ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, СОДЕРЖАЩИЕ ГИДРОЛИЗАТЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ Российский патент 2024 года по МПК C12N5/02 C12N5/07 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к питательным компонентам, подходящим для клеточной культуры эукариотических клеток. Эти питательные компоненты могут быть получены из гидролизатов растительных белков. Изобретение также относится к питательным средам, содержащим эти питательные компоненты. Питательные среды по изобретению могут быть получены путем замены компонентов сыворотки, которые являются обычными в таких средах, по меньшей мере частично, питательными компонентами по изобретению. Питательные компоненты и питательные среды по изобретению особенно подходят для использования в пищевой промышленности, например, в производстве культивированного мяса.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ранее были предприняты попытки использования растительного материала в качестве компонентов сред для культивирования клеток.

В WO 98/15614 A1 описаны препараты сред для культивирования клеток, предназначенные для культивирования животных клеток in vitro. Эти препараты сред содержат по меньшей мере один пептид растительного происхождения и/или по меньшей мере один липид растительного происхождения, и/или по меньшей мере одну жирную кислоту растительного происхождения. Рис, соя, картофель и кукуруза названы подходящими источниками белков, пептидов, липидов и/или жирных кислот. Пшеница специально исключена в качестве источника растительных белков. Растительные пептиды, используемые в препаратах, описанных в WO 98/15614 A1, могут быть получены путем расщепления растительных экстрактов ферментами, такими как трипсин или химотрипсин. Растительные пептиды добавляют в минимальную питательную среду в концентрации примерно 10-1000 мг/л.

В WO 03/045995 А2 описано экономичное производство рекомбинантных гликопротеинов, таких как эритропоэтин человека, с использованием бессывороточной культуральной среды. Культуральная среда содержит пептон растительного происхождения. В примерах, приведенных в WO 03/045995 A2, продемонстрированы бессывороточная адаптационная среда и бессывороточная среда для продуцирования. Каждая из этих двух сред содержит 0,25% соевого пептона.

В US 9714411 B2 описана среда для культивирования клеток, не содержащая животных белков, которая содержит полиамины и гидролизат растительного и/или дрожжевого белка. Общая концентрация гидролизата растительного и/или дрожжевого белка в среде для культивирования клеток составляет от примерно 0,05% до примерно 5% (мас/об). Гидролизат растительного белка может быть выбран из гидролизата злаков и/или гидролизата сои. В US 9714411 B2 термин «гидролизат» определен как относящийся к продукту любого ферментативного расщепления растительного или дрожжевого экстракта.

В JP2013-247927 A раскрыто, что экстракт рисовых отрубей оказывает стимулирующее действие на рост клеток при использовании в среде для культивирования клеток. Экстракт рисовых отрубей предпочтительно содержит 50 масс.% или более белка. Экстракт рисовых отрубей может представлять собой фракционированный продукт с молекулярной массой, предпочтительно находящейся в диапазоне от 3 кДа до 10 кДа. В примерах, приведенных в JP2013-247927 А, показано, что экстракт рисовых отрубей с содержанием белка 55% улучшал пролиферацию клеток СНО при использовании в концентрациях 0,1 или 0,3 г/л, тогда как цитотоксичность наблюдалась при концентрации 1 г/л.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ, ЛЕЖАЩИЕ В ОСНОВЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время питательные среды для культивирования клеток представляют собой смесь из примерно 20-60 высококачественных и чистых ингредиентов. Большое количество и высокая чистота ингредиентов делает такие питательные среды очень дорогими.

При использовании питательных сред в пищевой промышленности, особенно в производстве культивированного мяса, желательно использовать менее дорогие ингредиенты. По этическим соображениям и по соображениям безопасности также желательно избегать ингредиентов животного происхождения.

Ранее гидролизаты растительного происхождения использовали в качестве добавок к средам для культивирования клеток. Однако в предшествующем уровне техники лишь небольшие количества растительных экстрактов использовали в качестве дополнения к средам для культивирования клеток; например, только до 1000 мг/л (= 1 г/л) в WO 98/15614 A1; примерно 0,25% соевого пептона (= 2,5 г/л) в WO 03/045995 A2; от 0,1 до 0,3 г/л богатого белком экстракта рисовых отрубей использовали в JP2013-247927. Кроме того, растительные экстракты, используемые ранее, были получены из выделенных растительных белков или из богатого белком растительного материала, который можно отнести к материалам основного пищевого сырья.

Авторы настоящего изобретения впервые показали, что компоненты питательных сред могут быть получены с использованием гидролизатов растительных белков, которые были получены из материала вторичного пищевого сырья, то есть материала, имеющего более низкую экономическую ценность, чем материал основного пищевого сырья.

Новая композиция, содержащая растительные гидролизаты, полученные из материала вторичного пищевого сырья, намного дешевле, чем ингредиенты среды предшествующего уровня техники. Эти новые композиции могут быть использованы в качестве компонентов среды и поддерживать рост эукариотических клеток, и даже могут быть использованы в производстве культивированного мяса. Кроме того, компоненты и композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для культивирования клеток в промышленных масштабах.

