Способ оценки бактериальной биоплёнки Российский патент 2022 года по МПК G01N33/52 C12Q1/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, инфекционным болезням, дезинфектологии, касается анализа бактериальных биопленок и может быть использовано для оценки состава биопленок грамположительных и грамотрицательных бактерий на различных биотических и абиотических поверхностях.

Биопленки - это микробные ассоциации, представляющие собой непрерывный мультислой бактериальных клеток, прикрепленных к поверхности раздела фаз и друг к другу и заключенных в экзополисахаридный матрикс. Этот экзополисахаридный матрикс (ЭПМ или внеклеточное полимерное вещество) синтезируется самими бактериями биопленки после их адгезии к поверхности и защищает микроорганизмы от внешних воздействий. Внеклеточный матрикс составляет 80-90% массы биопленки, а бактерии - 10-20% [Смирнова Т.А., Диденко Л.В., Азизбекян P.P., Романова Ю.М. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок //Микробиология. - 2010. - Т. 79, - №4. - С. 435-446.]. ЭПМ обеспечивает прочное прикрепление биопленки к различным поверхностям и является основным маркером ее зрелости и выраженности. Бактерии в прикрепленном состоянии, интегрированные в биопленку, защищены от повреждающих факторов внешней среды и антибактериальных и дезинфицирующих препаратов. По некоторым данным, до 80% инфекционной патологии человека связано с образованием биопленок. Отмечена роль микробных конгломератов в возникновении и развитии более чем 65% инфекций, связанных с медицинской помощью [Randall D. Wolcott, Garth D. Ehrlich. Biofilms and chronic infections//JAMA: 2008; 299(22). 2682-2684.].

Актуальность биопленки в патогенезе инфекционного процесса, санитарно-эпидемиологических исследованиях и дезинфекционных мероприятиях обосновывает необходимость использования лабораторных способов ее анализа.

В известных способах анализа биопленки способность бактерий к формированию биопленки оценивается по уровню адсорбции красителя этанолом при определенной экспозиции, измеренному на фотометре при определенной длине волны. В качестве красителя используют 0,1% водный раствор генцианвиолета [O'Toole, G.A. Microtiter dish biofilm formation assay//J. Vis. Exp. - 2011, 47.- P. 2437; Карпова Т.Н., Дронина Ю.Е., Алексеева H.B., Романова Ю.М., Тартаковский И.С.Формирование биопленок Legionella spp.в эксперименте // Журнал микробиологии - 2008. - №1. - С. 1-7.; патент РБ №20326 С1, 30.08.2016.]. Однако известные способы не позволяют оценивать компонентный состав биопленок

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ оценки состава биопленок грамположительных бактерий [Патент РФ №2688215 С1, 21.05.2019.], включающий окраску 0,1%-водным раствором генцианвиолета при экспозиции 5 минут, а затем раствором Люголя при экспозиции 2 минуты с последующей двухэтапной элюацией 70% спиртом, состав биопленок оценивают по формуле:

М=(ОП_бв/ОП₁₅)×100, Кб=100-М, где

М - доля матрикса, %,

Кб - доля клеточной составляющей, %,

ОП_бв - оптическая плотность проб, когда спирт для растворения окрашенного продукта выдерживают не более 1 минуты,

ОП₁₅ - оптическая плотность проб, когда спирт для растворения окрашенного продукта выдерживают 15 минут.

Технической проблемой, решаемой изобретением, является способ оценки состава биопленки микроорганизмов.

Поставленная задача достигается разработкой способа оценки состава биопленки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Технический результат заключается в том, что заявляемый способ оценки состава биопленки грамположительных и грамотрицательных бактерий позволяет отдифференцировать внеклеточные вещества и структуры матрикса биопленки, исключает влияние естественной седиментации на формирование биопленки, что обеспечивает повышение чувствительности, точности и верифицируемости.

Указанный технический результат достигается стимулированием биопленкообразования и дифференциальным окрашиванием клеточной составляющей и матрикса с использованием 0,1% водного раствора генцианвиолета и 0,5% раствора конго красного с оценкой состава биопленки по оригинальным формулам.

Способ осуществляется следующим образом.

