 мкг; и авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №489 - деп / 23-39 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 15,0 мкг; в качестве адъюванта содержит отечественный масляный адъювант DMIXVAC 78 V с содержанием 70% по массе готового препарата и поддерживающую среду - до 2,0 см³ готового препарата.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII/Lib-12 и штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую 146S иммуногенный компонент вируса ящура генотипов SAT-2/VII/Lib-12 и SAT-2/XIV, в соотношении 1:1.

3. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII/Lib-12 и штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV и масляный адъювант DMIXVAC 78 V в соотношении 30% на 70% по массе.