Это резюме не обязательно описывает все достигнутые преимущества и все проблемы, решенные с помощью настоящего изобретения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей:

(i) первый растительный гидролизат, полученный из материала вторичного пищевого сырья путем кислотного гидролиза, где указанный материал вторичного пищевого сырья имеет содержание белка в диапазоне от примерно 4% до примерно 35% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 1% до примерно 50% (по массе от массы сухого вещества); и

(ii) готовую пищевую смесь, содержащую один или более минералов, один или более витаминов, одну или более аминокислот и/или одну или более солей;

где указанная композиция не содержит животных белков.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по первому аспекту в производстве культивированного мяса.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения растительного гидролизата, получаемого из материала вторичного пищевого сырья, включающему этапы:

(a) получения растительного материала, получаемого из вторичного пищевого сырья, где указанный растительный материал, получаемый из вторичного пищевого сырья, имеет содержание белка в диапазоне от примерно 4% до примерно 35% (по массе от массы сухого вещества) и имеет содержание клетчатки в диапазоне от примерно 1% до примерно 50% (по массе от массы сухого вещества);

(b) добавления кислоты к растительному материалу, с получением смеси кислоты и материала;

(c) инкубации смеси этапа (b) при температуре в диапазоне от 60°C до 100°C в течение периода времени по меньшей мере 12 часов, с получением кислотного гидролизата;

(d) добавления щелочного раствора к кислотному гидролизату этапа (c) в количестве, достаточном для нейтрализации кислотного гидролизата;

(e) центрифугирования нейтрализованного кислотного гидролизата этапа (d) для осаждения нерастворимого материала;

(f) извлечения супернатанта после центрифугирования на этапе (e); и

(g) фильтрования супернатанта, извлеченного на этапе (f), через стерильный фильтр или сочетание стерильных фильтров, с получением растительного гидролизата.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к растительному гидролизату, получаемому способом по третьему аспекту.

В пятом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции по первому аспекту, включающему этап(ы):

- смешивания растительного гидролизата, полученного из материала вторичного пищевого сырья путем кислотного гидролиза, где указанный материал вторичного пищевого сырья имеет содержание белка в диапазоне от примерно 4% до примерно 35% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 1% до примерно 50% (по массе от массы сухого вещества), с готовой пищевой смесью и, необязательно, с растительным гидролизатом, полученным из материала основного пищевого сырья путем кислотного гидролиза или ферментативной обработки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Прежде чем настоящее изобретение будет подробно описано ниже, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена исключительно для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если нет иных указаний, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют те значения, которые им обычно придают специалисты в данной области.

Используемый в настоящем документе термин «материал основного пищевого сырья» относится к растительному материалу, пригодному для потребления человеком. Этот материал характеризуется высоким содержанием белка (по меньшей мере 30% (по массе от массы сухого вещества), но обычно по меньшей мере 50% (по массе от массы сухого вещества)), и низким содержанием клетчатки (5% или меньше (по массе от массы сухого вещества), но обычно 1% или меньше (по массе от массы сухого вещества)). Примеры материала основного пищевого сырья включают, без ограничения, богатый белком материал, полученный из сои, фасоли, пшеницы (например, пшеничная клейковина), риса, гороха, картофеля или хлопкового семени.

Используемый в настоящем документе термин «материал вторичного пищевого сырья» относится к растительному материалу, который обычно не используется для потребления человеком. Материал вторичного пищевого сырья в основном используют в качестве корма для животных, в качестве удобрения или просто сжигают. В сравнении с материалом основного пищевого сырья материал вторичного пищевого сырья имеет более низкое содержание белка (от 4% до 35%, и обычно от 10% до 30% (по массе от массы сухого вещества)) и более высокое содержание клетчатки (от 1% до 50% и обычно от 10% до 20% (по массе от массы сухого вещества)). Примеры материала вторичного пищевого сырья включают, без ограничения, рисовые отруби, обезжиренные рисовые отруби, пшеничные отруби, ржаные отруби, кукурузные отруби, полбяные отруби или отходы пивоварения.

В контексте настоящего изобретения термин «фактор роста» относится к белку или пептиду, который стимулирует пролиферацию эукариотических клеток в клеточной культуре. Примеры факторов роста, полезных по настоящему изобретению, включают, без ограничения, инсулин и инсулиноподобные факторы роста (IGF).

Используемый в настоящем документе термин «примерно» относится к числовым значениям в диапазоне от 5% ниже указанного числового значения до 5% выше указанного числового значения. Например, содержание белка «примерно 10% (по массе от массы сухого вещества)» включает содержание белка в диапазоне от 9,5% (по массе от массы сухого вещества) до примерно 10,5% (по массе от массы сухого вещества). В качестве дополнительного примера температуру «примерно 80°С» следует понимать как диапазон температур от 76°С до 84°С.