Суточные культуры бактериальных клеток, культивируемых на стандартной жидкой питательной среде, разводят в стерильном физиологическом растворе (рН 7,2) до концентрации 1-10 в соответствии со шкалой Мак Фарланд. 96 луночный стерильный планшет условно разделяют на две половины и в каждой половине вносят по 200 мкл бактериальной взвеси не менее 4 повторностей на каждый вариант эксперимента. Контролем в каждой половине служат 4 лунки со стерильным физиологическим раствором. После инкубации в течение 40 минут в оптимальных для роста бактерий температурных условиях взвесь удаляют переворотом и энергичным встряхиванием с последующим добавлением во все лунки, включая контрольные, по 200 мкл стерильного физиологического раствора (рН 7,2) и инкубацией в оптимальных для роста бактерий температурных условиях в течение 24 часов. Контрольный замер спектра поглощения всех лунок проводят при длине волны 540 нм. Затем жидкость из планшета удаляют переворотом и энергичным встряхиванием. Однократно отмывают физиологическим раствором для удаления планктонных клеток и в лунки одной половины добавляют по 150 мкл 0,1% раствора генцинвиолета, в лунки другой половины - 0,5% раствора конго красного с последующей инкубацией в темноте при комнатной температуре в течение 40 минут. Несвязавшийся краситель отмывают троекратно дистиллированной водой, в каждую лунку добавляют по 200 мкл 96%-ного этанола и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 40 минут. Повторный замер спектров поглощения проводят для генцианвиолета при длине волны 540 нм, для конго красного- 490 нм. Состав биопленки оценивают по следующим формулам:

, где:

СрОп_{Генциан} - среднее арифметическое от результатов замера всех лунок данной культуры, окрашенных генцианвиолетом

СрОп₁ - среднее арифметическое от результатов замера всех лунок данной культуры, полученных при замерах до окрашивания

, где:

СрОп_{КонгоРед} ^_ среднее арифметическое от результатов замера всех лунок данной культуры, окрашенных конго красным

СрОп₁ - среднее арифметическое от результатов замера всех лунок данной культуры полученных при замерах до окрашивания

, где:

S_км - доля клеточной составляющей, в процентах

О_пк - оптическая плотность после окраски генцианвиолетом

О_пм - оптическая плотность поле окраски конго красным

Значения Оп берутся как среднее от всех лунок серии, за вычетом контроля.

Доля матрикса (S_м) оценивается в процентах по формуле:

S_м=100-S_км

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Суточную бульонную культуру Staphylococcus aureus АТСС 29213 разводили в стерильном физиологическом растворе (рН 7,2) до концентрации 3×10⁸ клеток/мл. 96 луночный стерильный планшет условно разделяли на две половины и в каждой половине в 4 лунки на культуру вносили по 200 мкл бактериальной взвеси. Контролем служили 4 лунки со стерильным физиологическим раствором в каждой половине. После инкубации в течение 40 минут в оптимальных для роста бактерий температурных условиях взвесь удаляли переворотом и энергичным встряхиванием с последующим добавлением во все лунки, включая контрольные, по 200 мкл стерильного физиологического раствора (рН 7,2) и инкубацией в оптимальных для роста бактерий температурных условиях в течение 24 часов. Контрольный замер спектра поглощения всех лунок проводили при длине волны 540 нм. Затем жидкость из планшета удаляли переворотом и энергичным встряхиванием. Однократно отмывали физиологическим раствором для удаления планктонных клеток и в лунки одной половины добавляли по 150 мкл 0,1% раствора генцинвиолета, в лунки другой половины - 0,5%о раствора конго красного с последующей инкубацией в темноте при комнатной температуре в течение 40 минут. Несвязавшийся краситель отмывали троекратно дистиллированной водой, в каждую лунку добавляли по 200 мкл 96%-ного этанола и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 40 минут. Повторный замер спектров поглощения проводили для генцианвиолета на длине волны 540 нм, для конго красного - 490 нм. Для штамма S.aureus АТТС 29213 получили следующие результаты: О_пк - 22,1, О_пм - 2,14, S_км - 90,3%, S_м - 9,7%. Такое соотношение матрикса и клеточной составляющей соответствовал норме для стафилококков.

