Способ оценки специфической активности бактериофага c использованием клеточных культур Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/70 C12Q1/02 C12Q1/18 

Изобретение относится к области медицины, микробиологии, биологии. Сущность способа сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой результатов по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток проводят совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим бактериофагом в объеме 0,2 мл, результат учитывают в течение 1 часа. Использование способа позволяет проводить оценку эффективности лечебно-профилактического бактериофага в меньшем объеме препарата - 0,2 мл и сократить время проведения реакции до 1 часа.

За последние годы практически не появилось новых антибактериальных препаратов (АБП), в то время как устойчивость к «старым» АБП неуклонно растет и во многих случаях уже достигла критической отметки. В этой связи ключевыми задачами являются разработка и внедрение в клиническую практику дополнительных средств борьбы с инфекционными заболеваниями, в качестве которых, несомненно, можно рассматривать бактериофаги.

Доступность и эффективность фаготерапии находит все более широкое применение этого метода в клинической практике, включая тяжелые формы инфекционной патологии, так как антимикробный эффект бактериофагов обусловлен внедрением их в бактериальную клетку без нарушения нормальной микрофлоры. Простота культивирования, короткий период генерации, высокий выход фагового потомства и возможность точного количественного учета способствуют не только успешно решать многие проблемы молекулярной генетики и общей вирусологии, но и позволяют широко использовать бактериофаги с диагностической и лечебно-профилактической целью при оказании медицинской помощи.

При этом актуальным в клинической практике является получение быстрого результата, поскольку постановка реакции по оценке фагочувствительности установленного патогена дополнительно требует определенного времени.

В настоящее время известен способ определения чувствительности выделенного микроорганизма к бактериофагу путем посева бактериальной культуры на агаризиванную питательную среду (Методические рекомендации «Принципы использования бактериофагов для борьбы с инфекциями с оказанием медицинской помощи» М. 2014 г.). О чувствительности бактериальной культуры к фагу судят по образованию зон лизиса в местах нанесенной на плотную питательную среду суспензии бактериофага. Результаты оценивают по пятибалльной шкале (по количеству «крестов»): «++++» прозрачная зона лизиса без колоний вторичного роста, «+++» зона лизиса с единичными колониями вторичного роста, «++» образование зоны лизиса с большим количеством колониями вторичного роста, «+» низкая активность, «-» отсутствие литической активности.

Недостатками этого способа является постановка теста в искусственно созданных условиях на синтетических питательных средах (in vitro) и получение результата через 18-24 часов.

Техническим результатом представленного изобретения является приближение условий культивирования к организму человека (in vivo), а также быстрота получения ответа с меньшими затратами.

Ближайшим прототипом изобретения является патент № 2296163 от 2012 г. «Способ оценки специфической активности бактериофагов» (авторы: Тихолов Р.М., Афиногенова А.Г., Кравцов А.Г., Афиногенов Г.Е.).

Сущность способа сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование в течение 2 часов тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебным бактериофагом или комбинированным (поливалентным) бактериофагом, в состав которого входит соответствующий используемой тест-культуре микроорганизма фаг, а результат оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма по сравнению с контролем.

Недостатками метода является объем бактериофага (1,8 мл), что экономически затратно и постановка эксперимента в течение 2-х часов, что не позволяет отнести представленную методику к экспресс-методу диагностики.

Результат изобретения достигается за счет того, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток по сравнению с контролем проводят совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебно-профилактическим бактериофагом или комбинированным (поливалентным) бактериофагом в объеме 0,2 мл в течение 1 часа.

Способ осуществляется следующим образом.

Из пробирок на покровное стекло с монослоем легочных фибробластов (ЛЭЧ-3) эмбриона человека, сливают ростовую среду и добавляют 0,2 мл препарата бактериофага и 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в дозе 10⁸ КОЕ/мл. Пробирки с покровным стеклом инкубируют 1 часа при 37 ± 1 °С, периодически встряхивая. Затем клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий 3-х кратно ФР (фосфатным буфером с pH 7,2). Препараты (покровное стекло) фиксируют 96° спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Исследуют микроскопически, определяя степень инфицированности монослоя сравнительно с контролем. В контрольной пробирке с покровным стеклом с монослоем ЛЭЧ-3 проводят совместное ингибирование 0,2 мл поддерживающей среды Игла МЕМ с 0,2 мл суточной культуры тест-штамма. Интенсивность процесса адгезии оценивают по следующим показателям: 1) индекс адгезии (ИА) выражают средним числом бактериальных клеток на одной эукариотической клетке; 2) процент пораженных клеток монослоя (ПК%); 3) обсемененность 100 клеток монослоя - микробную нагрузку (МН) - определяют по формуле МН=ИА×ПК%. Процент адгезии микроба определяют по показателю микробной нагрузки относительно контроля, принимаемого за 100%.

В качестве примера использовали официальные препараты стафилококковый, синегнойный бактериофаг (псевдомонас аеругиноза) и экспериментальную серию бактериофага «Дифаг» против Аcinetobacter baumannii и Pseudomonas aeriginosa.