Варианты осуществления изобретения

Далее следует дополнительное описание настоящего изобретения. В следующих далее абзацах различные аспекты изобретения описаны более подробно. Каждый аспект, определенный таким образом, может быть объединен с любым другим аспектом или аспектами, если явно не указано иное. В частности, любой признак, указанный как предпочтительный или преимущественный, может быть объединен с любым другим признаком или признаками, указанными как предпочтительные или преимущественные.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей:

(i) первый растительный гидролизат, полученный из материала вторичного пищевого сырья путем кислотного гидролиза, где указанный материал вторичного пищевого сырья имеет содержание белка в диапазоне от примерно 4% до примерно 35% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 1% до примерно 50% (по массе от массы сухого вещества); и

(ii) готовую пищевую смесь, содержащую один или более минералов, один или более витаминов, одну или более аминокислот и/или одну или более солей;

где указанная композиция не содержит животных белков.

В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту материал вторичного пищевого сырья имеет содержание белка в диапазоне от примерно 5% до примерно 34%; предпочтительно от примерно 6% до примерно 33%, предпочтительно от примерно 7% до примерно 32%, предпочтительно от примерно 8% до примерно 31%, предпочтительно от примерно 9% до примерно 30%, предпочтительно от примерно 10% до примерно 29%, предпочтительно от примерно 11% до примерно 28%, предпочтительно от примерно 12% до примерно 27%, предпочтительно от примерно 13% до примерно 26%, предпочтительно от примерно 14% до примерно 25% и наиболее предпочтительно от примерно 15% до примерно 25% (по массе от массы сухого вещества).

В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту материал вторичного пищевого сырья имеет содержание клетчатки в диапазоне от примерно 2% до примерно 45%, предпочтительно от примерно 3% до примерно 40%, предпочтительно от примерно 4% до примерно 35%, предпочтительно от примерно 5% до примерно 30% и наиболее предпочтительно от примерно 6% до примерно 25% (по массе от массы сухого вещества).

В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту материал вторичного пищевого сырья представляет собой рисовые отруби, пшеничные отруби, ржаные отруби, кукурузные отруби, полбяные отруби или отходы пивоварения, или получен из них.

В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту материал вторичного пищевого сырья представляет собой (или получен из)

- рисовые отруби, имеющие содержание белка в диапазоне от примерно 4% до примерно 20% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 2% до примерно 50% (по массе от массы сухого вещества), или

- пшеничные отруби, имеющие содержание белка в диапазоне от примерно 12% до примерно 24% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 5% до примерно 15% (по массе от массы сухого вещества); или

- ржаные отруби, имеющие содержание белка в диапазоне от примерно 12% до примерно 20% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 4% до примерно 30% (по массе от массы сухого вещества); или

- кукурузные отруби, имеющие содержание белка в диапазоне от примерно 5% до примерно 20% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 4% до примерно 25% (по массе от массы сухого вещества); или

- полбяные отруби, имеющие содержание белка в диапазоне от примерно 12% до примерно 24% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 5% до примерно 16% (по массе от массы сухого вещества); или

- отходы пивоварения, имеющие содержание белка в диапазоне от примерно 16% до примерно 35% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 10% до примерно 25% (по массе от массы сухого вещества).

В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту первый растительный гидролизат присутствует в композиции в диапазоне концентраций от 0,1% до 50% (по массе).

В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту

- один или более минералов в готовой пищевой смеси выбраны из группы, состоящей из Mg²⁺, Ca²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ и Mn²⁺;

- один или более витаминов в готовой пищевой смеси выбраны из группы, состоящей из аскорбиновой кислоты, биотина, холина, D-кальция пантотената, фолиевой кислоты, ниацинамида, пиридоксина, пиридоксаля, рибофлавина, тиамина, витамина B12 и i-инозитола;

- одна или более аминокислот в готовой пищевой смеси выбраны из группы, состоящей из глицина, L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеина, L-цистина, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, L-гистидина, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина и L-валина; и/или

- одна или более солей в готовой пищевой смеси выбраны из группы, состоящей из NaCl, KCl, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄ и NaHCO₃.

В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту пищевая смесь присутствует в композиции в диапазоне концентраций от 10% до 99,9% (по массе).

В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту композиция дополнительно содержит:

(iii) второй растительный гидролизат, полученный из материала основного пищевого сырья путем кислотного гидролиза или ферментативной обработки, где указанный материал основного пищевого сырья имеет содержание белка по меньшей мере 30% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки 5% (по массе от массы сухого вещества) или менее.

В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту материал основного пищевого сырья имеет содержание белка по меньшей мере 32%, предпочтительно по меньшей мере 34%, предпочтительно по меньшей мере 36%, предпочтительно по меньшей мере 38%, предпочтительно по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 42%, предпочтительно по меньшей мере 44%, предпочтительно по меньшей мере 46%, предпочтительно по меньшей мере 48% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 50% (по массе от массы сухого вещества).