Пример 2. Суточную культуру Escherichia coli АТСС 25922 разводили в стерильном физиологическом растворе (рН 7,2) до концентрации 3×10⁸ клеток/мл. 96 луночный стерильный планшет условно разделяли на две половины и в каждой половине в 4 лунки на культуру вносили по 200 мкл бактериальной взвеси. Контролем служили 4 лунки со стерильным физиологическим раствором в каждой половине. После инкубации в течение 40 минут в оптимальных для роста бактерий температурных условиях взвесь удаляли переворотом и энергичным встряхиванием с последующим добавлением во все лунки, включая контрольные, по 200 мкл стерильного физиологического раствора (рН 7,2) и инкубацией в оптимальных для роста бактерий температурных условиях в течение 36 часов. Контрольный замер спектра поглощения всех лунок проводили при длине волны 540 нм. Затем жидкость из планшета удаляли переворотом и энергичным встряхиванием. Однократно отмывали физиологическим раствором для удаления планктонных клеток и в лунки одной половины добавляли по 150 мкл. 0,1%) раствора генцинвиолета, в лунки другой половины - 0,5% раствора конго красного с последующей инкубацией в темноте при комнатной температуре в течение 40 минут. Несвязавшийся краситель отмывали троекратно дистиллированной водой, в каждую лунку добавляли по 200 мкл 96% -ного этанола и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 40 минут. Повторный замер спектров поглощения проводили для генцианвиолета на длине волны 540 нм, для конго красного - 490 нм. Для штамма E.coli АТТС 25922 получены следующие результаты: О_пк - 39,9; О_пм - 5,4; S_км - 86,4%, S_м - 15,6%. Такое соотношение матрикса и клеточной массы соответствовало норме для начальной стадии биопленкообразования грамотрицательных бактерий.

Проведенные исследования подтвердили осуществимость способа и достижение технического результата.

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, инфекционным болезням, дезинфектологии, и касается способа оценки состава биопленки. Формируют биопленки исследуемой культуры внесением бактериальной взвеси в лунки полистиролового планшета с последующей инкубацией в оптимальных для роста бактерий температурных условиях, внесение в половину лунок 0,1%-водного раствора генцианвиолета с его экстракцией 96%-ным этанолом и фотометрированием при длине волны 560 нм. Инкубацию осуществляют в течение 40 мин с последующим удалением микробной взвеси и внесением во все лунки планшета по 200 мкл стерильного физиологического раствора и инкубацией в течение 24-36 ч, внесением в половину лунок 0,5% раствора конго красного с экстракцией спиртом и последующим фотометрированием при длине волны 490 нм, а состав биопленок оценивают по формулам. Использование способа позволяет отдифференцировать внеклеточные вещества и структуры матрикса биопленки, исключает влияние естественной седиментации на формирование биопленки, что обеспечивает повышение чувствительности, точности и верифицируемости. 2 пр.

Способ оценки состава бактериальной биопленки, включающий формирование биопленки исследуемой культуры внесением бактериальной взвеси в лунки полистиролового планшета с последующей инкубацией в оптимальных для роста бактерий температурных условиях, внесение в половину лунок 0,1%-ного водного раствора генцианвиолета с его экстракцией 96%-ным этанолом и фотометрированием при длине волны 560 нм, отличающийся тем, что инкубацию осуществляют в течение 40 мин с последующим удалением микробной взвеси и внесением во все лунки планшета по 200 мкл стерильного физиологического раствора и инкубацией в течение 24-36 ч, внесением в половину лунок 0,5%-ного раствора конго красного с экстракцией спиртом и последующим фотометрированием при длине волны 490 нм, а состав биопленок оценивают по формулам:

,

где СрОп_{Генциан} - среднее арифметическое от результатов замера всех лунок данной культуры, окрашенных генцианвиолетом,

СрОп₁ - среднее арифметическое от результатов замера всех лунок данной культуры полученных при замерах до окрашивания

,

где СрОп_{КонгоРед} - среднее арифметическое от результатов замера всех лунок данной культуры, окрашенных конго красным,

СрОп₁ - среднее арифметическое от результатов замера всех лунок данной культуры, полученных при замерах до окрашивания

,

где S_км - доля клеточной массы в процентах,

Оп_к - оптическая плотность после окраски генцианвиолетом,

Оп_м - оптическая плотность поле окраски конго красным,

причем значения Оп берутся как среднее от всех лунок серии за вычетом контроля, а доля матрикса оценивается в процентах по формуле:

S_м=100-S_км.