Пример 1. Определение бактериолитической активности препаратов: стафилококкового бактериофага в отношении S.aureus №456, синегнойного бактериофага против Ps.aeriginosa № 461, двухкомпонентного бактериофага «Дифаг» в отношении A. baumannii № 31 на культуре клеток (КК) ЛЭЧ-3. Среда для культивирования тест-микроорганизма - мясо-пептонный бульон (МПБ), для культивирования фибробластов - питательная среда Игла МЕМ.

В пробирку на покровное стекло с монослоем ЛЭЧ- 3 наносят 0,2 мл суточной культуры соответствующего микроорганизма в дозе ~1,5х10⁸ КОЕ/мл (0,5 по МакФарланду) с добавлением 0,2 мл бактериофага с литической активностью 10^-5-^-7 (опытный инокулят). В качестве контрольного инокулята использовали смесь 0,2 мл питательной среды Игла МЕМ с 0,2 мл суточной тест-культуры соответствующего микроорганизма в той же дозе, помещенную в пробирку на покровное стекло с монослоем ЛЭЧ-3. Пробирки инкубировали 1 часа при t 37 ± 1 °С, периодически встряхивая, затем клетки монослоя отмывали от неприкрепившихся микроорганизмов 3-х кратно ФР, фиксировали 96° этиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя и процент адгезии микроба по сравнению с соответствующим контролем без бактериофага по показателю микробной нагрузки (таблица 1,2,3).

Таблица 1.

Адгезивная активность S.aureus в присутствии специфического стафилококкового бактериофага.

Показатели процесса адгезии S.aureus ИА ПК% МН % адгезии от контроля опыт: КК + бактерий +бактериофаг 10 10 100 1,3 контроль: КК+ бактерий 25 30 750 100

Примечание: КК- клеточная культура

Таблица 2.

Адгезивная активность P.aeriginosa в присутствии специфического синегнойного бактериофага

Показатели процесса адгезии P.aeriginosa ИА ПК% МН % адгезии от контроля опыт: КК + бактерий + бактериофаг 2 7 14 2,3 контроль: КК+ бактерий 10 30 300 100

Таблица 3.

Адгезивная активность A.baumannii в присутствии специфического бактериофага «Дифаг»

Показатели процесса адгезии A.baumannii ИА ПК% МН % адгезии от контроля опыт: КК + бактерий +бактериофаг 5 5 25 5,3 контроль: КК+ бактерий 16 30 480 100

Как видно из данных таблиц, процент адгезии тест-штаммов достоверно снизился относительно контроля соответственно: S.aureus на 98,7%, P.aeriginosa на 97,7%, A.baumannii на 94,7%.

Снижение адгезивной активности бактерий происходило за счет бактериолитического эффекта бактериофага. Это подтверждали результатами проведенного дополнительного теста.

Производили высев инокулятов из пробирок на чашки Петри с МПА (мясо-пептонный агар) до начала инкубации и после 1 часа термостатирования при t=37 ± 1°С (таблица 4). Результаты высева инокулятов из соответствующих контрольных и опытных пробирок.

Таблица 4.

Присутствие тест-штамма микроорганизма в МПБ

(в контроле и в опыте)

Наличие микроорганизмов в МПБ* (КОЕ/мл) S.aureus P.aeriginosa A.baumannii контроль опыт контроль опыт контроль опыт Инкубация микроорганизма без бактериофага (контроль) 5^.10⁸ 4^.10⁸ 4^.10⁸ 3^.10⁸ 3^.10⁸ 2^.10⁸ Инкубация микроорганизма с бактериофагом (опыт) 0 0 0 0 0 0

* Учёт результата по высеву на мясо-пептонный агар.

Представленные в таблице данные свидетельствуют об отсутствии жизнеспособных клеток микроорганизмов как в контрольной, так и в опытной пробирках после 1 часа инкубации. Отсутствие роста микрофлоры на плотной питательной среде в контроле связано со 100% адгезией тест-штаммов к культуре клеток фибробластов в пробирках. В то же время отсутствие роста тест-культур на МПА после 1 часа инкубации в опыте свидетельствует о гибели тест-штаммов за счет бактериолитического действия бактериофага в связи с отсутствием адгезированных клеток микроорганизмов к культуре клеток фибробластов в пробирках.

Изобретение относится к области медицины, микробиологии, биологии. Предложен способ оценки специфической активности бактериофагов в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой результатов по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток, предусматривающий осуществление в течение 1 часа совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим бактериофагом в объеме 0,2 мл. После чего проводят оценку результата по сравнению с контролем без бактериофага. Изобретение обеспечивает сокращение времени проведения реакции. 4 табл., 1 пр.

Способ оценки специфической активности бактериофагов в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой результатов по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток, отличающийся тем, что в течение 1 часа осуществляют совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим бактериофагом в объеме 0,2 мл, после чего проводят оценку результата по сравнению с контролем без бактериофага.