В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту материал основного пищевого сырья имеет содержание клетчатки 4% (по массе от массы сухого вещества) или менее, предпочтительно 3% (по массе от массы сухого вещества) или менее, предпочтительно 2% (по массе от массы сухого вещества) или менее и наиболее предпочтительно 1% (по массе от массы сухого вещества) или менее.

В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту второй растительный гидролизат, полученный из материала основного пищевого сырья, был получен из соевых бобов, фасоли, пшеницы, риса, гороха, картофеля или хлопкового семени.

В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту второй растительный гидролизат, полученный из основного пищевого сырья, присутствует в диапазоне концентраций от 0,1% до 50% (по массе).

В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту второй растительный гидролизат, полученный из основного пищевого сырья, был получен путем применения способа по третьему аспекту. Это означает, что получают растительный материал, получаемый из основного пищевого сырья, описанного выше, и затем выполняют этапы (b) - (g) способа по третьему аспекту.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композицию по первому аспекту используют в качестве замены среды для культивирования клеток. Может быть получен водный раствор композиции по первому аспекту, с получением тем самым растительной среды. Эту растительную среду можно использовать для частичной замены стандартной среды для культивирования клеток. Например, от примерно 100 мл до примерно 500 мл (предпочтительно от примерно 150 мл до примерно 450 мл, предпочтительно от примерно 200 мл до примерно 400 мл, более предпочтительно от примерно 250 мл до примерно 350 мл, даже более предпочтительно примерно 300 мл) отбирают из 1 л стандартной среды для культивирования клеток и тот же объем растительной среды, что и объем, который был удален, добавляют к оставшемуся объему стандартной среды для культивирования клеток в качестве замены. Например, 300 мл отбирают из 1 л стандартной среды для культивирования клеток и 300 мл растительной среды добавляют к оставшимся 700 мл в качестве замены.

В других вариантах осуществления изобретения композицию по первому аспекту используют в качестве исходного материала для приготовления среды для культивирования клеток. Затем могут быть добавлены дополнительные компоненты (соли, буфер, источники энергии (например, глюкоза), микроэлементы, незаменимые аминокислоты, факторы роста). Осмоляльность и рН могут быть отрегулированы. Специалисту в данной области хорошо известно, какие дополнительные компоненты, какое значение pH и какая осмоляльность будут подходящими для стимулирования роста эукариотических клеток.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по первому аспекту в производстве культивированного мяса.

Второй аспект может быть альтернативно сформулирован следующим образом:

Способ производства культивированного мяса, включающий этапы:

(a) растворения композиции по первому аспекту в стерильном водном растворителе, с получением раствора растительного гидролизата;

(b) добавления солей, буфера, источников энергии (например, глюкозы), микроэлементов, незаменимых аминокислот и/или факторов роста к раствору этапа (a), с получением ростовой среды;

(c) инокуляции ростовой среды этапа (b) соответствующими клетками; и

(d) культивирования инокулированной ростовой среды этапа (c) при соответствующей температуре в течение соответствующего периода времени, с получением культивированного мяса.

В предпочтительном варианте осуществления по второму аспекту стерильный водный растворитель выбран из группы, состоящей из воды, фосфатного буфера и раствора хлорида натрия.

В предпочтительном варианте осуществления по второму аспекту соответствующие клетки выбраны из группы, состоящей из миосателлитных клеток, мезенхимальных стромальных клеток, фибробластных клеток, мышечных клеток, стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК). В еще одном предпочтительном варианте осуществления по второму аспекту соответствующими клетками являются клетки крупного рогатого скота, свиные клетки или куриные клетки.

В вариантах осуществления, в которых стволовые клетки представляют собой человеческие эмбриональные стволовые клетки, предпочтительно, чтобы эти человеческие эмбриональные стволовые клетки были получены способом, не требующим разрушения человеческого эмбриона.

Специалисту в области производства культивированного мяса хорошо известно, какие температурные диапазоны и какие периоды времени необходимы для получения культивированного мяса, с учетом типа клеток и количества клеток, используемых для инокуляции.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения растительного гидролизата, получаемого из вторичного пищевого сырья, включающему этапы:

(a) получения растительного материала, получаемого из вторичного пищевого сырья, где указанный растительный материал, получаемый из вторичного пищевого сырья, имеет содержание белка в диапазоне от примерно 4% до примерно 35% (по массе от массы сухого вещества) и имеет содержание клетчатки в диапазоне от примерно 1% до примерно 50% (по массе от массы сухого вещества);

(b) добавления кислоты к растительному материалу, с получением смеси кислоты и материала;

(c) инкубации смеси этапа (b) при температуре в диапазоне от 60°C до 100°C в течение периода времени по меньшей мере 12 часов, с получением кислотного гидролизата;

(d) добавления щелочного раствора к кислотному гидролизату этапа (c) в количестве, достаточном для нейтрализации кислотного гидролизата;

(e) центрифугирования нейтрализованного кислотного гидролизата этапа (d) для осаждения нерастворимого материала;

(f) извлечения супернатанта после центрифугирования на этапе (e); и

(g) фильтрования супернатанта, извлеченного на этапе (f), через стерильный фильтр или сочетание стерильных фильтров, с получением растительного гидролизата.

В предпочтительном варианте осуществления по третьему аспекту растительный материал, полученный из вторичного пищевого сырья, имеет содержание белка в диапазоне от примерно 5% до примерно 34%; предпочтительно от примерно 6% до примерно 33%, предпочтительно от примерно 7% до примерно 32%, предпочтительно от примерно 8% до примерно 31%, предпочтительно от примерно 9% до примерно 30%, предпочтительно от примерно 10% до примерно 29%, предпочтительно от примерно 11% до примерно 28%, предпочтительно от примерно 12% до примерно 27%, предпочтительно от примерно 13% до примерно 26%, предпочтительно от примерно 14% до примерно 25% и наиболее предпочтительно от примерно 15% до примерно 25% (по массе от массы сухого вещества).

В предпочтительном варианте осуществления по третьему аспекту растительный материал, полученный из вторичного пищевого сырья, имеет содержание клетчатки в диапазоне от примерно 2% до примерно 45%, предпочтительно от примерно 3% до примерно 40%, предпочтительно от примерно 4% до примерно 35%, предпочтительно от примерно 5% до примерно 30% и наиболее предпочтительно от примерно 6% до примерно 25% (по массе от массы сухого вещества).

В предпочтительном варианте осуществления по третьему аспекту растительный материал, полученный из вторичного пищевого сырья, представляет собой рисовые отруби, пшеничные отруби, ржаные отруби, кукурузные отруби, полбяные отруби или отходы пивоварения, или получен из них.

В предпочтительном варианте осуществления по третьему аспекту растительный материал, полученный из вторичного пищевого сырья, представляет собой (или получен из)

- рисовые отруби, имеющие содержание белка в диапазоне от примерно 4% до примерно 20% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 2% до примерно 50% (по массе от массы сухого вещества) или

- пшеничные отруби, имеющие содержание белка в диапазоне от примерно 12% до примерно 24% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 5% до примерно 15% (по массе от массы сухого вещества); или

- ржаные отруби, имеющие содержание белка в диапазоне от примерно 12% до примерно 20% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 4% до примерно 30% (по массе от массы сухого вещества); или

- кукурузные отруби, имеющие содержание белка в диапазоне от примерно 5% до примерно 20% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 4% до примерно 25% (по массе от массы сухого вещества); или

- полбяные отруби, имеющие содержание белка в диапазоне от примерно 12% до примерно 24% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 5% до примерно 16% (по массе от массы сухого вещества); или

- отходы пивоварения, имеющие содержание белка в диапазоне от примерно 16% до примерно 35% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 10% до примерно 25% (по массе от массы сухого вещества).

В предпочтительном варианте осуществления по третьему аспекту кислота, добавляемая на этапе (b), представляет собой концентрированный раствор HCl. Предпочтительно, концентрация HCl находится в диапазоне от 0,1 M до 2 M, более предпочтительно в диапазоне от 0,2 M до 1,5 M, более предпочтительно в диапазоне от 0,3 M до 1 M, даже более предпочтительно в диапазоне от 0,4 M до примерно 0,75 M и наиболее предпочтительно примерно 0,5 M.

В предпочтительном варианте осуществления по третьему аспекту инкубацию на этапе (c) проводят при температуре в диапазоне от 61°C до 99°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 62°C до 98°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 63°C до 97°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 64°C до 96°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 65°C до 95°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 66°C до 94°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 67°C до 93°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 68°C до 92°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 69°C до 91°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 70°C до 90°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 71°C до 89°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 72°C до 88°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 73°C до 87°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 74°C до 86°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 75°C до 85°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 76°C до 84°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 77°C до 83°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 78°C до 82°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 79°C до 81°C и наиболее предпочтительно примерно 80°C.

В предпочтительном варианте осуществления по третьему аспекту этап (c) проводят в течение периода времени от 12 часов до 48 часов, предпочтительно от 15 часов до 36 часов, более предпочтительно от 18 часов до 30 часов и наиболее предпочтительно в течение примерно 24 часов.

В предпочтительном варианте осуществления по третьему аспекту этап (e) проводят в течение периода времени от примерно 5 мин до примерно 20 мин при примерно 4000-6000 x g, предпочтительно в течение периода времени от примерно 10 мин до 15 мин при примерно 4500-5500 x g; наиболее предпочтительно в течение периода времени примерно 10 мин при примерно 5250 x g.

В предпочтительном варианте осуществления по третьему аспекту стерильный фильтр представляет собой фильтр с размером пор 50 мкм или менее, предпочтительно 20 мкм или менее, более предпочтительно 10 мкм или менее и даже более предпочтительно 0,2 мкм или менее.

В предпочтительных вариантах осуществления по третьему аспекту используют несколько этапов фильтрования со все более мелкими размерами пор; например, первый этап фильтрования с фильтром, имеющим размер пор 50 мкм или менее, второй этап фильтрования с фильтром, имеющим размер пор 20 мкм или менее, третий этап фильтрования с фильтром, имеющим размер пор 10 мкм или менее, и четвертый этап фильтрования с фильтром, имеющим размер пор 0,2 мкм или менее.

Как указано выше, способ по третьему аспекту, и его предпочтительные варианты осуществления, также подходит для получения растительного гидролизата, получаемого из основного пищевого сырья, с использованием растительного материала, полученного из основного пищевого сырья, в качестве исходного материала.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к растительному гидролизату, получаемому способом по третьему аспекту.

В предпочтительном варианте осуществления по четвертому аспекту растительный гидролизат был получен способом по третьему аспекту.

В пятом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции по первому аспекту, включающему этап(ы):

- смешивания растительного гидролизата, полученного из материала вторичного пищевого сырья путем кислотного гидролиза, где указанный материал вторичного пищевого сырья имеет содержание белка в диапазоне от примерно 4% до примерно 35% (по массе от массы сухого вещества) и содержание клетчатки в диапазоне от примерно 1% до примерно 50% (по массе от массы сухого вещества), с готовой пищевой смесью и, необязательно, с растительным гидролизатом, полученным из материала основного пищевого сырья путем кислотного гидролиза или ферментативной обработки.

В предпочтительном варианте осуществления по пятому аспекту растительный гидролизат, полученный из вторичного пищевого сырья, может быть получен способом по третьему аспекту. В следующем варианте осуществления по пятому аспекту растительный гидролизат, полученный из вторичного пищевого сырья, был получен способом по третьему аспекту.

В предпочтительных вариантах осуществления по пятому аспекту материал вторичного пищевого сырья является таким, как описано для вариантов осуществления по первому аспекту.

В предпочтительном варианте осуществления по пятому аспекту готовая пищевая смесь является такой, как описано для вариантов осуществления по первому аспекту изобретения.

В предпочтительных вариантах осуществления по пятому аспекту материал основного пищевого сырья является таким, как описано для вариантов осуществления по первому аспекту.

Следующие далее фигуры и примеры являются лишь иллюстрирующими настоящее изобретение и никоим образом не должны быть истолкованы как ограничивающие объем изобретения, изложенный в прилагаемой формуле изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 показаны результаты эксперимента с культурой клеток CHO. Клетки СНО выращивали в эталонной среде или в средах, в которых компоненты эталонной среды были заменены гидролизатом обезжиренных рисовых отрубей (ОРО) (содержание белка 20%). Были протестированы две разные партии гидролизата ОРО. В каждый день культивирования для каждого эксперимента регистрировали плотность жизнеспособных клеток (в 10⁶ клеток/мл) и жизнеспособность клеток.

ПРИМЕРЫ

1. Кислотный гидролиз растительного материала

Растительный материал (либо из основного пищевого сырья, либо из вторичного пищевого сырья) гидролизовали с использованием следующего протокола:

- 5 г растительного материала добавляли в пустую 100-мл колбу.

- 50 мл 0,5 M HCl добавляли к растительному материалу.

- Смесь растительного материала и HCl перемешивали и инкубировали при 80°C в течение примерно 24 часов.

- Разные растворы NaOH медленно и последовательно добавляли до достижения рН 7,0: сначала добавляли 5 М раствор NaOH до достижения примерно рН 5; затем добавляли 1 M раствор NaOH до достижения примерно рН 6; и наконец, добавляли 0,1 M раствор NaOH до достижения примерно рН 7,0.

- Нейтрализованную смесь переносили в новую 100-мл колбу.

- Добавляли дистиллированную воду до общего объема 100 мл.

- Колбу закрывали крышкой и встряхивали. Температуру доводили до 20°C.

- Смесь переносили в пробирки для центрифугирования (2 пробирки объемом 50 мл каждая). Пробирки центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин в центрифуге Allegra X-15R (Beckman Coulter); при 5250 x g.

- Супернатант собирали и фильтровали через тефлоновый фильтр с размером пор 10 мкм, получая стерильный раствор растительного гидролизата.

Растительные гидролизаты получали из следующих исходных материалов (в скобках указано содержание белка): ржаные отруби (17,1%), пшеничные отруби (14,3%), конские бобы (66%), полбяные отруби (19,7%), легрия (21,2%), стабилизированные рисовые отруби (15,1%), обезжиренные рисовые отруби (19,0%).

Вышеописанный протокол также выполняли в более крупном масштабе, в котором все материалы использовали в 50-кратном количестве:

- 250 г растительного материала добавляли в пустую 5-л колбу.

- 2,5 л 0,5 M HCl добавляли к растительному материалу.

- Смесь растительного материала и HCl перемешивали и инкубировали при 80°C в течение примерно 24 часов.

- Разные растворы NaOH медленно и последовательно добавляли до достижения рН 7,0: сначала добавляли 5 М раствор NaOH до достижения примерно рН 5; затем добавляли 1 M раствор NaOH до достижения примерно рН 6; и наконец, добавляли 0,1 M раствор NaOH до достижения примерно рН 7,0.

- Нейтрализованную смесь переносили в новую 5-л колбу.

- Добавляли дистиллированную воду до общего объема 5 л.

- Колбу закрывали крышкой и встряхивали. Температуру доводили до 20°C.

- Смесь переносили в пробирки для центрифугирования (8 пробирок объемом 750 мл каждая). Пробирки центрифугировали в течение 10 мин при 5250 x g.

- Супернатант собирали и фильтровали через тефлоновый фильтр с размером пор 10 мкм, получая стерильный раствор растительного гидролизата.

2. Эксперименты с клеточными культурами

Материалы:

Клетки CHO-K1 Линия клеток яичника китайского хомяка, субклон K1 Эталонная среда Жидкая среда SBF, доступная от компании Xell AG (Bielefeld, Germany) по запросу под номером продукта 2052-0001

Эксперименты с клеточными культурами были проведены в рамках контракта компанией Xell AG в собственных ферментерах в Билефельде. Клетки СНО-К1 выращивали в эталонной среде или в среде, содержащей замену в виде гидролизата обезжиренных рисовых отрубей (ОРО) (содержание белка 20%). Гидролизаты обезжиренных рисовых отрубей готовили в соответствии с протоколом кислотного гидролиза, описанным выше в примере 1. Были протестированы две разные партии гидролизата ОРО.

Кривые роста для эталонной среды 1:3 и для двух экспериментов с двумя отдельными партиями гидролизата ОРО представлены на Фиг. 1. «Эталонная среда 1:3» означает замену 300 мл из 1 л эталонной среды дистиллированной водой. И ОРО, и ОРО1 имеют состав среды, в котором 300 мл среды из обезжиренных рисовых отрубей добавлены к 700 мл эталонной среды. Концентрацию глюкозы во всех вариантах сред доводили либо до 4,5 г/л (для ОРО и ОРО1), либо до 6,2 г/л (для эталона 1:3), в зависимости от концентрации глюкозы в используемых пищевых материалах. Добавляли глутамин до конечной концентрации 6 мМ. Клетки культивировали в 125-мл плоских встряхиваемых флаконах с рабочим объемом 50 мл (по кривым роста) в инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂.

Как видно из кривых роста, среды, содержащие замену в виде гидролизата ОРО, позволяют расти клеткам СНО. Ингибирующего действия и цитотоксичности не наблюдали.

Однако максимальная плотность клеток была ниже при использовании среды, содержащей заменитель в виде гидролизата рисовых отрубей (примерно 4×10⁶ клеток/мл для первой партии; примерно 3,5×10⁶ клеток/мл для второй партии) в сравнении с эталонной средой (5×10⁶ клеток/мл). Кроме того, максимальная плотность клеток была достигнута только при более длительном времени культивирования (на 7-й день для первой партии; на 8-й день для второй партии) в сравнении с эталонной средой (на 6-й день).

Таким образом, приведенные выше результаты служат доказательством того, что гидролизат рисовых отрубей (то есть из материала вторичного пищевого сырья) может быть использован в качестве добавки в средах для культивирования клеток и поддерживает рост эукариотических клеток.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения гидролизата растительных белков для использования в качестве компонентов среды, поддерживающей рост эукариотических клеток, включающий добавление концентрированного раствора HCl к растительному материалу, полученному из вторичного пищевого сырья - из рисовых, пшеничных, ржаных, кукурузных, полбяных отрубей или отходов пивоварения, с содержанием белка 4-35% и клетчатки 1-50%; инкубацию 15-36 ч при 70-90°C, нейтрализацию кислотного гидролизата, центрифугирование и извлечение супернатанта с дальнейшей фильтрацией через стерильный фильтр; гидролизат растительных белков, полученный заявленным способом; композиция, содержащая 0,1-50 масс.% полученного гидролизата и 10-99,9 масс.% смеси для культивирования клеток, и способ ее получения, включающий смешивание полученного гидролизата со смесью для культивирования клеток; способ производства культивированного мяса, включающий растворение полученной композиции в стерильном водном растворителе, добавление солей, буфера, источников энергии, микроэлементов, незаменимых аминокислот и/или факторов роста, инокуляцию миосателлитными, мезенхимальными, стромальными, мышечными, стволовыми, индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками или клетками фибробластов и культивирование. Изобретения обеспечивают расширение ассортимента питательных сред для поддержания роста эукариотических клеток с использованием вторичного пищевого сырья. 5 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

1. Способ получения гидролизата растительных белков, пригодного для использования в качестве компонентов среды, поддерживающей рост эукариотических клеток, указанный гидролизат растительных белков, получаемый из вторичного пищевого сырья, включает стадии:

(a) получения растительного материала, получаемого из вторичного пищевого сырья, где растительный материал, полученный из вторичного пищевого сырья, получен из рисовых отрубей, пшеничных отрубей, ржаных отрубей, кукурузных отрубей, полбяных отрубей или отходов пивоварения, где указанный растительный материал, получаемый из вторичного пищевого сырья, имеет содержание белка в диапазоне от 4% до 35% и имеет содержание клетчатки в диапазоне от 1% до 50%; где проценты, указанные для содержания белка и клетчатки, рассчитываются как масса белка, деленная на массу сухого вещества, или масса клетчатки, деленная на массу сухого вещества, соответственно;

(b) добавления концентрированного раствора HCl к растительному материалу, где концентрация HCl находится в диапазоне от 0,2 М до 1 М с получением смеси кислоты и материала;

(c) инкубации смеси со стадии (b) при температуре в диапазоне от 70°C до 90°C в течение периода времени от 15 ч до 36 ч с получением кислотного гидролизата;

(d) добавления щелочного раствора к кислотному гидролизату стадии (c) в количестве, достаточном для нейтрализации кислотного гидролизата;

(e) центрифугирования нейтрализованного кислотного гидролизата стадии (d) для осаждения нерастворимого материала;

(f) извлечения супернатанта после центрифугирования на стадии (e); и

(g) подвергания супернатанта, извлеченного на стадии (f), фильтрации через стерильный фильтр или сочетание стерильных фильтров с получением стерильного гидролизата растительных белков.

2. Способ по п. 1, где концентрация HCl находится в диапазоне от 0,3 M до 0,75 M.

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, где стадию (c) проводят

- при температуре от 75°C до 85°C, предпочтительно 80°C и/или

- в течение периода времени от 18 ч до 30 ч, наиболее предпочтительно в течение 24 ч.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где стадию (e) проводят в течение периода времени от 5 до 20 мин при 4000-6000 × g.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где стерильный фильтр представляет собой фильтр с размером пор 50 мкм, предпочтительно 20 мкм, более предпочтительно 10 мкм или еще более предпочтительно 0,2 мкм.

6. Гидролизат растительных белков, полученный способом по любому из пп. 1-5, где указанный гидролизат растительных белков пригоден для использования в качестве компонентов среды, поддерживающей рост эукариотических клеток.

7. Композиция, пригодная для использования в качестве компонента среды, поддерживающей рост эукариотических клеток, содержащая:

(i) от 0,1 масс.% до 50 масс.% гидролизата растительных белков, полученного способом по любому из пп. 1-5; и

(ii) от 10 масс.% до 99,9 масс.% смеси для культивирования клеток, содержащей один или более минералов, один или более витаминов, одну или более аминокислот и/или одну или более солей;

где указанная композиция не содержит животных белков.

8. Композиция по п. 7, где

- один или более минералов в смеси выбраны из группы, состоящей из Mg²⁺, Ca²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ и Mn²⁺;

- один или более витаминов в смеси выбраны из группы, состоящей из аскорбиновой кислоты, биотина, холина, D-кальция пантотената, фолиевой кислоты, ниацинамида, пиридоксина, пиридоксаля, рибофлавина, тиамина, витамина B12 и i-инозитола;

- одна или более аминокислот в смеси выбраны из группы, состоящей из глицина, L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеина, L-цистина, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, L-гистидина, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина и L-валина; и/или

- одна или более солей в смеси выбраны из группы, состоящей из NaCl, KCl, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄ и NaHCO₃.

9. Способ производства культивированного мяса, включающий стадии:

(а) растворение композиции по любому из пп. 7, 8 в стерильном водном растворителе с получением раствора гидролизата растения;

(b) добавление солей, буфера, источников энергии (например, глюкозы), микроэлементов, незаменимых аминокислот и/или факторов роста к раствору, полученному на стадии (а), тем самым приготавливая питательную среду;

(с) инокуляцию питательной среды стадии (b) соответствующими клетками, причем соответствующие клетки выбирают из группы, состоящей из миосателлитных клеток, мезенхимальных стромальных клеток, клеток фибробластов, мышечных клеток, стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток; и

(d) культивирование инокулированной ростовой среды, полученной на стадии (с), при подходящей температуре в течение подходящего периода времени, тем самым получая культивированное мясо.

10. Способ получения композиции по любому из пп. 7 или 8, где указанная композиция пригодна для использования в качестве компонентов среды, поддерживающей рост эукариотических клеток, включающий стадии

- смешивания гидролизата растительных белков, полученного способом по любому из пп. 1-5, со смесью для культивирования клеток.